Aspergillus aflatoxigénicos: enfoque taxonómico actual*
Alfatoxigenic Aspergillus: current taxonomic focus
Andrea Alejandra Arrúa Alvarenga1, Ernesto Moreno Martínez2, Martha Yolanda Quezada Viay2, Josefina Moreno Lara2, Mario Ernesto Vázquez Badillo3 y Alberto Flores Olivas1§
1Departamento de Parasitología Agrícola y Semillas. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Calzada Antonio Narro Núm. 1923, Buenavista Saltillo, Coahuila. C. P. 25315. Tel. 01 844 110226. (afloooli@uaaan.mx), (aaarrua@gmail.com). §Autor para correspondencia: aflooli@uaaan.mx.
]]> 2Unidad de Investigación en Granos y Semillas, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Dr. Jorge Jiménez Cantú S/N, Colonia Atlamica, Cuautitlán Izcalli, Estado de México, Tel.: 01 55 58809316. (ernesto@unam.mx), (viayy@hotmail.com), (joslara2004@hotmail.com).3Departamento de Semillas, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Calzada Antonio Narro Núm. 1923, Buenavista, Saltillo, Coahuila. C. P. 25315. (mario59ernesto@hotmail.com).
* Recibido: diciembre de 2011
Aceptado: agosto de 2012
Resumen
Aspergillus es un género estudiado desde hace siglos debido a sus propiedades industriales, de deterioro y efectos en la salud. Su identificación a nivel de género es relativamente sencilla, pero a nivel de especies se complica debido a las similitudes existentes entre las mismas. Debido a esto, actualmente, los taxónomos recomiendan un enfoque polifásico que comprende no sólo características morfológicas, sino también bioquímicas y moleculares. El presente trabajo se realizó con el objetivo de presentar los aspectos básicos concernientes a la identificación polifásica de estas especies.
Palabras clave: Aspergillus, identificación, enfoque polifásico.
]]> Abstract
The genus Aspergillus has been studied for centuries due to its industrial and deterioration properties, and its effects on health. Its identification at a genus level is relatively simple, yet at a level of species it becomes more complicated, due to the similarities between both. Due to this, taxonomists currently recommend a polyphasic focus that includes, not only morphologic characteristics, but also biochemical and molecular characteristics. The aim of this investigation was to present the basic aspects concerning the polyphasic identification of these species.
Key words: Aspergillus, identification, polyphasic focus.
Debido a la presencia de patógenos con potencial micotoxígeno, ocurren año tras año, importantes pérdidas, directas e indirectas, de productos alimentarios, a nivel de campo, de poscosecha y de anaquel, con las consecuentes restricciones en exportación, destrucción de productos contaminados, muerte de animales y en casos extremos de seres humanos. Según la Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), las pérdidas mundiales de productos alimenticios debidas a micotoxinas son del orden de 1 000 millones de toneladas al año (AGNS, 2010). Dentro de las micotoxinas, se destacan las aflatoxinas (AF) por su toxicidad y potencial cancerígeno. Por estas razones el estudio de los hongos aflatoxígenos adquiere cada vez mayor importancia. Es imperioso adquirir herramientas para la correcta identificación de los mismos, dado el riesgo que su presencia implica.
