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<article-title xml:lang="es"><![CDATA[Actividad antioxidante y efecto citotóxico de Cladocolea loniceroides (van Tieghem) Kuijt (Loranthaceae)]]></article-title>
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<abstract abstract-type="short" xml:lang="en"><p><![CDATA[Cladocolea loniceroides is an endemic mistletoe to Mexico which causes economic losses. In order to find out its usefulness, the objective of this work was to assess polyphenols, especially flavonoids, as obtained of aqueous and methanolic extraction of leaf, fruit and stalk, as well as its antiox idant activity (AOxA), wh ich was assessed as % of DPPH• (1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl) inhibition. AOxA was also evaluated through the malondialdehyde content produced by the lipid peroxidation, induced by intraperitoneal injection of iron-dextran, into rat blood serum. The polyphenols citotoxic effect was evaluated on the cellular line ZR-75-1 of breast cancer, which was determined through its LC50 value (extract concentration that provides 50% of cellular death). Total polyphenols assessed were (mg eq. GA): fruit>leaf>stalk (189.5 ± 4.9; 93.33± 0.9 y 74.5 ± 4.2 , respectively). AOxA of aqueo us and methanolic extractions of leaf, fruit and stalk is a consequence of the chelating capacity of polyphenols. The aqueous extract of the fruit (82.6 ± 0.4% DPPH* inhibition; IC50 = 0.39 mg eq. GA/g dry fruit and Fe2+ chelating capacity) administered at 0.77 mM eq. GA managed to inhibit the lipid peroxidation in vivo. The cytotoxic effect was observed at a LC50=0.09 mg eq. GA/mL).]]></p></abstract>
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</front><body><![CDATA[ <p align="justify"><font face="verdana" size="4">Biotecnolog&iacute;a</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="4">&nbsp;</font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="4"><b>Actividad antioxidante y efecto citot&oacute;xico de <i>Cladocolea loniceroides </i>(van Tieghem) Kuijt (Loranthaceae)</b></font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="3"><b>Antioxidant activity and citotoxic effect of<i> Cladocolea loniceroides </i>(van Tieghem) Kuijt (Loranthaceae)</b></font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="2"><b>MJ. Serrano&#150;Maldonado<sup>1</sup>,I. Guerrero&#150;Legarreta<sup>1</sup>, C. de la Paz P&eacute;rez&#150;Olvera<sup>2</sup> y J. Soriano&#150;Santos<sup>1</sup>*</b></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i><sup>1</sup> Departamento de Biotecnolog&iacute;a, Universidad Aut&oacute;noma Metropolitana&#150;Iztapalapa, Av. San Rafael Atlixco, No. 186, Col. Vicentina, Ap. P. 55&#150;535, Deleg. Iztapalapa, CP 09340, M&eacute;xico, D.F., M&eacute;xico. *Autor para la correspondencia. E&#150;mail: </i><a href="mailto:jss@xanum.uam.mx">jss@xanum.uam.mx</a></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i><sup>2</sup> Departamento de Biolog&iacute;a Universidad Aut&oacute;noma Metropolitana&#150;Iztapalapa, Av. San Rafael Atlixco, No. 186, Col. Vicentina, Ap. P. 55&#150;535, Deleg. Iztapalapa, <i>CP 09340, M&eacute;xico, D.F., M&eacute;xico.</i></i></font></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Recibido 11 de Enero 2011.    <br> Aceptado 18 de Abril 2011.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>Resumen</b></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>Cladocolea loniceroides </i>es un mu&eacute;rdago end&eacute;mico de M&eacute;xico que causa p&eacute;rdidas econ&oacute;micas. Para encontrarle una utilidad, el objetivo de este trabajo fue evaluar los polifenoles, especialmente los flavonoides, en extractos acuosos y metan&oacute;licos de hojas, frutos y tallos, as&iacute; como su actividad antioxidante (AAOx) evaluada como % de inhibici&oacute;n del DPPH<sup>&#8226;</sup> ( radical 2,2&#150;difenol&#150;1&#150;picrilhidrazilo). Esto mediante la cuantificaci&oacute;n de malondialdeh&iacute;do producido por la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica en suero de ratas, inducida con 85 mg/k de peso de Fe&#150;dextran intraperitonealmente. Se evalu&oacute; el efecto citot&oacute;xico de los polifenoles en cultivo celular de c&aacute;ncer de mama ZR&#150;75&#150;1, que se determin&oacute; de por su valor CL<sub>50</sub> (concentraci&oacute;n de extracto necesaria para obtener 50% de muerte celular). Los polifenoles totales resultaron (mg eq. AG): fruto&gt;hoja&gt;tallo (189.5&plusmn;4.9; 93.33&plusmn;0.9 y 74.5&plusmn;4.2, respectivamente). La AAOx de extractos acuosos o metan&oacute;licos de hojas, frutos y tallos se debe principalmente a los polifenoles y a su capacidad quelante. El extracto acuoso del fruto (82.6 &plusmn; 0.4% de inhibici&oacute;n DPPH<sup>&#8226;</sup>; CI<sub>50</sub>=0.39 mg eq. AG/g de fruto seco y con capacidad quelante al Fe<sup>2+</sup>) administrado en una concentraci&oacute;n 0.77 mM eq. AG inhibi&oacute; la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica <i>in vivo. </i>El efecto citot&oacute;xico se observ&oacute; a una CL<sub>50</sub>=0.091 mg eq. AG/mL.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>Palabras clave: </b><i>Cladocolea loniceroides, </i>polifenoles, actividad antioxidante, efecto citot&oacute;xico, CL<sub>50</sub>.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>Abstract</b></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>Cladocolea loniceroides </i>is an endemic mistletoe to Mexico which causes economic losses. In order to find out its usefulness, the objective of this work was to assess polyphenols, especially flavonoids, as obtained of aqueous and methanolic extraction of leaf, fruit and stalk, as well as its <i>a</i>ntiox idant <i>a</i>ctivity (AOxA), wh ich was assess<i>e</i>d as % of DPPH<sup>&#8226;</sup> (1,1&#150;diphenyl &#150;2&#150;picrylhydrazyl) inhibition. AOxA was also evaluated through the malondialdehyde content produced by the lipid peroxidation, induced by intraperitoneal injection of iron&#150;dextran, into rat blood serum. The polyphenols citotoxic effect was evaluated on the cellular line ZR&#150;75&#150;1 of breast cancer, which was determined through its LC<sub>50</sub> value (extract concentration that provides 50% of cellular death). Total polyphenols assessed were (mg eq. GA): fruit&gt;leaf&gt;stalk (189.5 &plusmn; 4.9; 93.33&plusmn; 0.9 y 74.5 &plusmn; 4.2 , respectively). AOxA of aqueo us and methanolic extractions of leaf, fruit and stalk is a consequence of the chelating capacity of polyphenols. The aqueous extract of the fruit (82.6 &plusmn; 0.4% DPPH<sup>&#8226;</sup> inhibition; IC<sub>50</sub> = 0.39 mg eq. GA/g dry fruit and Fe<sup>2+</sup> chelating capacity) administered at 0.77 mM eq. GA managed to inhibit the lipid peroxidation <i>in vivo. </i>The cytotoxic effect was observed at a LC<sub>50</sub>=0.09 mg eq. GA/mL)<i>.