Kafirinas, proteínas clave para conferir digestibilidad y calidad proteica al grano de sorgo*

Kafirins, key proteins to improve digestibility and proteic quality of sorghum grain

Elizabeth Chiquito-Almanza¹, Gabriel Cobielles-Castrejón², Noé Montes-García², Víctor Pecina-Quintero² y José Luis Anaya-López^2§

¹ Centro Multidisciplinario de Estudios en Biotecnología-FMVZ. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Carretera Morelia-Zinapécuaro, km. 9.5. La Palma, Tarímbaro, Michoacán, México. A. P. 53. C. P. 58262. Tel. 01 443 295809. (ely_sayra@hotmail.com).

* Recibido: junio de 2010
Aceptado: abril de 2011

Resumen

El sorgo es un alimento básico en varios países de África y Asia. Sin embargo, su grano es deficiente en lisina y su calidad proteica disminuye cuando se cocina. Los intentos para conferir calidad proteica al grano de sorgo, no han satisfecho los requerimientos nutricionales, y las alternativas biotecnológicas se han enfocado a la expresión heteróloga de proteínas, sin prestar atención a incrementar la digestibilidad proteica. El incremento del contenido de lisina en maíz QPM y el silenciamiento génico de las α-zeínas en maíz, sugieren que la modificación de la expresión de las kafirinas, una familia de prolaminas del sorgo homólogas a las zeínas de maíz, permite incrementar el contenido de lisina y la digestibilidad proteica del grano de sorgo. En esta revisión se discuten aspectos básicos de la clasificación de las kafirinas, su homología con las zeínas de maíz, y su contribución en la calidad y digestibilidad proteica del grano de sorgo. El objetivo es sustentar la hipótesis de que la modificación de la expresión de las kafirinas mediante silenciamiento génico es una estrategia clave para mejorar el valor nutritivo del grano del sorgo, el estudio se llevó a cabo durante 2009 y 2010.

Palabras clave: Sorghum bicolor L. Moench, calidad proteica, digestibilidad, kafirinas, prolaminas.

Abstract

Key words: Sorghum bicolor L. Moench, digestibility, kafirins, prolamins, proteic quality.

INTRODUCCIÓN

El sorgo ocupa el quinto lugar mundial en la producción de cereales y es uno de los alimentos básicos más importantes, para millones de personas pobres en muchas regiones semiáridas y tropicales del mundo, particularmente en el Sub-Sahara africano (Dicko et al., 2006). La producción de sorgo rinde más que el maíz bajo condiciones de estrés hídrico (Farre y Faci, 2006), este cultivo tiene potencial para producir alimento en las condiciones actuales y futuras donde la escasez de agua es un factor limitante para la agricultura.

A pesar de que la composición química del grano de sorgo es similar a la del maíz, su calidad proteica es baja debido a la deficiencia de lisina (Maclean et al., 1981) y a la disminución de la digestibilidad cuando es cocinado (Duodu et al., 2003). Aunque por décadas se ha intentado incrementar la calidad proteica del grano de sorgo, sólo se han reportado tres líneas con "alto contenido de lisina": IS11167 e IS11758 originarias de Etiopía (Singh y Axtell, 1973) y P721 Q una mutante de fenotipo opaco inducida por mutagénesis química (Mohan, 1975).

En comparación con 2% de lisina y 8-12% de proteína de una variedad de sorgo normal (Vasal, 2002), las líneas IS11167, IS11758 y P721 Q tenían 3.34, 3.13 y 2.9% de lisina con 15.7, 17.2 y 15.7% de proteína, respectivamente (Singh y Axtell, 1973; Mohan, 1975); sin embargo, estos valores están por debajo de 5.5 g de lisina por cada 100 g de proteína recomendados por la World Health Organization (Maclean et al., 1981). Además, el consumo de IS11758 y P721 Q por niños(as) de 30 a 60 meses de edad, se asoció con pérdida de peso y una baja concentración de aminoácidos esenciales, principalmente lisina y treonina, debido probablemente a la baja digestibilidad (Maclean et al., 1981). Esto indica que para incrementar la calidad proteica del grano de sorgo, no basta con incrementar su contenido de lisina, sino también mejorar su digestibilidad.