Aspergillus y aflatoxinas
Aspergillus se encuentra ampliamente distribuído en la naturaleza, pudiéndose aislar de una extensa gama de sustratos; ha sido estudiado desde hace siglos debido a sus propiedades industriales, de deterioro, biotecnológicas y efectos negativos en la salud humana y animal. La identificación a nivel de género es sencilla mediante características morfológicas; sin embargo, a nivel de especies se complica. La taxonomía de Aspergillus, se fundamenta hasta el siglo pasado, en características fenotípicas. En la actualidad se recomienda el llamado enfoque polifásico, basado en la utilización de caracteres morfológicos en combinación con características bioquímicas y moleculares para dar perfiles de especies mucho más detallados (Klich y Samson, 2007). Aproximadamente 50 nuevas especies de Aspergillus fueron descritas a partir de 2000, basándose en características morfológicas y moleculares siendo muchas de ellas imposibles de diferenciar morfológicamente (Klich, 2009). Numerosas especies importantes de Aspergillus se hallan descritas en bases de datos como Mycobank.org o Index Fungorum. Las principales especies productoras de aflatoxinas son Aspergillus flavus, A.parasiticu y A. nomius, aunque se conocen otras. La aflatoxina B1 es la sustancia con potencial cancerígeno más elevado que existe en la naturaleza (Perrone et al., 2007), siendo A. flavus la especie más común asociada a su contaminación.
Diversidad de Aspergillus y producción de toxinas
]]> La diversidad genética dentro de poblaciones de A. flavus ha sido ampliamente estudiada en relación con su potencial de producción de aflatoxinas y su relación con las variantes morfológicas L (400μm o más) y S (menores a 400μm) denominadas así de acuerdo al tamaño de los esclerocios que producen (Perrone et al, 2007). En laboratorio, en medios de cultivo, los aislamientos de suelo de cepas tipo S, producen niveles más altos de aflatoxinas (Perrone et al., 2007). La síntesis de aflatoxinas y sus metabolitos precursores se asocia también a una mayor producción de conidios (Wilkinson et al., 2004).Estudios sobre la biodiversidad de las especies de Aspergillus toxigénas son útiles para aclarar molecular, bioquímica y ecológicamente las características de las diferentes especies en relación con su adaptación a diferentes condiciones ambientales y geográficas, así como su potencial de toxigenicidad (Samson et al., 2007). Cinco de los seis subgéneros de Aspergillus incluyen una o más especies que producen un teleomorfo, y muchos más que no lo hacen (Samson et al., 2007). Las relaciones teleomorfo - anamorfo de Aspergillus son complejas. La evidencia molecular hasta la fecha indica que todas estas están filogenéticamente relacionadas (Peterson, 2000). Sin embargo, los teleomorfos y anamorfos de Aspergillus son muy distintos entre sí, tanto en la morfología como en la fisiología (Samson et al., 2007). La presencia de un teleomorfo es un importante indicador de la fisiología, capacidad de descomposición y potencial para la producción de micotoxinas. En aquellas especies cuyos teleomorfos no se conocen, las mismas son llamadas por sus anamorfos (Pitt y Samson, 2007).
Identificación de los Aspergillus-enfoque polifásico
En 1965, Rapper y Fennell, publicaron el libro, "The genus Aspergillus", básico para la identificación de estos hongos durante la mayor parte del siglo pasado, fundamentado en el uso de características morfológicas en medios diferenciales a temperaturas establecidas. Dicha publicación, aceptaba 132 especies subdivididas en 18 grupos. Actualmente, se consideran más de 180 especies anamórficas aceptadas, que presentan teleomorfos en 9 géneros diferentes. Aspergillus se subdivide en 7 subgéneros que a su vez se dividen en grupos (Samson y Pitt, 2000).
La forma de encarar la taxonomía de estos hongos ha variado hasta el punto de que la sola morfología, tradicional, ni las herramientas moleculares, tan actuales, utilizadas de manera independiente son suficientes, es necesario combinarlas tomando también en cuenta la fisiología y bioquímica de cada una, para realizar perfiles detallados, sobre todo si se considera describir nuevas especies. A pesar de que los datos de secuencias de ADN son extremadamente útiles para el reconocimiento de límites de las especies, no existen criterios estrictos en cuanto a dónde trazar la línea entre las especies filogenéticas y de poblaciones que son potencialmente capaces de cruzarse (Geiser et al., 2007).