</i></font></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>Keywords:</b><i> Cladocolea loniceroides, </i>polyphenols, antioxidant activity, cytotoxic effect, LC<sub>50</sub>.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>1 Introducci&oacute;n</b></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">El mu&eacute;rdago es una especie vegetal par&aacute;sita de &aacute;rboles que se nutre a trav&eacute;s de &oacute;rganos invasores llamados haustorios, los cuales penetran para formar interconexiones firmes con el tejido vascular del hospedero, a trav&eacute;s del cual este par&aacute;sito obtiene sus nutrientes y agua, lo que le ocasiona una muerte lenta (Azuma <i>y col., </i>2000). Esta infestaci&oacute;n afecta en forma directa la producci&oacute;n maderera y frut&iacute;cola del pa&iacute;s. Por otro lado, esta planta sirve como alimento de varias especies de aves que consumen los frutos, por lo que no resulta aconsejable su total eliminaci&oacute;n de la zona donde aparece (Cid&#150;Villamil <i>y col., </i>2005; De la Paz P&eacute;rez y Ceja, 2005).</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>Cladocolea loniceroides, </i>una de las 19 especies de este g&eacute;nero, pertenece a la familia de las Loranthaceae que parasitan severamente, entre otros, a miembros del g&eacute;nero <i>Salix </i>como el ahuejote <i>(Salix bonplandiana) </i>distribuido en la zona Chinampera de Xochimilco y en al menos 11 estados de la Rep&uacute;blica Mexicana (Alvarado&#150;Rosales y Saavedra&#150;Romero, 2005). Puesto que no existe un control qu&iacute;mico eficaz de la infestaci&oacute;n &#150; las ramas invadidas se cortan y se apilan a la intemperie representando un foco de contaminaci&oacute;n &#150; es preciso encontrar alguna forma de aprovechamiento y procesamiento de estos residuos. En este sentido Morales&#150;Carballo <i>y col. </i>(2010) han reportado un d&eacute;bil efecto citot&oacute;xico en <i>Artemia salina </i>del extracto metan&oacute;lico del tallo de <i>C. loniceroides </i>atribuyendo este efecto a su contenido de flavonoides. Mientras que en un extracto similar Duran&#150;Rodr&iacute;guez <i>y col. </i>(2010) observaron un efecto antimicrobiano que asociaron al contenido de metabolitos secundarios de polaridad alta. Por otra parte, un extracto acuoso estandarizado del mu&eacute;rdago europeo <i>Viscum album </i>y <i>V. coloratum </i>con actividad citot&oacute;xica, se utiliza en cl&iacute;nicas de Alemania y Suiza desde hace m&aacute;s de 80 a&ntilde;os como coadyuvante en la terapia de diferentes tipos de c&aacute;ncer, especialmente el c&aacute;ncer de mama; en el control de epilepsia, des&oacute;rdenes nerviosos, delirio, asma, hipertensi&oacute;n, dolor de cabeza y dermatitis. (Khwaja, 1996; Tabiasco <i>y col., </i>2002; &Ouml;nay&#150;U&ccedil;ar <i>y col., </i>2006; Pryme, 2009). Este efecto bioactivo es atribuido a viscotoxinas, lectinas y alcaloides (pues se han observado efectos antiproliferativo e inmunomodulador) los cuales pueden reducir efectos mutag&eacute;nicos atribuibles a los radicales libres de diferentes especies de ox&iacute;geno (&Ouml;nay&#150;U&ccedil;ar <i>y col., </i>2006; Urech <i>y col., </i>2007).</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Xochimilco, como patrimonio de la humanidad desde la declaraci&oacute;n de la UNESCO en 1987, debe conservar sus caracter&iacute;sticas particulares de paisaje y cultivos heredados desde &eacute;pocas precolombinas. El paisaje se mantiene gracias a los ahuejotes que sostienen con sus ra&iacute;ces a las chinampas, y proporcionan estabilidad para el cultivo de hortalizas y flores de la zona. Por lo tanto es necesario conservar las chinampas y asegurar una de las principales actividades econ&oacute;micas de sus habitantes: el turismo. El mu&eacute;rdago podr&iacute;a ser fuente de compuestos bioactivos, coadyuvante en el tratamiento de algunas enfermedades cr&oacute;nico degenerativas. El descubrimiento de estas propiedades resulta interesante y &uacute;til particularmente como fuente de AOx naturales, alimentos funcionales y nutrac&eacute;uticos (Miliauskas <i>y col., </i>2004). El perfil de la composici&oacute;n qu&iacute;mica de la planta junto con el conocimiento de su actividad antioxidante (AAOx) puede proporcionar una estimaci&oacute;n de su potencial terap&eacute;utico (Akinmoladun <i>y col., </i>2007). As&iacute;, dada la disponibilidad de residuos de mu&eacute;rdago que podr&iacute;an procesarse para obtener productos de valor agregado con actividad biol&oacute;gica, el objetivo de este trabajo fue evaluar la concentraci&oacute;n de polifenoles totales y flavonoides de diferentes extractos de hojas, frutos y tallos de <i>C. loniceroides, </i>as&iacute; como su actividad antioxidante en un sistema de &oacute;xido&#150;reducci&oacute;n y a trav&eacute;s de la cuantificaci&oacute;n de malondialdeh&iacute;do producido por la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica de &aacute;cidos grasos contenidos en suero de ratas. Tambi&eacute;n se evalu&oacute; el efecto citot&oacute;xico <i>in vitro </i>de los polifenoles y flavonoides en un cultivo de c&eacute;lulas de c&aacute;ncer de mama.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>2 Materiales y m&eacute;todos</b></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.1    Mu&eacute;rdago</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>C. loniceroides </i>fructificado se recolect&oacute; de <i>S. bonplandiana </i>infestados, en tres colectas independientes (muestreo simple aleatorio; Proctor y Meullenet, 2003), los cuales se hallaron en la zona del embarcadero "Nuevo Nativitas", Xochimilco, M&eacute;xico (19&deg; 14' N, 99&deg; 05&#908;, altitud 2273 m) durante el mes de febrero de 2009. La identificaci&oacute;n se realiz&oacute; por el Dr. Miguel Ch&aacute;zaro Baz&aacute;&ntilde;ez de la Universidad de Guadalajara y se deposit&oacute; en el herbario Metropolitano de la Universidad Aut&oacute;noma Metropolitana en su Unidad Iztapalapa "Dr. Ram&oacute;n Riba y Nava Esparza" con el voucher no. 66828. El fruto se encontraba maduro de color rojo caracter&iacute;stico del estado de madurez de este mu&eacute;rdago.    Se lav&oacute; y desinfect&oacute;, sumergiendo las ramas durante 1 h con soluci&oacute;n de NaClO al 0.5%; posteriormente las hojas, tallos y frutos se secaron por separado a temperatura ambiente. Una vez secos se molieron los materiales haci&eacute;ndolos pasar por un tamiz hasta obtener un tama&ntilde;o de part&iacute;cula de 420<i>&#956;</i>m (Quezada y Santa Cruz, 2001). En el caso del fruto, debido a que contiene muc&iacute;lago, no fue posible molerlo pues al hacerlo se obtuvo una pasta en lugar de una harina. Las harinas de tallo y hoja se guardaron en frascos de vidrio &aacute;mbar perfectamente cerrados y se mantuvieron en refrigeraci&oacute;n a 5&deg;C hasta su an&aacute;lisis. La pasta del fruto se utiliz&oacute; de inmediato.