El CaCl₂ en la vida florero de gerbera: pigmentos, fenoles, lignina y anatomía del escapo*

CaCl₂ in gerbera vase life: pigments, phenols, lignin and scape anatomy

Susana González-Aguilar¹ y Araceli Zavaleta-Mancera^2§

¹ Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma del Estado de México. Instituto Literario Núm. 1000 Toluca, C. P. 5000. Estado de México, México.

* Recibido: agosto de 2011
Aceptado: enero de 2012

Resumen

Gerbera jamesonii presenta una vida florero corta caracterizada por el doblado del tallo floral (escapo). Con el objetivo de alargar la vida florero de gerbera se probaron tres concentraciones de CaCl₂ (0.1, 0.5 y 1.0%) en las variedades Duela y Shirlaine. Las concentraciones 0.5% y 1.0% redujeron la pérdida de peso de la flor entera y lígulas en comparación con el testigo. La concentración 0.5% fue el mejor tratamiento, aumentó la vida media florero (25 d Duela y 24 d Shirlaine). Los tallos florales tratados con CaCl₂ acumularon más Ca⁺² en el ápice (25.33 ug g-¹ Duela y 64.0 ug g^-1 Shirlaine), permaneciendo erectos por más tiempo que el testigo (9.67 ug g-¹ Duela y 13.67 ug g-¹ Shirlaine). Con la concentración 0.5% se hizo un segundo experimento para evaluar los cambios en concentración de carotenos, antocianinas (pelargonidina, cianidina) y fenoles totales de las lígulas. Las antocianinas de Shirlaine, no cambiaron entre tratamientos. Los fenoles aumentaron 2 1% en Shirlaine y 40% en Duela con respecto a su concentración inicial, en contraste los carotenos disminuyeron al fin de la vida florero 60% y 3 5 %. En Duela el tejido interfascicular es más lignificado que en Shirlaine confiriéndole mayor resistencia. El área relativa (%) lignificada de la región media del escapo fue mayor en Duela (7%) que en Shirlaine (4%). La mayor resistencia del tallo de Duela es explicada por su anatomía y lignificación pero el CaCl₂ fue efectivo para retrasar la senescencia y el doblado del escapo en las dos variedades.

Palabras clave: calcio, gerbera, senescencia, solución preservativa.

Abstract

Key words: calcium, gerbera, senescence, preserving solution.

Introducción

En poscosecha la vida útil de las flores varía dependiendo de la especie y caracteres de senescencia que presente. La vida de florero de la mayoría de las flores cortadas es regulada por el etileno. Cuando las flores entran a su etapa de senescencia, la mayoría de los pétalos adquieren una apariencia traslúcida, seguido de la pérdida de turgencia y después una ligera desecación (Van Doorn, 2001). En gerbera (Germena jamesonii H. Bolus ex Hook. F., la senescencia se relaciona con la maduración de las flores de la cabezuela, el fin de la vida útil en florero es caracterizado por el doblado del escapo, deshidratación de las flores liguladas y pérdida de 10% del peso fresco (Baas et al., 1995). La curvatura del escapo entre 45 y 90° de su plano vertical, es el principal indicador del fin de la vida útil en florero y según algunos autores(as) está asociado a la calidad de las inflorescencias (Mentcarelli et al., 1995). La finalidad de las soluciones preservativas es incrementar la vida útil de las flores; la mayoría de éstas contienen sustratos, bactericidas y antimicóticos (Wounter et al., 1994). En los pétalos el contenido de azúcar disminuye durante la vida florero, causando marchitamiento (Amariutei et al., 1986). En clavel el azúcar en la solución preservativa disminuye los efectos de la senescencia (Acock y Nichols, 1979).

El calcio es un nutrimento esencial, ya que reduce o retrasa el deterioro de la pared celular, ayuda a mantener las funciones de la membrana, en el citosol actúa como segundo mensajero para eventos metabólicos y es componente esencial de la pared celular y lámina media confiriéndole firmeza y rigidez mecánica (Conway et al., 1995; Serrano, 2002). El uso de calcio en soluciones florero aumenta el flujo de agua a través de los tallos por la asociación con la pectina de las paredes celulares del xilema (Van Leperen y Van Gelder, 2006). El Ca²⁺ afecta la calidad y vida de florero en tulipán (Tulipa gesneriana L.); mostrado mejor respuesta de crecimiento y calidad poscosecha, cuando la relación K+/Ca es la óptima en la solución nutritiva (Ramírez-Martínez et al., 2010). Con el objeto de contribuir a la solución del problema del doblado del escapo en poscosecha de esta especie de importancia económica, se planteo la presente investigación en la que se estudia el efecto de CaCl₂ agregado a la solución florero, en la vida útil de la flor, doblado del escapo, cambios en pigmentos (antocianinas, cianidinas y carotenos) y fenoles en las lígulas de dos variedades (Shirlaine y Duela) así como su relación con la anatomía del tallo.