Más recientemente, Weaver et al. (1998) reportaron el cultivar de sorgo P851171 con alta digestibilidad in vitro de la proteína cocida (80%) y sin cocer (85%). Esta línea derivada de P721 Q se caracterizó por la estructura atípica de los cuerpos proteicos en el endospermo. A pesar de que tuvo una mayor digestibilidad real de aminoácidos comparado con el maíz y los sorgos normales, sus valores de TME_n fueron los más bajos, y no produjo ganancia de peso en pollos con una dieta deficiente de proteínas, debido probablemente a que P851171 tenía un endospermo parcialmente vítreo y 8% menos almidón que la línea P721N de la cual proviene P721Q (Elkin et al., 2002).

Otra estrategia para incrementar el contenido de lisina del grano de sorgo, fue expresar una mutante de la hordotionina de cebada (HT12), que contenía siete residuos de lisina adicionales a los cinco residuos que contiene normalmente (Zhao et al., 2003). Aunque las plantas transformadas tuvieron 50% más lisina que su contraparte silvestre, no se evaluó la digestibilidad proteica del grano, y es posible que el uso de la hordotionina modificada este restringido debido a la citotoxicidad de la hordotionina (Florack y Stiekema, 1994).

Una de las hipótesis más aceptadas en relación a la baja calidad proteica del grano de sorgo, es que el bajo contenido de lisina y la disminución de la digestibilidad proteica, se deben a la composición y alto contenido de kafirinas. El termino kafirinas fue acuñado por Johns y Brewster (1916), para definir a las proteínas del gluten del grano de sorgo solubles en etanol al 70%, conocidas de manera genérica como prolaminas debido a su alto contenido de prolina y amida de nitrógeno.

Al igual que otras prolaminas, las kafirinas se encuentran en cuerpos proteicos del endospermo. Su función es proveer al embrión de una fuente de nitrógeno durante las primeras etapas del desarrollo (Shewry y Halford, 2002). Las kafrinas pueden dividirse en una fracción soluble en condiciones no reductoras, conocida como kafirina 1 o kafrina real, y otra que requiere de un agente reductor para su extracción, denominada glutelina soluble en alcohol, kafirina 2 o kafirina entrecruzada (El Nour et al., 1998).

Las zeínas de maíz son las prolaminas mejor caracterizadas. Su clasificación fue propuesta por Esen, (1987), quien las agrupo en α-, β-, y γ-zeínas con base en su solubilidad, composición de aminoácidos, y propiedades electroforéticas, cromatográficas e inmunológicas.

Cada grupo de prolaminas esta constituido por polipéptidos de distintas masas moleculares, lo que permite agruparlas en función a su movilidad aparente en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE). Es común encontrar en la literatura algunas discrepancias respecto al número y masa molecular de los polipéptidos que conforman cada grupo. Aunque se han reportado β-zeínas con una movilidad aparente de M_r 17 000 y 18 000 (Esen, 1987), y β-kafirinas de M_r 16 000, 18 000 y 20 000 (Shull et al., 1991), hasta ahora solo se ha identificado un gen en sorgo (Chamba et al., 2005), y otro en maíz (Coleman y Larkins, 1999), que codifican para la β-kafirina y β-zeína respectivamente, lo cual parece incongruente con el número de β-zeínas reportadas.

De los tres polipéptidos identificados como β-kafirina por Shull et al. (1991), solo el de M_r 20 000 reaccionó con el antisuero de β-zeína. Por lo que omitiendo a las β-kafirinas de M_r 16 000 y 18 000, las kafirinas pueden clasificarse por su movilidad aparente en α-kafirinas de M_r 23 000 y 25 000, β-kafirinas de M_r 20 000 y γ-kafirinas M_r 28 000 (Shull et al., 1991). Aunque se han aislado dos transcritos en sorgo cuya secuencia de aminoácidos deducidos tiene alta homología con las δ-zeínas de M_r 10 000, aún no se han identificado δ-kafirinas a nivel proteico (Belton et al., 2006).