</font></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.2 An&aacute;lisis qu&iacute;mico proximal</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">El an&aacute;lisis qu&iacute;mico proximal se llev&oacute; a cabo siguiendo los procedimientos de la AOAC (2000) incluyendo humedad, cenizas, prote&iacute;na cruda, extracto et&eacute;reo y fibra cruda. La concentraci&oacute;n de carbohidratos se calcul&oacute; por diferencia. Todos los an&aacute;lisis de esta investigaci&oacute;n se realizaron por triplicado.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.3 Evaluaci&oacute;n   de polifenoles   totales  y flavonoides</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">La solubilizaci&oacute;n de los polifenoles de cada muestra deshidratada se llev&oacute; a cabo mediante una extracci&oacute;n con metanol de acuerdo a la metodolog&iacute;a propuesta por Miliauskas <i>y col., </i>(2004). En breve: 0.5 g de muestra seca se mezclaron con 10 mL de metanol manteni&eacute;ndose en agitaci&oacute;n por 1 h; este paso se repiti&oacute; dos veces. Posteriormente, cada extracto se centrifug&oacute; a 805 x g y se combinaron los sobrenadantes.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Debido a que el extracto ser&aacute; aplicado en humanos, se procedi&oacute; a obtener una infusi&oacute;n con 0.5 g de la muestra seca en 25 mL de agua desionizada, dejando ebullir durante 5 min. Una vez fr&iacute;a, se filtr&oacute; sobre gasa y se centrifug&oacute; a 805 x g por 5 min.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">La cuantificaci&oacute;n de polifenoles totales, se llev&oacute; a cabo con el reactivo de Folin&#150;Ciocalteau, de acuerdo al m&eacute;todo de Singleton <i>y col., </i>(1999). La mezcla de reacci&oacute;n se form&oacute; con 500 <i>&#956;</i>L del extracto diluido con 4.5 mL de agua desionizada; se agregaron 200 <i>&#956;</i>L de reactivo Folin&#150;Ciocalteu y 500<i> &#956;</i>L de soluci&oacute;n saturada de Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>; despu&eacute;s de agitar los tubos con un Vortex, se adicionaron 4.3 mL de agua desionizada. La absorbencia se determin&oacute; a 765 nm en un espectrofot&oacute;metro (Genesys UV 10) despu&eacute;s de que la mezcla de reacci&oacute;n se mantuvo durante 1 h en la oscuridad. El contenido total de polifenoles se calcul&oacute; en mg equivalentes de &aacute;cido g&aacute;lico (mg eq. AG), para lo cual se construy&oacute; una curva de calibraci&oacute;n de 25 a 200 ppm de AG.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Los flavonoides se cuantificaron de acuerdo con el m&eacute;todo de Garc&iacute;a&#150;Nava (2007) y se utiliz&oacute; rutina (Sigma) como compuesto de referencia. Se tomaron 100 yuL del extracto y se le agregaron 1250 <i>&#956;</i>L de agua desionizada; se mezcl&oacute; con 75 <i>&#956;</i>L de NaNCh al 5%; despu&eacute;s de reposar 6 min, se adicionaron 150 <i>&#956;</i>L de AICI3 al 10% dejando reposar por 5 min. Posteriormente se adicionaron 500 <i>&#956;</i>L de NaOH 1 M y 425 <i>&#956;</i>L de agua desionizada. La absorbencia se determin&oacute; inmediatamente a 510 nm.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.4 Actividad antioxidante</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.4.1 Reducci&oacute;n del DPPH</i><sup>&#8226;</sup></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">El radical 2,2&#150;difenol&#150;l&#150;picrilhidrazilo (DPPH<sup>&#8226;</sup>) en su forma radical tiene color p&uacute;rpura con absorbencia m&aacute;xima a 517 nm. En su forma reducida, despu&eacute;s de la acci&oacute;n de un antioxidante sobre el radical, la disoluci&oacute;n se torna a color amarillo. El cambio de coloraci&oacute;n de este compuesto se monitore&oacute; para determinar la concentraci&oacute;n de las especies reductoras contenidas en los diferentes extractos (Brand&#150;Williams <i>y col., </i>1995). La evaluaci&oacute;n de la reducci&oacute;n del DPPH<sup>&#8226;</sup> se llev&oacute; a cabo como lo reporta Moraes&#150;de&#150;Souza <i>y col. </i>(2008) y se utiliz&oacute; una disoluci&oacute;n de vitamina E (0.01% p/v) como control. La actividad antioxidante se expres&oacute; como el porcentaje de inhibici&oacute;n de la reducci&oacute;n del DPPH<sup>&#8226;</sup> de acuerdo con la siguiente f&oacute;rmula:</font></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p align="center"><font face="verdana" size="2"><img src="/img/revistas/rmiq/v10n2/a2s1.jpg"></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Donde:</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>A<sub>C</sub></i><sub>(0)</sub>= Absorbencia del DPPH en su forma radical (control negativo)</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i><i>A<sub>A</sub></i></i><sub>(</sub><i><sub>t</sub></i><sub>)</sub><i> = </i>Absorbencia de DPPH con muestra despu&eacute;s de 45 min de reacci&oacute;n</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Se calcul&oacute; el valor <i>IC</i><sub>50</sub> que se define como la concentraci&oacute;n de extracto en mg equivalentes de AG/g de muestra que se requiere para inhibir la reducci&oacute;n del 50% de radicales libres DPPH<sup>&#8226;</sup> bajo las condiciones de an&aacute;lisis. El valor se obtuvo por regresi&oacute;n lineal del porcentaje de inhibici&oacute;n <i>versus </i>concentraci&oacute;n del extracto (Tovar&#150;P&eacute;rez <i>y col., </i>2009).</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.5 Actividad quelante de Fe</i><sup>2+</sup></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">El Fe<sup>2+</sup> forma un complejo con ferrozina de color p&uacute;rpura que tiene una absorbencia m&aacute;xima a 562 nm. En presencia de un antioxidante, el Fe<sup>2+ </sup>puede quelarse y la intensidad del color p&uacute;rpura del complejo con ferrozina disminuye proporcionalmente a la concentraci&oacute;n del antioxidante en la muestra de inter&eacute;s (Xie <i>y col., </i>2008).