Caracterización de ADN de clones de papa e identificación de fitoplasmas asociados al síndrome de la punta morada

Characterization of DNA of potato clones and identification of phytoplasms associated with purple top syndrome

Norma M. Alarcón–Rodríguez, Héctor Lozoya–Saldaña, Ernestina Valadez–Moctezuma*

Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo. Chapingo, México, 56230, México. *Autor responsable: (evaladez@correo.chapingo.mx); (lozoya@correo.chapingo.mx).

Resumen

En muchas áreas sembradas con papa en México se manifiesta el síndrome de la punta morada, que reduce el rendimiento y la calidad del tubérculo. Un factor principal de este síndrome es la presencia de fitoplasmas y el inadecuado manejo de su insecto vector. Una opción para controlar esta enfermedad es generar genotipos de papa resistentes y un diagnóstico oportuno para evitar su diseminación. Por ello los objetivos de este trabajo fueron detectar fitoplasmas asociados a la punta morada presentes en clones de papa asintomáticos, pero que estuvieron expuestos a la misma por cuatro ciclos, e identificar la relación hospedero–patógeno. Al final del ciclo de cultivo del 2005, fueron recolectadas hojas de 18 clones de papa sin síntomas, en Toluca, Estado de México, originarios de dos programas de mejoramiento genético del Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA/ARS). Además fueron incluidos el cultivar Alpha con síntomas de la enfermedad como testigo positivo y plantas libres del fitoplasma. La detección del patógeno se hizo con PCR directa, PCR anidada y marcadores RFLP, usando las enzimas Alu 1, Hinf 1, Kpn 1, Eco R1, Tru 9, Taq 1, e identificando la presencia de tres grupos de fitoplasma en todos los clones. Los clones fueron agrupados en tres grupos relacionados con el testigo positivo, usando cinco iniciadores de marcadores RAPDs. Fue detectada una limitada relación específica hospedero–patógeno en función de las huellas de ADN de ambos.

Palabras clave: Punta morada, resistencia genética, RAPDs, RFLP.

Abstract

In many potato growing areas in México, there is presence of purple top syndrome, which reduces the yield and quality of this tuber. A main factor of this syndrome is the presence of phytoplasms and inadequate management of its insect vector. One option for controlling this disease is to generate resistant potato genotypes and early diagnosis to prevent its disemination. Therefore, the objectives of the present study were to detect phytoplasms associated with purple top present in asymptomatic potato clones, but which were exposed to the disease for four seasons, and to identify the host–pathogen relationship. At the end of the 2005 growing season, leaves of 18 asymptomatic potato clones, in Toluca, State of México, were collected, originating from two breeding programs of the United States Department of Agriculture (USDA/ARS). Also included were the Alpha cultivar with symptoms of the disease as positive control and plants free of phytoplasm. The detection of the pathogen was made with direct PCR, nested PCR and RFLP markers, using the enzymes Alu 1, Hinf 1, Kpn 1, Eco R1, Tru 9, Taq 1, and identifying the presence of three groups of phytoplasm in all of the clones. The clones were clustered in three groups related to the positive control, using five primers of RAPDs markers. A limited specific host–pathogen relationship was detected as a function of the DNA fingerprints of both host and pathogen.

Key words: Purple top, genetic resistence, RAPDs, RFLP.

