Análisis de la resistencia en pomelo y limón mexicano transformados con el gen p25 del Citrus tristeza virus

Resistance analysis in grapefruit and mexican lime transformed with the p25 Citrus tristeza virus gen

Emiliano Loeza–Kuk^1*, María A. Gutiérrez–Espinosa², Daniel L. Ochoa–Martínez³, Ángel Villegas–Monter², Gustavo Mora–Aguilera³, Elvia C. Palacios–Torres³, Eugenio Pérez–Molphe–Balch⁴

¹ Campo Experimental Mocochá, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. 97454. Km. 25 Carretera Mérida–Motul, Yucatán.

² Programa de Fruticultura, Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

⁴ Universidad Autónoma de Aguascalientes. Avenida Universidad 940. 20100. Aguascalientes, México.

Recibido: Febrero, 2010.
Aprobado: Enero, 2011.

Resumen

En el manejo de la tristeza de los cítricos se ha recurrido a patrones tolerantes, pero tienen menor plasticidad que C. aurantium y la protección cruzada es superada en ocasiones por variantes más severas. Una alternativa puede ser plantas transgénicas con resistencia derivada del patógeno (PDR por sus siglas en inglés). Para evaluar la PDR conferida con la transgénesis plantas de Citrus parodisiy C. aurantifolia, transformadas vía Agrobacterium tumefaciens y A. rhizogenes con el gen p25 del Citrus tristeza virus (CTV), fueron multiplicadas en C. aurantium. y C. volkameriana e inoculadas por injerto y transmisión con Aphis gossypii con aislamientos mexicanos de CTV para determinar su resistencia. El diseño experimental usado fue completamente al azar en un arreglo en factorial con tres repeticiones por tratamiento. El comportamiento de las plantas, evaluado por PCR en tiempo real con SYBR–green para el gen p18, indicó que 90 d después de la inoculación las transgénicas de C. paradisi tuvieron menor concentración del virus que las no transformadas, mientras que C. aurantifolia permitió una replicación similar a las plantas no transformadas. Comportamiento similar se observó in vitro con los mismos materiales. El análisis de los resultados sugiere una posible resistencia derivada del patógeno en las líneas de pomelo transgénicas evaluadas.

Palabras clave: resistencia derivada del patógeno, cítricos transgénicos, PCR tiempo real, cuantificación viral.

In citrus tristeza management tolerant rootstocks have been used, but have less plasticity than C. aurantium, and cross–protection sometimes is overcome by more severe variants. An alternative may be transgenic plants with pathogen–derived resistance PDR. To evaluate the conferred PDR with transgenesis plants of Citrus paradisi and C. aurantifolia, transformed via Agrobacterium tumefaciens and A.rhizogenes with the p25 gene of the Citrus tristeza virus (CTV), were multiplied in C. aurantium and C. volkameriana and inoculated by grafting and with Aphis gossypii using Mexican isolates of CTV to determine their resistance. The experimental design was completely randomized in a factorial arrangement with three replicates by treatment. The plant behavior, evaluated by real–time PCR with SYBR ^® Green for the p18 gene, indicated that 90 d after inoculation, the C. paradisi transgenics had lower virus concentration than those non–transformed, while C. aurantifolia allowed replication similar to non–transformed plants. Similar behavior was observed in vitro with the same materials. The analysis of results suggest a possible pathogen–derived resistance in the transgenic grapefruit lines evaluated.

Key words: pathogen–derived resistance, transgenic citrus, realtime PCR, viral quantification.

INTRODUCCIÓN

La transformación genética de especies citrícolas, con el propósito de conferir resistencia al Citrus tristeza virus (CTV), es una opción para el mejoramiento convencional debido al control en el proceso de incorporación de un gen de interés (Gutiérrez–E. et al., 1997; Pérez–Molphe–Balch y Ochoa–Alejo, 1998; Domínguez et al., 2002). Por razones de bioseguridad, la evaluación de la resistencia en transgénicos se ha realizado en condiciones confinadas, lo que limita reproducir el proceso natural de infección por vectores y controlar la carga de inoculo vía injerto. En consecuencia, los resultados no han sido concluyentes y la posible resistencia conferida es superada debido al método de inoculación (Domínguez et al., 2002; Febres et al., 2008).

En México, el uso de materiales transgénicos está sujeto a regulación oficial (Diario Oficial de la Federación, 2005). Por tanto, una alternativa para evaluar la PDR conferida es la cuantificación de la expresión del gen de interés por medio de técnicas moleculares específicas o por métodos cuantitativos.