</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Se mezcl&oacute; 1 mL de muestra con 50 <i>&#956;</i>L de FeCi2 2 mM y 1.85 mL de agua destilada. Despu&eacute;s se agregaron 100 <i>&#956;</i>L de soluci&oacute;n de ferrozina 5mM; se dej&oacute; reposar por 10 min a T amb. y se determin&oacute; la absorbencia a 562 nm. El porcentaje de quelaci&oacute;n se calcul&oacute; con la siguiente f&oacute;rmula:</font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="2"><img src="/img/revistas/rmiq/v10n2/a2s2.jpg"></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.6   Actividad antioxidante in vivo</i></font></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p align="justify"><font face="verdana" size="2">S&oacute;lo se evalu&oacute; la actividad antioxidante del extracto acuoso del fruto (EAF) de <i>C. loniceroides </i>por su mayor contenido de flavonoides y porque la extracci&oacute;n se realiz&oacute; en medio acuoso, puesto que se desear&iacute;a administrarlo en humanos. Para la evaluaci&oacute;n de la actividad antioxidante se tom&oacute; como modelo biol&oacute;gico a ratas con peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica inducida. El Fe<sup>2+</sup> y el Fe<sup>3+</sup> se requieren para la cat&aacute;lisis de la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica a trav&eacute;s de la llamada reacci&oacute;n de Fenton que genera especies reactivas de ox&iacute;geno o radicales libres que da&ntilde;an a los l&iacute;pidos de la membrana celular (Morales <i>y col., </i>2009). En este ensayo se evalu&oacute; el efecto de los radicales libres sobre la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica que se indujo por inyecciones intraperitoneales de Fe&#150;dextran <i>in vivo </i>cuantiflcando el malondialdeh&iacute;do (MDA) producido, despu&eacute;s de 192 h de ensayo, como consecuencia de la descomposici&oacute;n de los hidroper&oacute;xidos producidos por la autooxidaci&oacute;n de los &aacute;cidos grasos poliinsaturados. El MDA forma un crom&oacute;foro con el &aacute;cido 2&#150;tiobarbit&uacute;rico (TBA) que se le conoce como sustancias reactivas al TBA (TBARS). Se adapt&oacute; el m&eacute;todo utilizado por El&#150;Haffidi y Ba&ntilde;os (1997) de la siguiente manera: se utilizaron 30 ratas macho de la cepa Wistar de cuatro meses y se distribuyeron en cinco grupos (<a href="#f1">Fig. 1</a>). El grupo A o control positivo estuvo formado por ratas con peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica inducida intraperiotealmente con Fe&#150;dextran; Grupo B o control negativo consisti&oacute; en ratas con alimentaci&oacute;n habitual; Grupo C formado por ratas con administraci&oacute;n intraperitoneal de Dextran&#150;500; Grupo D ratas con peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica inducida y administraci&oacute;n <i>ad libitum </i>de EAF (0.77 mM eq. AG) y Grupo E mismo tratamiento anterior excepto que la concentraci&oacute;n de EAF fue de 1.55 mM eq. de AG. Los Grupos A y B no recibieron EAF. En los Grupos A, D y E se indujo la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica a trav&eacute;s de la administraci&oacute;n de 85 mg de Fe&#150;dextran/k de peso v&iacute;a intraperitoneal a trav&eacute;s de diferentes dosis distribuidas de la siguiente manera (mg de Fe&#150;dextran/ k de peso): al inicio 10, 25 a las 24 h y 50 a las 48 h. En el Grupo C s&oacute;lo se administr&oacute; Dextran&#150;500 en los mismos tiempos que en A, D y E.</font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="2"><a name="f1"></a></font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="2"><img src="/img/revistas/rmiq/v10n2/a2f1.jpg"></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.6.1 Actividad de TBARS</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">La AAOx se evalu&oacute; por medio del registro de la concentraci&oacute;n del malondialdeh&iacute;do en suero al final del tratamiento. Las ratas se sacrificaron por decapitaci&oacute;n despu&eacute;s de 24 h de finalizado el experimento; se recolect&oacute; la sangre en tubos heparinizados mantenidos a 4&deg;C; posteriormente se obtuvo el suero por centrifugaci&oacute;n a 447 x g durante 20 min a 4&deg;C.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Para determinar la concentraci&oacute;n del malondialdeh&iacute;do se utilizaron 100 <i>&#956;</i>L de suero a los que se adicionaron 1 mL de buffer de fosfatos 150 mM a pH 7.4; 1 mL de &aacute;cido ac&eacute;tico al 20% a pH 2.5 y 1.5 mL de TBA al 0.8%; la mezcla de reacci&oacute;n se llev&oacute; a ba&ntilde;o Mar&iacute;a durante 1 h; la reacci&oacute;n se detuvo enfriando la mezcla en ba&ntilde;o de hielo. Posteriormente, se adicionaron 5 mL de n&#150;butanol con agitaci&oacute;n en Vortex; la mezcla se centrifug&oacute; a 358 x g a temperatura ambiente durante 2 min y el sobrenadante se recuper&oacute; para analizarse por cromatograf&iacute;a l&iacute;quida de alta resoluci&oacute;n (HPLC).</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">El crom&oacute;foro, resultado de la reacci&oacute;n entre el MDA y el TBA, con un tiempo de retenci&oacute;n de 2.3 min se registr&oacute; a 532 nm en un HPLC (Waters 996 PDA HPLC System) adaptado con una columna Resolve C<sub>18</sub> (150 x 3.9 mm), la cual se equilibr&oacute; con una mezcla de buffer de fosfatos 50 mM a pH 6.8 y metanol (70:30). Se inyectaron 5 <i>&#956;</i>L del sobrenadante y las muestras se eluyeron con un flujo de 0.8 mL/min bajo condiciones isocr&aacute;ticas. La curva est&aacute;ndar se construy&oacute; con tetraetoxipropano (0&#150;388 <i>&#956;</i>g/mL) siguiendo la t&eacute;cnica descrita anteriormente. El valor de la &#913;&#913;&#927;&#967; se expres&oacute; como mg equivalentes de MDA (TBARS) por mL de suero.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.7   Efecto citot&oacute;xico</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">El efecto citot&oacute;xico del EAF se evalu&oacute; en un cultivo celular de la l&iacute;nea ZR&#150;75&#150;1 de c&aacute;ncer de mama ductal humano, siguiendo la metodolog&iacute;a de Garc&iacute;a&#150;Gasea <i>y col. </i>(2002). Las c&eacute;lulas se cultivaron en medio Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) enriquecido con 10% de suero fetal bovino en cajas de 6 mm con 4 mL de medio a 36&deg; C en atm&oacute;sfera de CO<sub>2</sub>.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Para la evaluaci&oacute;n del efecto citot&oacute;xico se sembraron 30,000 c&eacute;lulas por pozo en placas de 24 pozos. Despu&eacute;s de 48 h se realiz&oacute; el cambio de medio de cultivo, reemplazando el suero fetal bovino por alb&uacute;mina s&eacute;rica bovina al 0.5% en el medio DMEM, conteniendo el EAF a 0.01, 0.1, 1.0 y 10.0 mg eq. AG/mL de medio de cultivo. Despu&eacute;s de 24 h del tratamiento con EAF, se realiz&oacute; el conteo directo de c&eacute;lulas en una c&aacute;mara de Neubauer. Posteriormente, se determin&oacute; el valor CL<sub>50</sub> (concentraci&oacute;n de extracto necesaria para obtener 50% de muerte celular) que se obtuvo de la linearization de la curva dosis&#150;respuesta.