Materiales y métodos

Material biológico

Se usaron las variedades Duela (de color amarillo) y Shirlaine (de color púrpura) de gerbera provenientes de la empresa COXFLOR del municipio de Villa Guerrero, Estado de México. Todas la flores se cortaron el mismo día, cuando el capítulo mostró dos anillos de flores masculinas en antesis. Las flores se colocaron en agua y no recibieron ningún tratamiento químico por parte de la empresa.

El objetivo de este experimento fue comparar el efecto de tres concentraciones de CaCl₂ (0.1, 0.5 y 1%) con el testigo (solución base sin CaCl₂) en la vida media florero, pérdida de peso fresco de la inflorescencia, anillos del disco central y pérdida de peso fresco del capítulo, lígulas y escapo para seleccionar la mejor solución preservativa. Se usaron 10 inflorescencias para las variables de peso y 15 para la medición de calcio.

Experimento 2

Una vez seleccionado el mejor tratamiento de CaCl₂ (0.5%) el objetivo de este experimento fue comparar los cambios en pigmentos (antocianinas, cianidinas, carotenos y xantofilas) y fenoles entre tratamientos y en el tiempo (0, 10, 20, 30 d), se usaron tres repeticiones (flores) por tratamiento. Además se evaluó la incidencia (%) de los síntomas al final de su vida útil, en 20 flores por variedad.

Soluciones florero y tratamientos

Se probaron tres concentraciones de CaCl₂ (0.1, 0.5 y 1.0%) como fuente de Ca²⁺ en una solución florero base (0.1% de sacarosa en agua deionizada). El testigo fue la solución base sin calcio. De cada variedad se usaron 20 flores por tratamiento. Cada inflorescencia se colocó en un florero individual de vidrio de 20 cm de altura con 100 mL de la solución. Se colocaron bajo luz indirecta (300 (imol m-² s-¹ PAR), con un fotoperiodo de 14 h luz (19-22 °C) y 10 h oscuridad (14-16 °C).

Vida media florero

En el presente estudio se propone el concepto de "vida media florero" el cual corresponde a la fecha en d cuando 50% de las flores en el florero o en el experimento presentaron al menos uno de los siguientes síntomas de senescencia: marchitamiento de lígulas; doblado del escapo ≥ 90°; ahorcamiento del tallo caracterizado por adelgazamiento debajo de la cabezuela, pudrición en la base del escapo; ruptura del escapo. Este concepto da una idea objetiva de la vida media de la flor. La incidencia de estos síntomas (%) en cada variedad, se comparo entre el mejor tratamiento CaCl₂ (0.5%) y el testigo (n= 20).

Pérdida de peso fresco

Las inflorescencias se etiquetaron individualmente. Cada 5 d se midieron los cambios en peso fresco de la flor entera (peso inicial-peso final) (n= 10) y también se pesó el escapo, la cabezuela y 20 lígulas para estimar los cambios en peso fresco de las partes (n= 3). Asimismo, se contaron el número de anillos de flores masculinas en antesis como un indicador de senescencia.

La concentración de Ca²⁺ se midió en tallos sin tratamiento (al corte) y en los tratamientos CaCl₂ (0.1%, 0.5%, 1%) y testigo al final de su vida útil (n= 15). Los escapos se dividieron en dos regiones (basal y apical) y de cada región se obtuvieron 0.2 g de tejido seco el cual se trituró y se procesó en 5 mL de ácido nítrico (HNO₃) concentrado en microondas por periodos de 10 min a 75 % de potencia y 5 min al 100%. Las muestras frías se filtraron por una membrana de 0.45 µm de poro, y se aforaron con agua de-ionizada. Las muestras se leyeron mediante espectrometría de emisión óptica de inducción por plasma acoplado (ICP-OES) en un espectrofotómetro 400 'Perkin Elmer' el cual se calibró con un estándar de calcio.