INTRODUCCIÓN

El síndrome de la punta morada es una de las principales enfermedades limitantes de la producción en el cultivo de la papa en México, reduciendo el rendimiento 30 a 95 %, así como la calidad del tubérculo (Cadena et al., 2003). El síndrome incluye la disminución en el crecimiento, enrollamiento apical y coloración purpúrea en los foliolos; los tubérculos dañados muestran un oscurecimiento de la pulpa, lo cual demerita drásticamente su calidad y uso como semilla (Cadena et al., 2003). Entre los agentes causales de mayor incidencia está un fitoplasma asociado con el Western aster yellows del Grupo I, con base en la clasificación internacional de fitoplasmas (Leyva et al., 2002; Salazar, 1997; Munyaneza et al., 2005) y a su vector (Bactericera cockerelli), aunque hay virus (PVY, PVX, PLRV) y hongos (Fusarium sp.) asociados al síndrome de la punta morada (Jensen et al., 2004). En el valle de Toluca se desarrollan programas de selección de clones de papa con cierta resistencia a la enfermedad, pero se desconoce si ésta se debe a fitoplasmas porque no han sido identificados en el campo experimental. Los fitoplasmas en las plantas presentan títulos muy bajos y su distribución en el hospedante no es uniforme, por lo que su identificación y clasificación requiere usar técnicas moleculares (Levy et al., 1994; Lorenz et al., 1995; Bertaccini et al., 1996). Sólo las especies silvestres tendrían esta característica de resistencia, pero desafortunadamente no tienen valor comercial. Por ello es importante analizar molecularmente las especies comerciales que presentan cierta resistencia (Cadena, 1993). Por tanto, los objetivos de la presente investigación fueron: 1) Detectar y caracterizar fitoplasmas asociados a la punta morada presente en clones de papa; 2) tipificar con marcadores moleculares los clones de papa seleccionados durante cuatro ciclos que no manifestaron síntomas; 3) identificar molecularmente si existe relación hospedero–patógeno.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Al final del ciclo de cultivo de 2005, justo antes de quemar el follaje, fueron recolectadas muestras foliares de 18 clones de papa que no manifestaron síntomas al síndrome de la punta morada. Estos genotipos fueron generados y proporcionados por el banco nacional de germoplasma de papa, Sturgeon Bay, WI, Departamento de Agricultura de los EE.UU. (USDA/ARS) para la evaluación de su resistencia al tizón tardío (Phytophthora infestans Mont. de Bary) en el campo agrícola experimental del Instituto de Capacitación Agropecuaria, Acuícola y Forestal del Estado de México (ICAMEX) en Metepec, Toluca, Estado de México (Cuadro 1). Hubo dos testigos positivos: Follaje del cv. Alpha con síntomas severos de la enfermedad (P+) y amarillamiento letal del cocotero (ALC+), proporcionado por la Dirección General de Sanidad Vegetal, SAGARPA, México. El testigo negativo fue el follaje de papa del cv. Alpha proveniente de minitubérculo sano obtenido en invernadero (P—).

Extracción de ADN

Para extraer ADN el método de Stewart y Evia (1993) fue usado con la siguiente modificación: Al amortiguador de extracción se agregó ácido ascórbico 5 mM, metabisulfito de sodio al 1 % y ARNasa 100 µg mL ^–1 para eliminar polifenoles y ARN.

PCR–directa

PCR–anidada

Los productos obtenidos con la primera amplificación fueron diluidos (1:10 y 1:30) con agua libre de nucleasas y sin diluir se usaron como ADN molde para la segunda amplificación con las condiciones descritas para la PCR–directa, sólo que usando los pares de iniciadores R16mF2/Rl6mR1, R16F2/R16R2 (Gundersen y Lee 1996; Lee et al., 1998) y R16F2n/R16R2 (Smart et al., 1996; Cuadro 2), con volumen final de 25 µL. El programa de amplificación fue una temperatura inicial de 94 °C por 2 min y 35 ciclos adicionales con 1 min de desnaturalización a 94 °C; 1 min de alineamiento a 55 °C; 90 s de polimerización a 72 °C, y una fase de extensión final a 72 °C por 7 min. Los productos se observaron en geles de agarosa al 1.2 % teñidos con bromuro de etidio (0.5 µg mL^–1 ).

Digestión de los productos de PCR con enzimas de restricción

Para caracterizar los fragmentos de los fitoplasmas detectados con el par de iniciadores R16F2n/R16R2 (Sigma) en los distintos clones de papa, se digirió el fragmento de 1200 pares de bases (pb) obtenido en la PCR anidada con las enzimas de restricción Alu I ([Promega), Eco R1 (Promega), KpN 1 (Boehringer Mannheim), Hinf I (Promega), Tru 9 (Promega), Taq 1 (Boehringer Mannheim) conforme a las especificaciones del proveedor. Con 1000 ng de ADN se obtuvo un volumen final de reacción de 20 µL . El producto de digestión fue visualizado en geles de acrilamida al 6 % teñidos con nitrato de plata al 0.2 %.