El grupo interdisciplinario de cítricos del Colegio de Postgraduados ha generado plantas transgénicas con el gen p25, doble construcción de las expresiones proteicas p25 y p27, y el extremo 3' tanto en sentido como en antisentido del genoma del CTV (Palacios–Torres et al., 2001), las cuales se han corroborado mediante PCR y análisis Southern pero no en condiciones de infección inducida. El objetivo de este estudio fue evaluar la resistencia a la infección/ replicación del CTV en plantas transformadas genéticamente con el gen p25 (capa proteica) en dos líneas de pomelo (Citrus paradisi Macf.) cv. Star Ruby y una selección de limón mexicano [Citrus aurantifolia (Christm.) Swing] mediante injerto y el vector Aphis gossypii, usando PCR en tiempo real para cuantificar el nivel replicativo del virus. La hipótesis fue que las plantas transgénicas podrán impedir o reducir la replicación del CTV.

MATERIALES Y MÉTODOS

Segmentos de plántulas de pomelo cv. Star Ruby se inocularon con la cepa EHA 101 de Agrobacterium tumefaciens, la cual incluyó el plásmido pGA482GG con los genes gus, nptII, gentamicina y p25 del CTV obtenidos del aislamiento T–36 de sintomatología severa y originario de Florida (Gutiérrez et al., 1997). Los brotes regenerados fueron evaluados para detectar los transgénicos (Palacios–Torres et al., 2001).

Además, se inocularon segmentos de limón mexicano con la cepa A4 de A. rhizogenes mediante el procedimiento de Pérez–Molphe–Balch y Ochoa–Alejo (1998). En este caso la cepa incluyó el plásmido binario pGA482GG–B249CP, con los genes de nptII, gus y el gen p25 del aislamiento B–249 originario de Venezuela y que causa picado de tallo (Febres et al., 2003).

De las plantas transgénicas obtenidas se eligieron dos líneas de pomelo cv. Star Ruby (CpP1 y CpP2) y una de limón mexicano (CpL) con acumulación de proteína producto del gen de la capa proteica y una copia de T–ADN detectados en análisis Western y Southern. Plantas de pomelo (P) y limón mexicano (L) sin transformar se incluyeron como testigos en el ensayo de inoculación. También se incluyeron testigos sin transformar y sin inocular de pomelo (Psi) y limón (Lsi).

Inoculación in vitro de plantas transgénicas

Un total de 60 explantes de CpPl, CpP2, CpL, P y L (12 secciones de tallo por cada uno), desinfectados, sin hojas y con una yema se sembraron en tubos con 50 mL de medio semisólido Murashige y Skoog (1962).

Una vez que se obtuvo la brotación, cada explante se inoculó por injerto de una porción de tallo de material infectado con aislamiento severo de CTV con baja prevalencia (GIIC–Tam1) y no severo de alta prevalencia (GIIC–Tam2) en Tamaulipas (Loeza–Kuk et al., 2005). El material in vitro se incubó a 23–25 °C y 16 h luz. La evaluación de la transmisión del CTV fue 21 d después de la inoculación (DDI) por RT–PCR para pl 8 con ARN extraído de tejido de brotes provenientes de tallos con el injerto vivo. Luego, se retiró el segmento injertado en los explantes positivos y se evaluaron a los 60 DDI con RT–PCR y PCR en tiempo real.

Inoculación de plantas transgénicas en invernadero

La inoculación de plantas transgénicas se efectuó por injerto y con áfidos. Porciones de CpP1, CpP2, CpL, P y L fueron injertadas sobre C. aurantium y C. volkameriana y mantenidas en invernadero a 15 a 33 °C. Tres plantas de cada combinación con brotes de 30 a 50 cm se inocularon por injerto de corteza (0.5 cm) de Citrus sinensis infectado con GIIC–Taml y GIIC–Tam2, según los tratamientos indicados en el Cuadro 1, con un diseño completamente al azar con arreglo factorial. La carga viral se determinó mediante PCR en tiempo real.

La inoculación con Aphis gossypii fue con 30 adultos ápteros, alimentados en C. sinensis infectadas con CTV y colocados en cada planta receptora con hojas tiernas; paralelamente se cuan–tificó la carga viral en grupos de 30 áfidos alimentados sobre la misma fuente viral. Los pulgones fueron eliminados a los 5 DDI con paratión metílico (2 mLL^–1). Las plantas inoculadas se confinaron en invernadero.