Antocianinas, carotenos y xantofilas en lígulas

Los cambios en la concentración de fenoles, antocianinas, carotenos y xantofilas se midieron a los 0, 10, 20, 30 d en el testigo y el tratamiento con CaCl₂ (0.5%). Las antocianinas se cuantificaron mediante la técnica colorimétrica de Wrolstad (1976), método denominado diferencial del pH de antocianinas. Se usaron tres inflorescencias por tratamiento, de cada cabezuela se tomaron seis lígulas; tres lígulas se maceraron en el amortiguador de KCl-HCl (pH 1, 50 mL de KCl 0.2 M y 97 mL de HCl 0.2 M se afora a 200 mL) y otras tres en un amortiguador de acetato (pH 4.5, 30.5 mL de ácido acético 0.2 M y 19.5 mL de acetato de sodio 0.2 M se afora a 100 mL ajustando el pH con ácido acético 0.2 M. Posteriormente cada extracto y centrifugó (4 000 g), y el sobrenadante se midió en un espectrofotómetro a 520, 530 y 700 nm. La concentración de la pelargonidina (PGD-3glu) y de cianidina se calculó de acuerdo a la fórmula de Wrolstad (1976). Los carotenos y xantofilas (ca+xa) se cuantificaron en extractos cetónicos 80% en un espectrofotómetro (Hach Dr/4 000U) a 470, 676, y 663 nm, y la concentración se calculó con la fórmula de Lichtenthaler y Wellburn (1983). Considerando que durante la senescencia las lígulas sufren una marcada pérdida de peso fresco por marchitez y que la percepción del color de la inflorescencia es por unidad morfológica (lígula), los resultados de pigmentos se expresaron por lígula µg lígula-¹).

Fenoles en lígulas

Los fenoles se midieron en las mismas fechas y tratamientos que los pigmentos totales con un espectrofotómetro (Hach Dr/4 000U) a 760 nm, mediante la reacción con el reactivo Follin-Ciocalteu, modificado por Singleton y Rossi (1965). Los resultados de fenoles también se expresaron por unidad morfológica (µg lígula-¹).

Histología del escapo

Con la finalidad de conocer si la estructura del tallo contribuye a la resistencia al dolado del escapo, se usaron cinco escapos por variedad después del corte, al inicio de la vida florero. Se cortaron fragmentos de 1 cm, de la parte basal, media y apical de los tallos. Los fragmentos se fijaron en FAA (10% formadehído (al 36%), 50% etanol, 5% ácido acético en agua desionizada) por 48 h. Posteriormente se deshidrataron e incluyeron en parafina y se obtuvieron cortes transversales (15 µm) y se tiñeron con safranina y verde fijo (FCF) según Zavaleta-Mancera y Engleman (1994).

Histoquímica para lignina

Con el objeto de conocer la abundancia y distribución de los tejidos lignificados que sirven de sostén al escapo se estudiaron 5 escapos por variedad después del corte. Se obtuvieron cortestrasversales de 40 (im conunmicrótomo de mano de la parte basal, media y ápical. La lignina fue detectada con fluroglucinol 2% y HCl al 25 % según Zavaleta-Mancera y Engleman (1994) el color rojo en el tejido indicó la presencia de lignina. Los cortes se observaron y fotografiaron en un microscopio óptico, Axioscop 2 Plus (Carl Zeiss, Alemania) equipado con una cámara digital Cyber Shot DSC25 (Sony, Japón). De cada imagen se calculó el área relativa (%) del tejido lignificado con respecto al área transversal del escapo con el programa UTHSCSA Image Tool 1.28 (University of Texas Health science Center, San Antonio, TX, USA).

El diseño experimental fue completamente al azar, los datos se expresaron como valores promedios ± el error estándar y se analizaron mediante un ANOVA. En el experimento 1 las medias de los tratamientos para las variables de peso fresco (capitulo, lígulas y escapo) y concentración de calcio se analizaron mediante la prueba de Tukey (p≤ 0.05). En el experimento 2 se usó la prueba t de Student (p≤ 0.05) para comparar los datos de pigmentos y fenoles de flores tratadas con 0.05% de CaCl₂ y el testigo. La cantidad relativa de lignina entre variedades se comparó con la prueba t de Student (p≤ 0.05) y entre partes del escapo mediante la prueba de Tukey (p≤0.05).

Resultados

Experimento 1. Efecto del CaCl₂ en la vida media florero

El 50% de las flores mantenidas en la solución base (testigo) terminaron su vida útil a los 20 d en Duela y a los 13 d en Shirlaine, en contraste, las tres concentraciones CaCl₂ retrasaron la senescencia siendo la concentración de 0.5% la que mayormente alargo la vida de la flor (25 d en Duela, y 24 d en Shirlaine).