Amplificación del ADN

Para la Amplificación Inespecífica del Polimorfismo de ADN (RAPD, Random Amplied Polimorfic DNA) fueron probadas seis series completas de iniciadores, ya que proporcionan gran número de polimorfismos en distintas especies vegetales. Por tanto, fueron seleccionados iniciadores de tres series que para los clones de papa proporcionaron los perfiles más polimórficos: Serie C (iniciador C–09 y C–12); Serie G (iniciador G–02, y G–10); serie K (iniciador K–01 y K–17). Para la reacción fueron usados 20 pmoles de iniciador, 100 ng de ADN y el sistema Taq PCR Core (Quiagen, Alemania) usando 1.5 unidades de la enzima Taq polimerasa, 200 µM de dNTPs, 25 mM de MgCl₂, amortiguador para enzima a una concentración 1X y 5 µL de solución Q; el volumen final de reacción fue 25 µL. Fueron colocados en un termociclador (GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems) con un ciclo a 94 °C por 1 min; 35 ciclos de 94 °C (temperatura de desnaturalización) por 30 s, 40 °C de alineamiento por 30 s y 72 °C (temperatura de elongación) por 90 s, y una extensión final de un ciclo de 72 °C por 150 s. Los productos de amplificación fueron visualizados en geles de agarosa al 1.2 % teñidos con bromuro de etidio (0.5µg mL^–1 ) y en geles al 6 % de arcrilamida teñidos con nitrato de plata al 0.2%.

Análisis de resultados

Con los fragmentos amplificados de las combinaciones de iniciadores de PCR, productos de la digestión con enzimas de restricción y con el uso de iniciadores RAPDs fueron elaborados matrices binarias de datos, agrupándose los fitoplasmas con el método UPGMA y el coeficiente de similitud de Jaccard en el programa estadístico NTSYS 2.2.

PCR directa

No fue detectado ningún fragmento con los iniciadores P1/P7 en las muestras de ADN de papa, aunque sí en el testigo positivo para el amarillamiento letal del cocotero con una banda de 1800 pb (Cuadro 3). Esto podría deberse a que el fitoplasma se encontraba en título muy bajo por lo que con PCR directa no se presentó amplificación (Gundersen et al., 1996; Davis et al., 1997). El par de iniciadores R16F2/P7 amplificó un fragmento de 1200 pb en 12 de los 18 clones, así como en los dos testigos positivos de coco y papa (Cuadro 3; Figura 1A). Esto corresponde al gen 16S rADN reportado por Lee et al. (1993). Con el par de iniciadores P3/P7 se logró la amplificación de un fragmento de aproximadamente 350 pb en todas las muestras (Cuadro 3; Figura 1B). Estos iniciadores abarcan la región entre los genes 16S y 23S del rADN que a pesar de ser una región específica para los fitoplasmas, presenta una gran variabilidad, situación usada para la separación de grupos (Smart et al., 1996). Al usar los iniciadores R16F2/Ayint se logró amplificar un fragmento de aproximadamente 900 pb en 10 muestras (Cuadro 3), observándose amplificaciones inespecíficas de menor peso molecular donde el fragmento del testigo positivo fue de menor tamaño (Figura 1C). Smart et al. (1996) señalan que con el par de iniciadores P1/Ayint se detectan fitoplasmas correspondientes al grupo del Amarillamiento del aster, pero en el presente trabajo se reemplazó al P1 por R16F2 ya que éste indujo amplificación en todas las combinaciones empleadas, aunque el fragmento obtenido fue más pequeño debido a que el iniciador Rl6F2 se encuentra más al interior del gen 16S (Gundersen y Lee, 1996; Lee et al., 1998) en referencia con P1.