En el caso de Aspergillus, para identificar especies, actualmente, se recomienda examinar varias secuencias de genes (ITS, calmodulina, P-tubulina, actina) y posteriormente comparar los resultados obtenidos con secuencias almacenadas en bases de datos reconocidas. Sin embargo, los ITS con frecuencia muestran poca o ninguna variación entre especies estrechamente relacionadas. En cuanto a metabolitos producidos por estos hongos, se recomienda el análisis de 4-8 compuestos en lugar de una sola molécula. Lo más adecuado sería no utilizar micotoxinas como criterio de separación de especies, porque las mismas pueden o no ser producidas por estos hongos (Samson et al, 2007).
Características morfológicas utilizadas en la identificación de especies
Los criterios morfológicos utilizados para la clasificación de las especies del género Aspergillus y sus telomorfos, se basan en la utilización de medios de cultivo diferenciales y temperaturas de incubación que permitan el desarrollo de características útiles en su identificación (Rodríguez et al, 2007). Las principales características macro y microscópicas utilizadas en la clasificación a nivel de especie en estos hongos incluyen el diámetro de las colonias; coloración del anverso y reverso de las colonias; presencia de esclerocios, gotas de exudado y pigmento difusible; textura de las colonias, disposición de las métulas o fiálides sobre la vesícula; medidas de los estipes, vesículas, métulas y fiálides; ornamentación y color de las conidias, de las células de Hülle y de las ascosporas ( Rodríguez et al, 2007).
]]>Características bioquímicas utilizables en la identificación de especies
Los perfiles de metabolitos secundarios pueden ser estudiados por medio de cromatografía gaseosa (GC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), espectrometría de masas; las proteínas de interés pueden ser separadas por electroforesis de Gel 2D o electroforesis capilar. Como los perfiles de crecimiento y proteínas requieren infraestructura de baja tecnología estas características podrían ser muy útiles para determinar la identidad de un aislado (Frisvad et al., 2007). Hay información disponible en www.aspergillus.uk/metabolites/list que cita metabolitos secundarios producidos por especies potencialmente micotoxigénas y que podrían utilizarse en su identificación.
Criterios moleculares a ser tomados en cuenta en la identificación de especies de Aspergillus
Existen técnicas realmente prometedoras para la caracterización molecular de Aspergillus. Entre ellas se encuentran los polimorfismos de la longitud de microsatélites (MLP); las repeticiones cortas en tándem (STR) (De Valk et al, 2005); polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) (De Valk et al, 2007); los tipificados de secuencias de multilocus (MLST) (Bain et al, 2007) y la codificación de repeticiones de tándem (CTR) (Balajee et al, 2007). Se recomienda la selección del método de análisis de acuerdo a la razón exacta de la caracterización de las cepas y a los recursos técnicos disponibles (Frisvad et al, 2007). Para la identificación polifásica de los Aspergillus, a nivel de especie, pueden utilizarse además las regiones del DNA que se encuentran dentro del rDNA, específicamente ITS1 e ITS2, y las regiones variables del extremo 5' del gen 28S (región D1-D2) y los genes de la vía de biosíntesis de las AF han sido estudiados y secuenciados y los mismos también pueden utilizarse en procesos de identificación.
Dado el peligro que representan estos patógenos para la salud humana y las pérdidas económicas que las toxinas derivadas de los mismos pueden causar, es de suma importancia el conocimiento de las pautas marcadas para su correcta identificación. Actualmente, se recomienda un enfoque polifásico para la identificación y caracterización de especies de Aspergillus incluyendo características moleculares, morfológicas, ecológicas y datos fisiológicos, especialmente si se describen nuevas especies.