La mayor pérdida de peso se observó en la concentración 0.1 % en las dos variedades. En contraste las concentraciones 0.5% y 1.0% redujeron la pérdida de peso en comparación con el testigo. No obstante la concentración de calcio afecto retrasando la apertura de anillos (Cuadro 1). En el caso de las lígulas estas siguieron la misma tendencia que la flor completa mientras que el capítulo y escapo mostraron variación, incluyendo algunas ganancias de peso (Cuadro 1).

Concentración de calcio en el escapo

La concentración Ca⁺² al corte no presentó variación entre variedades. Las flores que acumularon mayor concentración de Ca⁺² en los escapos fueron las tratadas con 0.5% y 1.0% de CaCl₂ especialmente en la región apical, siendo más marcada esta tendencia en Shirlaine; la cual acumuló nueve veces más Ca⁺² que el testigo. En Duela las concentraciones de 0.1% y 0.5% no presentaron diferencias significativas entre regiones del escapo, en tanto que en la concentración de 1.0% si se presentaron (Cuadro 2).

Experimento 2. Efecto del tratamiento de 0.5% CaCl₂ en la vida de florero

Los síntomas más frecuentes en la senescencia de Shirlaine fueron el doblado del escapo (3 0%) y el marchitamiento de las lígulas (70%), mientras que en Duela el ahorcamiento debajo del capítulo fue el principal síntoma de senescencia, y el doblado del escapo fue 25%. El principal efecto del calcio fue en la reducción del doblado del escapo con respecto al control; 20% en Duela y 10% en Shirlaine (Cuadro 3).

Pigmentos y fenoles

En Duela no se detectó presencia de antocianinas, por lo cual, sólo se reportan carotenos y fenoles. La concentración de carotenos en las lígulas se redujo significativamente en los tratamientos con CaCl₂. Estos resultados indican que el CaCl₂ aceleró la degradación de estos pigmentos, en Shirlaine disminuyó 40% y en Duela 65% al fin de la vida florero.

El tratamiento de CaCl₂ no tuvo efecto en la concentración de antocianinas en Shirlaine, ni se detectaron diferencias significativas en el tiempo.

El CaCl₂ promovió la acumulación de fenoles en las lígulas de las dos variedades al fin de su vida florero (30 d) con respecto a la concentración inicial pero en el testigo no se detectaron diferencias significativas. Duela tratada aumentó 40% y Shirlaine 21.66% (Cuadro 4).

Histología del escapo y lignina

Los tallos de las variedades estudiadas presentaron la anatomía típica de un tallo herbáceo de dicotiledónea; haces vasculares colaterales (xilema interno y floema externo) arreglados en un anillo central. El tallo de las dos variedades presentó una maduración acropeta. La base (tejido maduro) presentó los haces mayores con tejido interfascicular lignificado, en la parte media del escapo el tejido interfascicular se encontró escasamente lignificado y el escapo apical (tejido más joven) presentó haces pequeños y tejido interfascicular no lignificado (Figura 1).

Discusión

En el presente estudio la adición de 0.5% CaCl₂ a la solución preservativa demostró ser efectiva para alargar la vida florero de Duela y Shirlaine reduciendo el doblado del escapo. Se ha observado que el CaCl₂ puede alargar la vida florero en otras especies; Gladiolus cv. 'Happy End' (Pruthi et al. , 2001), Rosa hybrida cv. Kiss (Capdeville et al., 2005), Chrysanthemumm indicum y Tagetes erecta (Patel y Mankad, 2002). La evidencia del retraso de la senescencia en flores por CaCl₂ se ha demostrado en pétalos de rosas, ya que mantiene la integridad de membranas celulares, reduce la producción de etileno y promueve el transporte de solutos (Torre et al., 1999); tratamiento con CaCl₂+sacarosa+HQS, aumentó en 7 días la vida florero, retrasando la pérdida de peso fresco, turgencia de los pétalos y hojas, así como mayor porcentaje de flores abiertas (Cortes et al., 2011). Un estudio demostró el efecto positivo de aplicaciones de CaCl₂ pre y postcosecha en cuatro variedades de gerbera (Campitano, Dino, Sangría y Testarossa) encontrando que la inyección de los escapos con CaCl₂ 1% en precosecha incrementó la vida florero (Gerasopoulos y Chebli, 1999). No obstante las diferencias en la vida florero de las variedades de gerbera del presente estudio, estas duraron más tiempo (24 d) que el reportado para esta especie, estimado en 15 d (Gerasopoulos y Chebli, 1999). La adición de CaCl₂a la solución preservativa mejoró significativamente la vida poscosecha de Shirlaine; variedad que presentó en el testigo una mayor incidencia al doblado asociado a una baja proporción de tejido lignificado en contraste con Duela. Éstos resultados demuestran el efecto particularmente positivo del ion Ca⁺² en variedades con tallos poco lignificados y de vida de florero corta.