En cuanto a la movilidad aparente de las zeínas, Esen, (1987) sugirió la inclusión de tres α- (M_r 10 000, 21 000 y 25 000, dos β- (M_r 17 000 y 18 000), una γ- (M_r 27 000) y ninguna δ-zeína. Sin embargo, los estudios sobre la expresión genética en el endospermo y las propiedades inmunológicas de las zeínas realizados por Woo et al. (2001), contribuyeron a generar una clasificación más precisa. De acuerdo con esos resultados las prolaminas de maíz se agrupan en α-zeínas de M_r 19 000 y 22 000, β-zeínas de M_r 15 000, γ-zeínas de M_r 16 000, 27 000 y 50 000, y δ-zeínas de M_r 10 000 y 18 000.

La homología entre prolaminas, y particularmente entre zeínas y kafirinas, se ha demostrado mediante el uso de anticuerpos (Mazhar et al., 1993) y con la comparación de secuencias de ADN y de aminoácidos, lo que ha permitido agruparlas en familias, para determinar su homología e identificar genes ortólogos en estas dos especies (Cuadro 1) (Rezende y Figueira, 2008).

Contribución de las kafirinas a la calidad proteica del grano de sorgo

La calidad de una proteína depende principalmente de la composición de aminoácidos esenciales y su digestibilidad. El grano de sorgo contienen 8-12% de proteínas totales (Vannalli et al., 2008), de las cuales entre 73% en el grano entero y 82% en el endospermo son kafirinas (Hamaker et al., 1995). Adicionalmente las kafirinas tienen un bajo contenido de lisina (0.2 mole %) (Taylor et al., 2007), y su contenido se correlaciona negativamente con la energía metabolizable aparente (AME) y la energía metabolizable real (TME_n), lo que sugiere que el valor energético del grano de sorgo depende también de la concentración de kafirinas (Salinas et al., 2006).

Aunque se desconoce el mecanismo de la proporción de cada kafirina, que puede afectar el perfil de aminoácidos en el grano de sorgo, la comparación de variedades de sorgo normales con las de alto contenido de lisina, ha mostrado una correlación negativa entre el contenido de kafirinas y lisina. El incremento de lisina en IS11758 y P721 Q, se relacionó con la reducción en más de 50% en el contenido de kafirinas totales, y con el incremento de albúminas y globulinas (Guiragossian et al., 1978; Paullis y Wall, 1979), sugiriendo que la disminución en el contenido de kafrinas es compensado con la síntesis de proteínas con un mejor balance de aminoácidos. Estas observaciones han sido corroboradas por el silenciamiento génico de la expresión de las α-zeínas de 19 y M_r 22 000 en maíz, cuyo incremento en el contenido de lisina y triptófano en más de 98 y 76%, respectivamente y se correlacionó positivamente con el reemplazo de las zeínas por proteínas, con un mejor balance de aminoácidos y mayor contenido de lisina (Huang et al., 2006).

Uno de los aspectos más estudiados de las kafirinas es su participación en la disminución de la digestibilidad, y aunque ésta es afectada por varios factores exógenos y endógenos (Duodu et al., 2003; Wong et al., 2009), múltiples evidencias indican que el entrecruzamiento de kafirinas y la formación de enlaces disulfuro son una de las principales causas de la disminución de la digestibilidad de las proteínas del grano de sorgo.

En las primeras etapas del desarrollo, el grano de sorgo tiene una cantidad insignificante de β- y γ-kafirinas entrecruzadas; sin embargo, su contenido aumenta conforme el grano madura. Entre los 14 y 48 días después de la antesis (DDA) la fracción de kafirina 1, incrementa más de 100%, alcanzando un valor máximo 28 DDA. Durante este mismo periodo a partir de 28 DDA la fracción de kafirina-2, incrementa en más de 300%, lo que sugiere que la formación de polímeros se hace a expensas de las kafirinas de la fracción 1 (Mazhar y Chandrashekar, 1993).

El incremento en el entrecruzamiento de prolaminas, particularmente el de γ-kafirina, se correlaciona de manera negativa con la disminución de la digestibilidad de las proteínas del sorgo. La harina cruda de granos de sorgo inmaduros (30 días después de la floración media, DDFM) tiene 40% de γ-kafirinas entrecruzadas y una digestibilidad 90%, pero cuando los granos alcanzan la madurez fisiológica, el entrecruzamiento de γ-kafirina aumenta 90% y la digestibilidad disminuye a 73%, debido probablemente también a la deshidratación del grano (Oria et al., 1995a).