</font></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>2.7.1 An&aacute;lisis estad&iacute;stico</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">A los resultados se aplic&oacute; una prueba de an&aacute;lisis de varianza de una sola v&iacute;a (ANOVA) seguido de la prueba de comparaci&oacute;n m&uacute;ltiple de Tukey con un nivel de significancia p&lt; 0.05 (SAS, 1996).</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>3 Resultados y discusi&oacute;n</b></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>3.1    An&aacute;lisis qu&iacute;mico proximal</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">En el <a href="/img/revistas/rmiq/v10n2/a2c1.jpg" target="_blank">Cuadro 1</a> se muestra el an&aacute;lisis de hoja, tallo y fruto. No se tienen reportes previos del an&aacute;lisis qu&iacute;mico proximal de <i>C. loniceroides. </i>Sin embargo an&aacute;lisis qu&iacute;micos realizados a <i>V. album </i>en diferentes estados de desarrollo de la planta completa (Derya&#150;Umucalilar <i>y col., </i>2007) mostraron contenidos de prote&iacute;na cruda (5.3 a 6.9%); fibra (2.9 a 3.1%); extracto et&eacute;reo (6.9 a 7.4%) y cenizas (7.9 a 12.8%). En todos los casos los contenidos de nutrimentos son m&aacute;s altos en las diferentes secciones de <i>C. loniceroides, </i>excepto en el contenido de cenizas donde la concentraci&oacute;n en hoja y fruto fue baja. Urnes (1969) encontr&oacute; en mu&eacute;rdagos de Arizona, <i>Phoradendron </i>sp. y <i>Arceuthobium </i>sp., contenidos de prote&iacute;na cruda de 15 a 25%. El fruto produce un muc&iacute;lago llamado viscina, que le permite adherirse al &aacute;rbol hospedero para comenzar su desarrollo, que en <i>V. album </i>est&aacute; compuesto por celulosa en una mezcla de polisac&aacute;ridos &aacute;cidos y neutros llamado viscano, el cual es soluble en agua (Azuma <i>y col., </i>2000). Sin embargo, la sustancia mucilaginosa encontrada en los frutos de <i>C. loniceroides, </i>fue muy soluble en &eacute;ter et&iacute;lico, por lo que elev&oacute; la concentraci&oacute;n del extracto et&eacute;reo. Lo anterior mostr&oacute; que los compuestos solubilizados fueron apolares contrariamente a lo esperado para la viscina de naturaleza polar.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>3.2    Contenido de polifenoles totales</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">En el <a href="/img/revistas/rmiq/v10n2/a2c2.jpg" target="_blank">Cuadro 2</a> se muestra la concentraci&oacute;n de polifenoles totales de las extracciones acuosas (EA) y metan&oacute;licas (EM) de materiales deshidratados de hoja, tallo y frutos. La EM del fruto contiene la mayor concentraci&oacute;n de polifenoles totales, seguida de la extracci&oacute;n acuosa del tallo y hoja. En t&eacute;rminos generales en el tallo y hoja los polifenoles fueron muy polares ya que el agua fue capaz de extraer una mayor cantidad, mientras que en el fruto hay una mayor cantidad de polifenoles menos polares. Ademiluyi y Oboh (2008) han reportado concentraciones muy bajas de polifenoles totales (160 a 180 mg/100 g) en extractos metan&oacute;licos de hojas de <i>V. album</i>, la diferencia puede deberse a que utilizaron &aacute;cido t&aacute;nico en lugar de &aacute;cido g&aacute;lico para expresar la concentraci&oacute;n de estos compuestos.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">El mismo comportamiento que se describi&oacute; para los polifenoles, se observ&oacute; al comparar el contenido de flavonoides. En EA de tallo y hojas se encontr&oacute; mayor concentraci&oacute;n de flavonoides mientras que en el fruto el EM contiene mayor concentraci&oacute;n de flavonoides (p&lt;0.05). La concentraci&oacute;n de flavonoides fue relativamente baja en comparaci&oacute;n con la cantidad de polifenoles totales en cada secci&oacute;n de la planta, por lo que los polifenoles deben consistir de otras familias de compuestos fen&oacute;licos. Dur&aacute;n <i>y col.</i> (2010) realizaron pruebas cualitativas de polifenoles y mencionan que los compuestos bioactivos de <i>C. loniceroides</i> est&aacute;n integrados por antraquinonas, saponinas, taninos, alcaloides y lectinas, mientras que Morales <i>y col.</i> (2010), tambi&eacute;n con an&aacute;lisis cualitativos, hacen referencia en esta especie a otros metabolitos secundarios como terpenos, flavonoides y gluc&oacute;sidos. A diferencia de estos autores quienes consideran a los flavonoides como los principales polifenoles, en este trabajo, el contenido observado fue bajo. En un estudio comparativo, se evalu&oacute; el contenido de &aacute;cidos fen&oacute;licos de varias especies de mu&eacute;rdago que infestan diferentes &aacute;rboles, se observ&oacute; que la cantidad y contenido de polifenoles depende del hospedero. En cada planta de mu&eacute;rdago se encontraron en promedio entre 12 y 15 polifenoles, logr&aacute;ndose detectar hasta 21 fenoles diferentes en su forma glucos&iacute;dica o de aglic&oacute;n, por lo que C. loniceroides podr&iacute;a ser una fuente importante de antioxidantes naturales (Chen <i>y col.</i>, 2004; Wolfe y Hai, 2007; Luczkkiewicz <i>y col.</i>, 2001).</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>3.3 Actividad antioxidante</i></font></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p align="justify"><font face="verdana" size="2">Cuando se evalu&oacute; la actividad antioxidante, expresado en porcentaje de inhibici&oacute;n de DPPH<sup>&#8226;</sup>, de los diferentes EA y EM de hoja, tallo y fruto de <i>C. loniceroides </i>(<a href="#c3">Cuadro 3</a>) se observ&oacute; que los EAT y EMT tuvieron AAOx significativamente superior al resto de los extractos (p&lt; 0.05) y similar a la AAOx de un est&aacute;ndar de Vitamina E. El EMT present&oacute; el menor IC<sub>50</sub> de todos los extractos ensayados, lo cual mostr&oacute; su gran AAOx. En t&eacute;rminos generales los EM y EA de H, T y F tuvieron buena AAOx puesto que a concentraciones peque&ntilde;as (0.07&#150;0.81 mg eq. de AG/mL) inhiben el 50% de los radicales DPPH<sup>&#8226;</sup>. Sin embargo los EMH y EMF, a pesar de tener alrededor del 83 % de inhibici&oacute;n de DPPH<sup>&#8226;</sup>, observaron valores de IC50 un orden de magnitud mayor que el resto de los extractos pero de dos &oacute;rdenes de magnitud con respecto a la Vitamina E, por lo cual resultar&iacute;an menos eficaces al aplicarse en un sistema de &oacute;xido&#150;reducci&oacute;n. &Ouml;nay&#150;U&ccedil;ar <i>y col. </i>(2006) informaron que extractos metan&oacute;licos de hojas de <i>V. album </i>ssp. &aacute;<i>lbum </i>mostraron del 59 a 95 % de inhibici&oacute;n de DPPH<sup>&#8226;</sup>, incluso mayor que la vitamina E y 3&#150;ter&#150;butil&#150;4&#150;hidroxianisol que utilizaron como controles. Los porcentajes de inhibici&oacute;n de DPPH<sup>&#8226;</sup> para extractos metan&oacute;licos de diversas plantas medicinales y arom&aacute;ticas van de 7 al 94% por lo que los extractos de H, T y F de <i>C. loniceroides </i>poseen una excelente AAOx (&gt; 77%), aunque sus valores de IC<sub>50</sub> fueron de un orden de magnitud mayor que antioxidantes como &aacute;cido asc&oacute;rbico, vitamina E, quercetina, &aacute;cido fer&uacute;lico, etc. (IC<sub>50</sub> =4&#150;31 <i>&#956;</i>g/mL; Miliauskas <i>y col., </i>2004).