El calcio (Ca⁺²) es un ion relacionado con la estabilidad y fuerza mecánica de la pared celular, ésta propiedad se atribuye a la unión cooperativa de las cadenas poligalacturónicas con los iones calcio para formar pectatos en la lámina media (Conway et al., 1995; Halevy et al., 2001). Un estudio realizado por (Albino-Garduño et al., 2008), demostró la importancia del Ca en el cultivo hidropónico de Gerbera jamesonii, y reportó que bajas concentraciones (6 meq Ca⁺²L^-1) reducían la producción, diámetro de la cabezuela y calidad (longitud y firmeza) del escapo con respecto a 9 y 12 meq Ca++L-¹. Tratamientos con calcio mantuvieron la firmeza del fruto en poscosecha; melón "Campsol" (Rinaldi, et al., 2004) y en manzanas (Poovaiah, 1988; Dilmaghani et al., 2005). Los escapos de Duela y Shirlaine tratados con CaCl₂ acumularon significativamente Ca⁺² en la región apical, lugar donde comúnmente el tallo se dobla; así los tallos tratados se mantuvieron erectos por más tiempo en contraste con el testigo; en Duela se redujo 10% y en Shirlaine 20%.

La presencia de lignina estuvo asociada a los elementos de vaso del xilema, fibras floemáticas y tejido interfascicular. Estos datos indican una mayor rigidez del escapo de Duela. La anatomía y lignificación del tallo entre variedades son indicadores importantes que pueden determinar la resistencia del tallo, independientemente del tratamiento en la solución preservativa. Así la baja incidencia del doblado en Duela estuvo asociada a una mayor abundancia relativa de lignina en la parte media del tallo y lignificación del tejido interfascicular.

El CaCl₂ en las dos variedades aceleró la degradación de carotenos pero promovió la acumulación de fenoles. En el caso particular de la flor roja de Shirlaine, CaCl₂ promovió la acumulación de cianidina y pelargonidina a los 30 d, los testigos sólo duraron 20 d; las lígulas se observaron oscurecidas. Esto podría estar asociado al fenómeno denominado copigmentación en el que las antocianinas con compuestos fenólicos forman uniones no covalentes por enlaces Van der Waals, en presencia de glucosa, hecho que limita la interacción de la antocianina con H₂O evitando su degradación y perdida de color (Brouillard et al., 1989; Boulton, 2001). Adicionalmente los compuestos fenólicos tienen actividad antioxidante, que contrarresta el efecto de los radicales libres (Vinson y Hontz, 1995; Proestos et al. 2005). Durante la senescencia las células producen una gran cantidad de radicales libres (ROS) que oxidan las membranas y producen daño celular como se ha demostrado en gerbera (Trujillo-Villagarcía et al., 2006) y trigo (Zavaleta-Mancera et al., 2007). Se considera que el aumento de fenoles en las lígulas de gerbera tratadas con CaCl₂ pudo proteger las células del daño oxidativo, promoviendo el retraso de la senescencia.

La aplicación de CaCl₂ a la solución florero retrasó la senescencia de las dos variedades de gerbera; la concentración de 0.5% de CaCl₂ fue la que produjo mayor vida florero. El Ca⁺² se acumuló significativamente en la región apical del escapo de las dos variedades, favoreciendo el endurecimiento del tejido y reduciendo la incidencia al doblado preferentemente en Shirlaine. Uno de los elementos que determinó las diferencias en la vida florero entre Duela y Shirlaine fue la anatomía y el grado de lignificación del escapo, características establecidas genéticamente. Así la menor incidencia al doblado del escapo observado en Duela, sería explicado por su mayor proporción de tejido lignificado y una temprana lignificación del tejido interfascicular en la parte del tallo donde se presenta la ruptura y el retraso de la senescencia entre tratamientos dentro de la misma variedad estaría explicado por el efecto del CaCl₂ en la solución florero.

Agradecimientos

Las autoras agradecen al doctor Humberto López Delgado del programa nacional de papa, del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) por las facilidades de laboratorio brindadas, y a Miguel Vega Zúñiga por la asistencia técnica en la elaboración de los cortes histológicos en el Laboratorio de Anatomía e Histoquímica Vegetal del Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas, Campus Montecillo.

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