De hecho, el ARNm de la γ-kafirina inicia su expresión siete días después de la polinización (DDP) y se incrementa progresivamente hasta los 21 DDP, cuando alcanza un máximo nivel (Bansal et al., 2008). Por lo que existe una relación entre la acumulación de γ-kafirina, la cual desempeña una función importante en la formación de polímeros (El Nour et al., 1998), y la reducción de la digestibilidad. Adicionalmente, las γ-kafirinas se unen con mayor afinidad que las otras clases de kafirinas a los taninos condensables del grano de sorgo, disminuyendo la digestibilidad de las kafirinas totales y de las γ-kafirinas 59% a 8.4% y 30% a 17.2%, respectivamente (Emmambux y Taylor, 2003; Taylor et al., 2007).

Independientemente del estado de madurez del grano, el proceso de cocción disminuye la digestibilidad de las proteínas de la harina del sorgo 90 a 85% cuando la harina proviene de granos de sorgo inmaduro (20 DDFM), y 73 a 55% si es de grano que alcanzó su madurez fisiológica (Oria et al., 1995a). Esta disminución se ha registrado en maíz y sorgo al evaluar los concentrados de las proteínas del endospermo (Ezeogu et al., 2005), los cuerpos proteicos (Duodu et al., 2001), y la fracción de kafirinas y zeínas aisladas antes (Emmambux y Taylor, 2009) y después de cocer la harina (Nunes et al., 2005), lo cual indica que las kafirinas son los principales responsables de la disminución de la digestibilidad proteica. De hecho, la cocción húmeda y la cocción húmeda a presión reducen en mayor proporción la digestibilidad de las proteínas de la harina de sorgo y de las kafirinas en comparación con las zeinas y la harina de maíz (Emmambux y Taylor, 2009), debido probablemente a la formación de oligómeros de kafirina unidos por enlaces disulfuro.

Formación de puentes disulfuro y entrecruzamiento de kafirinas

La mayor parte de las prolaminas del grano de sorgo están en forma entrecruzada. El 70% de las kafirinas extraídas por 2-metil-2-propanol en condiciones no reductoras son oligómeros de γ-α1 y α2 kafirinas unidas por enlaces disulfuro, mientras que 90% de la fracción residual de kafirinas contiene, además de polímeros de γ-α1 y β-kafirinas, monómeros y dímeros γ- y α1-kafirinas (El Nour et al., 1998). La β- y γ-kafirina tienen un alto contenido de cisteína, que favorece la formación de enlaces disulfuro, la formación de estructuras secundarias y de polímeros resistentes a la digestión enzimática (Oria et al., 1995b; El Nour et al., 1998).

La adición de agentes reductores como ditiotreitol, 2-mercaptoetanol o bisulfito de sodio, reducen la formación de puentes disulfuro impidiendo la formación de estructuras secundarias, incrementando significativamente la digestibilidad de proteínas (Hamaker et al., 1987). Estas evidencias fueron reforzadas mediante la expresión heteróloga de mutantes de la γ-zeína de M_r 27 000, en las que se observó que la substitución de la cisteína 155 por alanina (C155A), incrementó su digestibilidad in vitro con pepsina, quimotripsina y tripsina en comparación con su contraparte nativa, lo cual pudo deberse al enlace disulfuro entre las cisteínas C128 y C155 es crítico para mantener la estabilidad y un adecuado plegamiento de la γ-zeína (Lee y Hamaker, 2006). Estas evidencias confirman que los enlaces disulfuro contribuyen significativamente en la reducción de la digestibilidad, y que algunos tienen mayor participación en el mantenimiento de la estructura secundaria de las kafirinas.