</font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="2"><a name="c3"></a></font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="2"><img src="/img/revistas/rmiq/v10n2/a2c3.jpg"></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>3.4 Actividad quelante de Fe</i><sup>2+</sup></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Evaluar la capacidad quelante sobre iones met&aacute;licos es de suma importancia debido a que los metales, especialmente el Fe<sup>2+</sup>, son capaces de iniciar las reacciones de peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica de &aacute;cidos grasos insaturados y algunos polifenoles poseen la capacidad de quelar diferentes iones met&aacute;licos con lo que evitan el deterioro de los l&iacute;pidos. Para este fin se midi&oacute; la actividad quelante de los extractos de mu&eacute;rdago dependiente de la concentraci&oacute;n de polifenoles totales (0&#150;20 mg eq. AG/mL), de la misma manera que lo realiza el EDTA (0&#150;20 mg eq. AG/mL) que se utiliz&oacute; como quelante de referencia. Sin embargo, los extractos requirieron concentraciones de un orden de magnitud superior al EDTA para tener un efecto similar.    A 20 <i>&#956;</i>g/mL de EDTA se obtuvo el 90% de quelaci&oacute;n de Fe<sup>2+</sup>, pero para obtener el 80% de quelaci&oacute;n se requirieron 20 mg eq. de AG/mL de extracto. Ademiluyi y Oboh (2008) encontraron del 60 al 75% de quelaci&oacute;n Fe<sup>2+</sup> en extractos metan&oacute;licos de hojas de <i>V. album </i>(10 mg/mL).</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>3.5 Actividad antioxidante in vivo</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Por la capacidad que mostraron los diferentes extractos de H, T y F de quelar el Fe<sup>2+</sup>, se utilizaron ratas a las que se les indujo la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica a trav&eacute;s de la administraci&oacute;n gradual de este metal. Para este prop&oacute;sito se descartaron los extractos metan&oacute;licos (por ser un disolvente t&oacute;xico) por lo que en el ensayo se utiliz&oacute; el EAF ya que conten&iacute;a la mayor cantidad de flavonoides, de los extractos acuosos analizados. El Fe<sup>2+</sup> cataliza la etapa inicial de la autooxidaci&oacute;n de l&iacute;pidos y produce malondialdeh&iacute;do como producto de descomposici&oacute;n de los hidroper&oacute;xidos, por lo que el malondialdeh&iacute;do es un excelente metabolite marcador para la evaluaci&oacute;n de la AAOx. En la <a href="#f1">Fig. 1</a> se observa que la administraci&oacute;n <i>ad libitum </i>del EAF (0.77 &oacute; 1.55 mM eq. de AG; Grupos D y E) inhibi&oacute; la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica (p&lt; 0.05); se observ&oacute; que la administraci&oacute;n de Fe<sup>2+</sup> no logr&oacute; inducir la autooxidaci&oacute;n de los &aacute;cidos grasos insaturados m&aacute;s all&aacute; de lo que se produce con una dieta habitual (Grupo B). Al parecer una concentraci&oacute;n menor de polifenoles del EAF (Grupo D) tiene mayor capacidad de quelar el Fe<sup>2+</sup> que una concentraci&oacute;n mayor (Grupo E). El EAF mostr&oacute; una excelente AAOx en el modelo biol&oacute;gico utilizado y esta actividad es la consecuencia no s&oacute;lo de la capacidad quelante de Fe<sup>2+</sup>, sino tambi&eacute;n de su gran capacidad reductora. En el laboratorio se realiz&oacute; un estudio comparativo de la AAOx de todos los extractos de <i>C. loniceroides </i>en diferentes sistemas de &oacute;xido&#150;reducci&oacute;n (resultados no mostrados) concluy&eacute;ndose que contienen compuestos que act&uacute;an como antioxidantes primarios y/o secundarios, lo cual refuerza la observaci&oacute;n de la gran capacidad de inhibici&oacute;n <i>in vivo </i>de la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica.</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><i>3.6 Efecto citot</i>&oacute;<i>xico</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">Braun <i>y col. </i>(2001) han reportado que extractos acuosos estandarizados de <i>V. album </i>han sido utilizados como coadyuvantes en el tratamiento de diversas enfermedades cr&oacute;nico degenerativas, entre ellas el c&aacute;ncer de mama. En este estudio se evalu&oacute; el efecto citot&oacute;xico del EAF sobre la l&iacute;nea celular ZR&#150;75&#150;1 de c&aacute;ncer de mama ductal humano. En la <a href="#f2">Fig. 2</a> se muestra el efecto citot&oacute;xico sobre este cultivo celular y se observa que las concentraciones de extracto utilizadas (0.01&#150;10 mg eq. de AG/mL) tienen un efecto letal sobre esas c&eacute;lulas cancerosas. La muerte celular se present&oacute; desde la concentraci&oacute;n m&aacute;s baja de EAF y el valor CL<sub>50</sub> fue de 0.091 mg eq. AG/mL de medio de cultivo. El efecto letal puede relacionarse principalmente a la excelente AAOx que tiene <i>C. loniceroides. </i>La lectina&#150;I <i>&#946;</i>&#150;galact&oacute;sido espec&iacute;fico de mu&eacute;rdago es uno de los constituyentes de los extractos de uso cl&iacute;nico por sus acciones inmunomoduladora y antimetast&aacute;tica probadas (Beuth, 1997; Braun <i>y col., </i>2001). Sin embargo, en este estudio no se encontr&oacute; la presencia de prote&iacute;nas hidrosolubles (alb&uacute;minas) en los extractos, por lo que se descart&oacute; la presencia de viscotoxinas y lectinas como componentes principales (ya que en <i>V. album </i>se les atribuye la actividad biol&oacute;gica). Azuma <i>y col. </i>(2000) encontraron que el muc&iacute;lago contiene un polisac&aacute;rido conocido como viscano, el cual es soluble en agua y esencialmente libre de prote&iacute;na, lo que concuerda con este estudio donde s&oacute;lo se ensay&oacute; un extracto acuoso del fruto. Al parecer la mayor&iacute;a de prote&iacute;nas del mu&eacute;rdago son solubles en soluciones salinas (globulinas; Pryme, 2009). Tambi&eacute;n se ha mencionado que los compuestos biol&oacute;gicamente activos pueden transferirse del hospedero a la planta par&aacute;sita y como resultado la actividad biol&oacute;gica de la segunda puede diferir, por ejemplo las propiedades inductoras de apoptosis as&iacute; como los compuestos anticancerosos de extractos estandarizados comerciales como Iscador y Helixor de <i>V. album </i>son dependientes del hospedero (&Ouml;nay&#150;U&ccedil;ar <i>y col., </i>2006; Urech <i>y col., </i>2007). El extracto acuoso del fruto de <i>C. loniceroides </i>podr&iacute;a utilizarse para la obtenci&oacute;n de una preparaci&oacute;n comercial que contribuya al tratamiento de c&aacute;ncer de mama y de esta manera procesar los residuos para disminuir este foco de contaminaci&oacute;n de la zona.