A los 75 DDI se procesó tejido foliar para evaluar la efectividad de la inoculación por la multiplicación del virus. Se usó inmunocaptura–reverso transcripción–reacción en cadena de la polimerasa (IC–RT–PCR) siguiendo el protocolo de Yokomi y DeBorde (2005), con los iniciadores p18f (5'TTCTATCGG–GATGGTGGAGT3') y p18r (5'GACGAGATTATTACA–ACGG3') que flanquean al gen p18 del CTV (Sambade et al., 2002). Después de sensibilizar y lavar los tubos, en cada uno se agregaron 45 μL de la mezcla de disrupción [50 mM KCl, 20 mM Tris–HCl (pH 8.4), 10 mM DTT, 2.5 mM MgCl₂, 100 μM dNTPs y 1 ng de cada iniciador] y se incubaron en el termociclador Touchgene Gradient (Techne) a 70 °C por 5 min. Después se enfriaron y se agregaron 5 μLde la mezcla: RNAseout 10U (Invitrogen), 50U de MMLV–RT y 1.25U de Taq DNA polimerasa (Promega Corp. Madison, WI). La RT–PCR se realizó con el siguiente programa: 1 h a 42 °C, 35 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 55 °C y 40 s a 74 °C seguidos de 5 min a 74 °C. Los productos de la reacción de 424 pb se visualizaron en geles de agarosa al 1.5 % teñidos con bromuro de etidio en un fotodocumentador (UVP Epichem II) (Yokomi y DeBorde, 2005).

Análisis de resistencia

Una vez detectadas plantas positivas a la transmisión de CTV, se realizó la extracción de ARN total con Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, USA) en 100 mg de brotes tiernos muestreados en dos sitios del dosel de la planta. Se siguió el protocolo del fabricante con un lavado adicional de etanol al 75 % y resuspendido en 50 μLde agua destilada tratada con dietilpirocarbonato al 0.01 %.

El cADN se sintetizó con 4 μgde RNA cuantificado por UV–espectrofotometría (NanoDrop–1000 Spectrophotome–ter). El ARN cuantificado se estandarizó a 11 μLy se calentó 10 min a 70 °C junto con 10 mM de dNTPs y 500 ng de hexámeros aleatorios. Los tubos se colocaron en hielo y se adicionaron 7 μL de la mezcla de reacción para un volumen total de 20 μLque contenía 50 mM Tris–HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂ y 10 mM de DTT. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente (20 °C) por 10 min y después por 50 min a 42 °C.

Para evaluar la replicación viral que permitió el material transgénico a través del número de copias de genomas virales presentes en las muestras, se elaboró una curva de estandarización externa con el producto de PCR del gen p18 purificado por columnas siguiendo el protocolo del fabricante (Qiaquick PCR Purification) y cuantificado por UV–espectrofotometría (Swillens et al., 2004). Las diluciones seriales se realizaron con el programa MB Advanced DNA Analysis para determinar el peso de un pmol del fragmento en 0.258232 μg en su conformación bicatenaria (0.258232X10^–12 g mol^–1), mismo que contuvo 1.555X1011 moléculas de acuerdo con la constante de Avogadro (6.023X1023 moléculas mol^–1). Con estos datos se aplicó la siguiente fórmula: (concentración en ng de la muestra UV–espectrofotometríaXpmoles μg^–1)(l/1000 μL^–1) (número de partículas en 1 pmol), para determinar el número de partículas presentes en la muestra purificada y realizar las diluciones pertinentes para obtener concentraciones de 4X10⁹ a 4X10¹ fragmentos de p18.

La PCR en tiempo real se realizó con el kit platinum SYBR green qPCR supermix UDG (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron 12.5 μLde SYBR mix, 0.5 μL del colorante ROX, 100 ng de iniciadores para p18 y 2 μL del producto de cADN por cada reacción en volumen de 25 μL. Las reacciones se hicieron en un termociclador Rotor–Gene 3000 (Corbett Research). Los tubos estuvieron 2 min a 50 °C, 2 min a 95 °C, 35 ciclos de 15 s a 94 °C, 30 s a 55 °C y 40 s a 72 °C, 5 min a 72 °C y finalmente un calentamiento progresivo para generar una curva de disociación. En cada reacción, las muestras se analizaron por triplicado junto con una muestra de concentración conocida para ajustar la eficiencia y usar los parámetros de la curva de estandarización externa.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el ensayo in vitro, sobrevivieron 23 injertos (38 %). La detección de la transmisión del CTV con RT–PCR para p18 indicó 23 % de explantes infectados a los 21 DDL Los positivos en RT–PCR de punto final se evaluaron por PCR en tiempo real. La curva de estandarización indicó que se pudo cuantificar hasta 400 copias de p18 (número teórico de partículas virales, Figura 1). Con concentraciones menores la cuantificación no fue precisa. Este comportamiento pudo deberse a variaciones entre la alineación inicial de los iniciadores y de las secuencias objetivo (Wong y Medrano, 2005).

En este estudio, los brotes transgénicos y no transgénicos permitieron la replicación viral, aunque no se observaron síntomas imputables al virus. Sin embargo, el limón mexicano (L) y pomelo (P) tuvieron mayor acumulación de cadenas virales que sus contrapartes transgénicas (CpLNS y CpP1NS, Figura 2). El ciclo umbral de detección (Ct) de cada grupo disminuyó con los días después de la inoculación (de 21 a 60 DDI). En algunas muestras de CpP se detectó que la concentración no aumentó proporcionalmente a mayor DDI (Figura 2). En el testigo sin inocular (lsi), se observó reducción de Ct en la fluorescencia registrada por el aparato que correspondió a dímeros y no a amplificación.