Cambios en la estructura secundaria

Debido que el proceso de cocción induce la formación de hojas-β en la harina de sorgo y en las kafirinas pero no en la harina de maíz y las zeínas, se ha sugerido que este cambio conformacional puede ser la causa de la reducción en la hidrólisis de las kafrinas, ya que lo residuos de kafirinas indigeribles mediante pepsina tienen mayoritariamente una conformación de hojas-β (Gao et al., 2005; Emmambux y Taylor, 2009), por lo que se ha sugerido que la predominancia de esta estructura podría ocasionar el plegamiento de las proteínas limitando la accesibilidad de las proteasas.

Una hipótesis al respecto es que la energía aplicada durante el proceso de cocción húmeda rompe los enlaces de hidrógeno, desestabilizando la estructura de las hélices-α y dejando a los polipéptidos descubiertos y alineados uno junto al otro, favoreciendo la formación de una conformación intermolecular de hoja-β, que da como resultado el entrecruzamiento de enlaces disulfuro y la formación de polímeros de kafirina que forman una estructura rígida con menor susceptibilidad a la proteólisis (Duodu et al., 2001; Emmambux y Taylor, 2009).

Sin embargo, las diferencias en el cambio conformacional de hélice-α a hoja-β entre zeínas y kafirinas, explican solo de manera parcial el motivo por el que las kafirinas son menos digeribles, ya que cuando los sorgos mutantes P850029 y P851171, con alta digestibilidad protéica, son cocinados con calor húmedo tienen cambios en la estructura secundaria similares al de los sorgos convencionales (Duodu et al., 2001). Además, la cocción de harina de maíz y sorgo en presencia de β-mercaptoetanol, incrementa la proporción de hojas-β en relación a las hélices-α (Ezeogu et al., 2008); lo cual parece contraponerse con la teoría de que la formación de estructuras secundarias de hojas-β disminuye la digestibilidad de las kafirinas, ya que la adición de agentes reductores a las prolaminas del sorgo y el maíz incrementa su digestibilidad mediante la ruptura de los enlaces disulfuro. Ezeogu et al. (2005) sugiriere que hay otros factores como la estructura de los cuerpos proteicos y la distribución de las γ-kafirinas que podrían desempeñar una función importante en la disminución de la digestibilidad.

Localización de las kafirinas y digestibilidad proteica

La distribución de las kafirinas en los cuerpos proteicos y sus diferentes susceptibilidades a la hidrólisis, son dos evidencias más convincentes de la contribución de las kafrinas en la disminución de la digestibilidad. La α-kafrina purificada en condiciones no reductoras es fácilmente digerible, ya sea cocinada o sin cocinar, por lo que la dificultad para digerir la α-kafirina presente en la harina de sorgo, podría deberse a su localización dentro de los cuerpos proteicos (Oria et al., 1995b).

Los cuerpos proteicos tienen forma esferoide y están compuestos en casi 80% por α-kafirina, esta se localiza en el interior, mientras que las β- y γ-kafirinas se encuentran principalmente en la periferia formando una "cubierta" (Shull et al., 1992). Debido que el proceso de digestión inicia en la superficie de los cuerpos proteicos, la β- y γ-kafirina actúan como una barrera protegiendo a la α-kafirina de la hidrólisis enzimática.

Se cree que el proceso de cocción disminuye aún más la digestión de la α-kafirina, al inducir la formación de enlaces disulfuro y de polímeros constituidos por β-, γ-kafirinas y posiblemente otras proteínas localizadas en la periferia del cuerpo proteico, ya que la adición de agentes reductores acelera el proceso de digestión hasta que virtualmente todas las kafirinas son digeridas excepto 2% de α-kafirina (Oria et al., 1995b; El Nour et al., 1998).

Estas evidencias se fortalecieron con el estudio de la mutante de sorgo P851171, la cual tiene una digestibilidad proteica in vitro 85 y 80% sin cocinar y cocinada, respectivamente. Los cuerpos proteicos de P851171 tienen una estructura atípica con una mayor área de contacto debido a su forma irregular y la presencia de numerosas invaginaciones, que difiere de la estructura esferoide de las variedades normales. Al igual que en una variedad normal, las α- y β-kafirinas de P851171 se encuentran en el interior de los cuerpos proteicos, sin embargo, las γ-kafirinas están ubicadas en la base de las invaginaciones, lo que facilita el contacto de la α-kafirina con las enzimas digestivas (Oria et al., 2000).