</font></p>     <p align="center"><font face="verdana" size="2"><a name="f2"></a></font></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p align="center"><font face="verdana" size="2"><img src="/img/revistas/rmiq/v10n2/a2f2.jpg"></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>Conclusi&oacute;n</b></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">El mu&eacute;rdago <i>C. loniceroides </i>que infesta a los ahuejotes de la zona chinampera de Xochimilco es una fuente para la obtenci&oacute;n de extractos que contienen polifenoles. La actividad antioxidante de extractos acuosos y metan&oacute;licos de hojas, tallos y frutos se debe principalmente a los polifenoles que fueron cuantificados y a su capacidad de quelaci&oacute;n del Fe<sup>2+</sup>, los cuales le confieren en parte el efecto citot&oacute;xico sobre c&eacute;lulas de c&aacute;ncer de mama ductal. Particularmente el extracto acuoso del fruto tuvo la capacidad de inhibir la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica, que se indujo por inyecci&oacute;n intraperitoneal de Fe&#150;dextran, de los triglic&eacute;ridos contenidos en suero de ratas que ingirieron el extracto acuoso <i>ad libitum.</i></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>Nomenclatura</b></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><img src="/img/revistas/rmiq/v10n2/a2n1.jpg"></font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2">&nbsp;</font></p>     <p align="justify"><font face="verdana" size="2"><b>Referencias</b></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Ademiluyi, A. O. y Oboh G. (2008). Antioxidant properties of methanolic extracts of mistletoe <i>(Viscum album) </i>from cocoa and cashew trees in Nigeria. <i>African Journal of Biotechnology 7, </i>3138&#150;3142.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547960&pid=S1665-2738201100020000200001&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Akinmoladun, A., Ibukun, E. y Farombi, E. (2007). Chemical constituents and antioxidant activity of <i>Alstonia boonei. African Journal of Biotechnology 6, </i>1197&#150;1201.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547962&pid=S1665-2738201100020000200002&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Alvarado&#150;Rosales, D. y Saavedra&#150;Romero, L. (2005). El g&eacute;nero Cladocolea (Loranthaceae) en M&eacute;xico: Mu&eacute;rdago verdadero o injerto. Revista Chapingo. <i>Serie Ciencias Forestales y del Ambiente 11</i>, 5&#150;9.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547964&pid=S1665-2738201100020000200003&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">A.O.A.C. (2000). <i>Official Methods of Analysis</i>. Association of Official Analytical Chemists.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547966&pid=S1665-2738201100020000200004&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Azuma, J., Kim, N., Heux, L., Vuong, R. y Chanzy, H. (2000). The cellulose system in viscin from mistletoe berries. <i>Cellulose 7</i>, 3&#150;19.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547968&pid=S1665-2738201100020000200005&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Beuth, J. (1997). Clinical relevance of immunoactive mistletoe lectin&#150;I. <i>Anticancer Drugs 1</i>, S53&#150;S55.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547970&pid=S1665-2738201100020000200006&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Brand&#150;Williams, W., Cuvelier, E. y Berset, C. (1995). Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. <i>Lebensmittel&#150;Wissenschaft Technologie 28</i>, 25&#150;30.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547972&pid=S1665-2738201100020000200007&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Braun, J. M., Ko, H. L., Schierholz, J. M., Weir, D., Blackwell, C. c. y Beuth, J. (2001). Application of standardized mistletoe extracts augment immune response and down regulates metastatic organ colonization in murine models. <i>Cancer Letters 170</i>, 25&#150;31.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547974&pid=S1665-2738201100020000200008&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Camacho&#150;Luis, A., Mendoza&#150;P&eacute;rez, J. (2009). La naturaleza ef&iacute;mera de los radicales libres. Qu&iacute;mica y bioqu&iacute;mica de los radicales libres. En: <i>Los antioxidantes y las enfermedades cr&oacute;nico degenerativas</i>, (J. Morales&#150;Gonz&aacute;les, A. Fern&aacute;ndez&#150;S&aacute;nchez, M. Bautista&#150;&Aacute;vila, N. Vargas&#150;Mendoza y E. Madrigal&#150;Santill&aacute;n, eds.), Pp. 27&#150;76. Universidad Aut&oacute;noma del Estado de Hidalgo, M&eacute;xico.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547976&pid=S1665-2738201100020000200009&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Chen, I., Chang, H., Yang, H. y Chen, G. (2004). Evaluation of total antioxidant activity of several popular vegetables and Chinese herbs: a fast approach with ABTS/H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>/HRP system in microplates. <i>Journal of Food and Drug Analysis 12</i>, 29&#150;33.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547978&pid=S1665-2738201100020000200010&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Cid&#150;Villamil, R., Ponce S. y Engleman, M. (2005). Germination of <i>Cladocolea loniceroides</i> (van Tieghem) Kuijt (Loranthaceae). 17&#150;23 julio. Viena, Austria: <i>XVII International Botanical Congress</i>.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547980&pid=S1665-2738201100020000200011&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">De la Paz&#150;P&eacute;rez, C. y Ceja, J. (2005). Branches anatomy of <i>Fraxinus uhdei</i> (Wenzing) Lingelsheim    and    <i>Prunus    persica</i>    Batsch. infected by Cladocolea spp. (Mistletoe). 17&#150;23 Julio. Viena, Austria: <i>XVII International Botanical Congress</i>.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547982&pid=S1665-2738201100020000200012&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Derya&#150; Umucalilar, D. H., G&uuml;lsen, N., Coskun, B., Hayirli, A. y Dural, H. (2007) Nutrient composition of mistletoe (<i>Viscum album</i>) and its nutritive value for ruminant animals. <i>Agroforest System 71</i>, 77&#150;87.