Literatura citada
Bain, J. M.; Tavanti, A.; Davidson, A. D.; Jacobsen, M. D.; Shaw, D.; Gow, N. A. and Odds, F. C. 2007. Multilocus sequence typing of the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. J. Clin. Microbiol. 45:1469-1477. [ Links ]
Balajee, S.A.; Tay, S. T.; Lasker, B.A.; Hurst, S. F. y Rooney, A. P. 2007. Characterization of a novel gene for strain typing reveals substructuring of Aspergillus fumigates across North America. Eukaryotic Cell. 6:1392-1399. [ Links ]
De Valk; H. A.; Meis, J. F. G. M.; De Pauw, B. E.; Donnelly, P. J. and Klaassen, C. H. W. 2007. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 45:1415-1419. [ Links ]
De Valk, H. A.; De Meis, J. F. G. M.; Curfs, I. M.; Muehlethaler, K.; Mouton, J. W. a Klaassen, C. H. W. 2005. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution ndfingerprinting of Aspergillusfumigatus isolates. J. Clin. Microbiol. 43:4112-4120. [ Links ]
Frisvad, J. C.; Larsen, T. O.; De Vries, R.; Meijer, M.; Houbraken, J.; Cabanes, F. G.; Ehrlich, K. and Samson, R. A. 2007. Secondary metabolite profiling, growth profiles and other tools for species recognition and important Aspergillus mycotoxins. Studies Mycol. 59:31-37. [ Links ]
Geiser, D. M.; Klich, M. A.; Frisvad, J. C.; Peterson, S. W.; Varga, J. and Samson, R. A. 2007. The current status of species recognition and identification in Aspergillus. Studies Mycol. 59:1-10. [ Links ]
Klich, M.A. and Samson, R. A. 2007. Aspergillus reference cultures. International Commission on Penicillium and Aspergillus (ICPA). Disponible en: http://www.aspergilluspenicillium.org/ASPREFINTRO.htm. [ Links ]
Klich, M. 2009. Health effects of Aspergillus in food and air. Toxicol ind health. 9(25):657-667. [ Links ]
Perrone, G.; Susca, A.; Cozzi, G.; Erlich, K.; Varga, J.; Frisvad, J. C.; Meijer, M.; Noonim, P.; Warapa, M. and Samson, R.A. 2007. Biodiversity of Aspergillus species in some important agricultural products. 2007. Studies Mycol. 59:53-66. [ Links ]
Peterson, S. W. 2000. Phylogenetic relationships in Aspergillus based on rDNA sequence analysis. In: Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification. (Samson RA, Pitt JI, (Eds.) Amsterdam (NL): Harwood Academic Publishers: 323-355. [ Links ]
Pitt, J. I. and Samson, R. A. 2007. Nomenclatural considerations in naming species of Aspergillus and its teleomorphs. Studies Mycol. 59:67-70. [ Links ]
Rodríguez, P.; Soares, C.; Kozakiewicz, Z.; Paterson, R.; Lima, N. and Venancio, A. 2007. Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins. Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. Méndez-Vilas (Eds.). 527-534 pp. [ Links ]
Rodríguez, P.; Venancio, A.; Kozakiewicz, Z. and Lima, N. 2007. A polyphasic approach to the identification of aflatoxigenic and non-aflatoxigenic strains of Aspergillus Section Flavi isolated from Portuguese almonds. Int. J. Food Microbiol. 129:187-193. [ Links ]
Samson, R.A.; Varga, J.; Witiak, S. M. and Geiser, D. M. 2007. The species concept in Aspergillus: recommendations of an international panel. Studies Mycol. 59:71-73. [ Links ]
Samson, R. and Pitt, J. 2000. Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification. CRC PRESS. 510 p. [ Links ]
Servicio de Calidad de los Alimentos y Normas Alimentarias (AGNS). Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO). 2010. Micotoxinas. Disponible en: http://www.fao.org/ag/agn/agns/chemicals_mycotoxins_es.asp. [ Links ]
Wilkinson, H.; Ramaswamy, A.; Sim, S. C. and Keller, N. P. 2004. Increased conidiation associated with progression along the sterigmatocystin biosynthetic pathway. Mycologia. 96:1190-1198. [ Links ]
]]>