Impacto de la modificación de la expresión de las zeínas en la calidad proteica del maíz

Sin embargo, el maíz opaco no tuvo aceptación, pues tenía un endospermo suave de secado lento, con mayor susceptibilidad a enfermedades e insectos, y menor rendimiento debido a su baja densidad por unidad de volumen (Sofi et al., 2009), lo cual se debió a que la transcripción de varias zeínas de M_r 22 000 es independiente de o2, y a que este gen tiene efectos pleiotrópicos (Ciceri et al., 2000). Posteriormente, a partir del maíz opaco2 se desarrollaron líneas QPM, mediante modificadores del gen o2, que a diferencia de su antecesor tuvieron granos vítreos con rendimientos comparables a los cultivares normales y un incremento de 55% de triptófano, 30% de lisina y 38% menos de leucina, con una calidad proteica de 90% en comparación a la leche (Gupta et al., 2009). La restitución del endospermo vítreo del maíz QPM, se asoció con el incremento en dos o cuatros veces del contenido de la γ-zeína de M_r 27 000 (Wallace et al., 1990; Geetha et al., 1991), lo cual compensó la reducción en el contenido de α- y β-zeínas (Ufaz y Galili, 2008).

Posteriormente Lai y Messing (2002) incrementaron el contenido de metionina en la semilla de maíz, eliminando la regulación post-transcripcional del gen dzs 10, que codifica para la δ-zeína de M_r 10 000 que tiene un buen balance de metionina. Para ello reemplazaron los UTRs y el promotor del gen dzs 10 por el UTR 5' y el promotor de la γ-zeína, que es altamente expresado e independiente del sistema de regulación post-transcripcional de dzs10. La metionina del maíz transgénico fue funcionalmente equivalente a la metionina usada para suplementar el alimento de pollos.

Otros estudios se enfocaron a silenciar la expresión de las prolaminas mediante ARN de interferencia (ARNi), y demostraron que el silenciamiento de la α-zeína de M_r 22 000 en maíz genera un fenotipo opaco dominante con una segregación mendeliana, que a diferencia de o2 no requiere de un estado homocigoto del alelo (Segal et al., 2003).

Con el silenciamiento simultáneo de la α-zeína de M_r 19 000 y 22 000 la disminución del contenido de leucina, y el incremento de lisina, treonina y triptófano fueron superiores a los que se obtuvieron con el silenciamiento individual de cada tipo de α-zeína (Cuadro 2). Este aumento en la calidad proteica se debió al incremento en la relación entre las proteínas y las zeínas (Gibbon y Larkins, 2005). Adicionalmente, la reducción de leucina es deseable, debido que mejora el balance en la relación leucina/isoleucina, ayudando a liberar más triptófano para la biosíntesis de niacina.

Estas evidencias demuestran que mediante la manipulación de la expresión de las zeínas, es posible modificar significativamente el perfil de aminoácidos esenciales y mejorar el valor nutritivo del grano de maíz, lo que sugiere que se pueden generar plantas transgénicas con una deficiencia específica en cada clase de zeína, no solo para estudiar su función proteica sino para mejorar características específicas.

CONCLUSIONES

La generación del fenotipo opaco en maíz con el silenciamiento génico de las α-zeínas de M_r 19 000 y 22 000, demuestra que las prolaminas son puntos de regulación clave para mejorar el balance de aminoácidos; por lo tanto, es factible estudiar no solo el impacto de las kafirinas en el valor nutritivo, sino la contribución de cada tipo de kafirina en la digestibilidad proteica, con el objetivo de usar la tecnología de ARNi en la generación de sorgo con mejores características nutricionales.

Implementar tecnologías como el silenciamiento génico en cultivos introducidos de interés agrícola, con pocos o ningún pariente silvestre, contribuirá a reducir la probable contaminación del germoplasma nativo y a generar plantas modificadas genéticamente con mayor valor nutritivo, teniendo la ventaja que se usan los genes propios del organismo modificado, lo cual mitigaría el rechazo hacia los cultivos transgénicos, cuya producción se vislumbra como una realidad en México, contribuyendo a reducir la dependencia tecnológica y regular los precios de estos productos en el mercado nacional.

LITERATURA CITADA

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