En condiciones de invernadero, debido al número de individuos no infectados en dos intentos de inoculación, los resultados sólo se analizaron con los promedios y la desviación estándar. En este caso, la carga viral o número de copias de la porción injertada del aislamiento no severo y severo fue 4, 125, 443±1.04Xl0⁶ y de 125, 215±2.91 X10³. En áfidos alimentados en plantas infectadas, la carga viral fue 27 y 64 copias para los aislamientos en el mismo orden. Sin embargo, la curva de disociación indicó que este último resultado no fue producto de amplificación.

Las dos líneas transgénicas de pomelo (CpP1 y CpP2) inoculadas por injerto acumularon menos partículas virales en ambos aislamientos que las plantas testigo (Cuadro 2). Esto sugiere que las plantas transformadas afectan negativamente la replicación del virus sin tener claro el mecanismo de acción. Este resultado concuerda con lo reportado por Febres et al. (2008) en plantas de pomelo inoculadas con un aislamiento severo y confirmadas mediante DAS–ELISA y RT–PCR.

El limón transgénico presentó menor concentración de partículas virales que el limón no transgénico; pero la diferencia fue menor que en los pomelos. Destaca que el aislamiento no severo tuvo una acumulación mayor en el limón, posiblemente por ausencia de homología entre la secuencia inserta en la planta (gen p25 de T36) y la usada como inoculo (Tennant et al., 2001). Otra posibilidad es la capacidad del virus de inducir una mayor replicación por su condición no severa de efecto no supresivo en el vigor de la planta, como lo sugieren las concentraciones de las fuentes de inóculo.

La falta de transmisión del virus por áfidos difiere de lo reportado por Domínguez et al. (2002), quienes inocularon eficientemente con A. gossypii con un mayor número de áfidos. Los resultados muestran baja transmisiblidad de los aislamientos de CTV por A. gossypii con el número de áfidos usados, aunque los áfidos se alimentaron ocho días en plantas positivas a CTV, y el acceso a las plantas receptoras fue cinco días.

La evaluación de PDR en cítricos contra el CTV se ha realizado en plantas transformadas de pomelo con p25 de varios aislamientos, limón mexicano con p25 (Domínguez et al., 2002), pomelo con p25 y la replicasa viral (RNA polimerasa–RNA dependiente, RdRp) (Febres et al., 2003; Febres et al., 2008) y limón mexicano con p23 (Fagoaga et al., 2006).

En este estudio, el efecto aditivo de combinar un patrón tolerante, como Citrus volkameriana, con un gen transgénico no fue conclusivo, ya que en general el número de partículas virales en esta combinación fue similar que con Citrus aurantium, altamente susceptible al virus. Como una respuesta a la inoculación, es posible que las plantas transgénicas con siete años de transformación incrementen la expresión del transgen de la capa proteica, mecanismo de defensa que no involucra el silenciamiento de ARN o silenciamiento pos–transcripcional (Al–Kaff et al., 1998).

Asimismo, el tejido de plantas transformadas y sometidas al ensayo GUS antes de su inoculación, resultan positivas y no muestran silenciamiento de este gen después de seis años de su inserción (Domínguez et al., 2002), un comportamiento detectado en las líneas evaluadas (datos no mostrados). Aunque las pruebas realizadas ofrecen resultados cuantitativos y valiosos, es necesario realizar otros análisis, como transferencia tipo Northern, antes y después de la inoculación para corroborarlos (Fagoaga et al., 2006).

En este estudio, el PCR en tiempo real probó su factibilidad para discriminar niveles de tolerancia estimada a través de la cuantificación viral, por lo que su eficacia debe evaluarse incluyendo otras modalidades. Adicionalmente, la inoculación con distintas especies de áfidos, aislamientos múltiples y combinaciones virales podrían reforzar el proceso de evaluación de la transgenia.

CONCLUSIONES

Las plantas de pomelo modificadas con el gen p25 del Citrus tristeza virus interfirieron con la replicación y acumulación de este virus. La inoculación mediada por Aphis gossypii no indujo la infección viral debido a una baja carga viral. No se encontró un efecto aditivo entre la expresión del transgen y la tolerancia de Citrus volkameriana. La capacidad de multiplicación y acumulación de partículas virales del Citrus tristeza virus es diferente entre aislamientos.

AGRADECIMIENTOS

A Beatriz Xoconostle, Instituto Politécnico Nacional. A Iván Córdoba, Centro de Investigaciones Científicas de Yucatán. A Vicente Febres, Universidad de Florida. Al Vivero Cazones, Veracruz.

LlTERATURA ClTADA

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