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547984&pid=S1665-2738201100020000200013&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Dur&aacute;n&#150;Rodr&iacute;guez, G. E., Z&uacute;&ntilde;iga&#150;Ru&iacute;z, B., Mu&ntilde;oz&#150;Ocotero, V., Herrera&#150;Santoyo, J. Guevara&#150;Fefer, P y P&eacute;rez Amador, M. C. (2010). <i>Cladocolea loniceroides</i> (Loranthaceae), hemipar&aacute;sita con actividad antimicrobiana. 21&#150;27 noviembre. Guadalajara, M&eacute;xico. <i>XVIII Congreso Mexicano de Bot&aacute;nica</i>.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547986&pid=S1665-2738201100020000200014&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">El&#150;Haffidi, M. y Ba&ntilde;os, G. (1997). <i>in vivo</i> plasma lipid oxidation in sugar&#150;induced rat hypertriglyceridemia and hypertension. <i>Hypertension 30</i>, 624&#150;628.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547988&pid=S1665-2738201100020000200015&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Garc&iacute;a&#150;Gasca, T., Salazar&#150;Olivo, L., Mendiola&#150;Olaya, E y Blanco&#150;Labra, A. (2002). The effects of a protease inhibitor fraction from tepary bean (<i>Phaseolus acutifolius</i>) on<i> in vitro</i> cell proliferation and cell adhesion of transformed cells. <i>Toxicology in vitro 16</i>, 229&#150;233.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547990&pid=S1665-2738201100020000200016&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Garc&iacute;a&#150;Nava, M. (2007). Cuantificaci&oacute;n de fenoles y flavonoides totales en extractos   naturales. <i>Primer   Verano   de Introducci&oacute;n a la Investigaci&oacute;n de la Universidad Aut&oacute;noma de Quer&eacute;taro</i>. <a href="http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-2007/56_1UAQGarciaNava.pdf" target="_blank">http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias&#150;2007/56_1UAQGarciaNava</a></font>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547992&pid=S1665-2738201100020000200017&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --><!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Gedalovich&#150;Shedletzky, E., Delmer, D. P. y Kuijt, J. (1988). Chemical composition of viscin mucilage from three mistletoe species. A comparison. <i>Annals of Botany 64</i>, 249&#150;252.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547993&pid=S1665-2738201100020000200018&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Khwaja, T.A. (1996). Pharmaceutical preparations derived from European mistletoe. U.S. Patent 5, 547&#150;674.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547995&pid=S1665-2738201100020000200019&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Luczkiewicz, M., Cisowski, W., Kaiser, P., Ochocka, R. y Piotrowski, A. (2001). Comparative analysis of phenolic acids in mistletoe plants from various hosts. <i>Acta Poloniae Pharmaceutica&#150;Drug Research 5</i>, 373&#150;379.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547997&pid=S1665-2738201100020000200020&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Miliauskas, G., Venskutonis, P. y Van Beek, T. (2004). Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts. <i>Food Chemistry 85, </i>231&#150;237.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8547999&pid=S1665-2738201100020000200021&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     ]]></body>
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<body><![CDATA[<!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Quezada, J. y Santa Cruz, M. (2001). Evaluaci&oacute;n de la respuesta de la <i>Begonia rex </i>a la variaci&oacute;n de medios y reguladores de crecimiento en t&eacute;cnicas de cultivo de hojas <i>in vitro. Bioqu</i>&iacute;<i>mica y Farmacia de Bolivia 9, </i>79&#150;84.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8548011&pid=S1665-2738201100020000200027&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">SAS. (1996). SAS/STAT Software: Release 6.11 SAS Inst. Inc. Cary, NC.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8548013&pid=S1665-2738201100020000200028&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Singleton, V., Orthofer, R. y Lamuela&#150;Raventos, R. (1999). Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin&#150;Ciocalteu reagent. <i>Methods in Enzymology 299</i>, 152&#150;178.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8548015&pid=S1665-2738201100020000200029&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Tabiasco, J., Pont, F., Fourni&eacute;, J. y Vercellone, A. (2002). Mistletoe viscotoxins increase natural killer cell&#150;mediated cytotoxicity. <i>European Journal of Biochemistry 269</i>, 2591&#150;2600.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8548017&pid=S1665-2738201100020000200030&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Tovar&#150;P&eacute;rez, E., Guerrero&#150;Legarreta, I., Farr&eacute;s&#150;Gonz&aacute;lez, A. y Soriano&#150;Santos, J. (2009). Angiotensin I&#150;converting enzyme&#150;inhibitory peptide fractions from albumin 1 and globulin as obtained of amaranth grain. <i>Food Chemistry 116</i>, 437&#150;444.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8548019&pid=S1665-2738201100020000200031&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Urech, K., J&auml;ggy, C. y Schaller, G. (2007). Viscotoxin and mistletoe lectin contents in <i>Viscum album</i> L.&#150;Pharmaceutical implications. <i>Phytomedicine 14</i>, 16.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8548021&pid=S1665-2738201100020000200032&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Urnes, P. T. (1969). Nutritional analyses and in vitro digestibility of mistletoes browsed by deer in Arizona. <i>The Journal of Wildlife Management 33</i>, 499&#150;505.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8548023&pid=S1665-2738201100020000200033&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Wolfe, K. y Hai, R. (2007). Cellular antioxidant activity (CAA) assay for assessing antioxidants, foods and dietary supplements. <i>Journal of Agricultural and Food Chemistry 30</i>, A&#150;L.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8548025&pid=S1665-2738201100020000200034&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>     <!-- ref --><p align="justify"><font face="verdana" size="2">Xie, Z., Huang. J., Xu, X. y Jin, Z. (2008). Antioxidant activity of peptides isolated from alfalfa leaf protein hydrolysate. <i>Food Chemistry 111</i>, 370&#150;376.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=8548027&pid=S1665-2738201100020000200035&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></font></p>      ]]></body><back>
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