PCR–anidada

Para la PCR anidada con amplificaciones de distintos fragmentos fueron usados tres pares de iniciadores para cada caso (Cuadro 3; Figura 1D, E, F). Con los iniciadores R16mF2/R16mR1 se obtuvieron 14 muestras positivas de las 21 analizadas y el fragmento amplificado fue 1400 pb (Cuadro 3; Figura 1D), como lo refieren Gundersen y Lee (1996). Estos resultados muestran coincidencia con la PCR directa (10 de las 14 muestras). El testigo positivo (ALC+) amplificó un fragmento de 1200 pb, coincidiendo con lo obtenido en la PCR directa. Con el par de iniciadores R16F2/R16R2 se amplificó un fragmento de 1200 pb en ocho muestras, cinco de las cuales coinciden con el par ya descrito y con la PCR directa (Cuadro 1; Figura 1E). Hubo amplificación inespecífica de un fragmento de menor tamaño que, según Almeyda et al. (2001), se puede atribuir a la formación de dímeros durante la amplificación. Con el par de iniciadores R16F2n/Rl6R2 se presentó la amplificación del fragmento esperado de aproximadamente 1250 pb en los clones, coincidiendo con el mismo tamaño de fragmento en los testigos positivos. En la mayoría de las muestras se aprecia la banda definida y gruesa salvo en tres muestras con banda tenue (Cuadro 3; Figura 1F), lo que indica una concentración menor del fitoplasma (Davis et al., 1997; Davis y Sinclair 1998; Lee et al., 2000). Este fragmento estuvo acompañado por dos bandas, una con un peso de 1100 pb y otra alrededor de 750 pb, cuya presencia pudiera deberse a la posibilidad de inestabilidad o formación de dímeros que no se pueden alinear al realizar la PCR (Almeyda et al., 2001). Los iniciadores R16F2n/R16R2 facilitan la detección de fitoplasmas en bajas concentraciones, debido a que amplifican una región conservada del gen 16S rRNA (Lee et al., 1993). Esto es confirmado al compararlos con los resultados obtenidos con los otros pares de iniciadores incluidos en este estudio, pues aunque fueron amplificados con la misma dilución no dieron los mismos resultados.

Digestión con enzimas de restricción

Los patrones de restricción generados del fragmento de 1200 pb obtenido en la PCR anidada con los R16F2n/R16R2 fueron uniformes para la mayoría de la muestras con la enzima Tru 9. Se presentó una banda de 120 pb en todas las muestras, y otra de 250 pb en la mayoría. Además, el microorganismo proveniente del clon A02497–1 (muestra 1) presentó una banda de aproximadamente 310 pb y A00419–68 (muestra 2) una de 260 pb (Figura 2A). La enzima Taq 1 generó sólo una banda de 400 pb aproximadamente, por lo que se considera que no hubo digestión del ADN (Figura 2B). Con la enzima Hinf 1 se presentaron tres bandas en los microorganismos de los clones 3, 4, 5 y 7 (ver la identificación de los clones en el Cuadro 1). Otra banda de 280 pb se presentó en la mayoría de los fitoplasmas excepto en el proveniente del clon A02497–1 y se observó una tercera banda de 320 pb en la mayoría, salvo en los microorganismos de los clones 1, 8 y 10 (Figura 2C). El patrón de digestión con la enzima Kpn I fue el mismo para todas las muestras, tres bandas: una de 550 pb, la segunda de 270 pb y la tercera de 240 pb (Figura 2D). Con la enzima Eco R1 hubo un patrón variado. El clon A00419–68 (muestra 1) tuvo una banda de 500 pb y otra de 700 pb aproximadamente; los provenientes de los clones 3, 4, 5, 6, 7 11, 12, 14 y 15 mostraron otro patrón de dos bandas (una de 780 pb y otra de 700 pb) mientras que los de los clones 1, 8, 10 no presentaron bandas (Figura 2E). Por último, la enzima Alu I originó un fragmento de 230 pb aproximadamente y en el fitoplasma del clon 2 se presentó una banda de 520 pb (Figura 2F). La amplificación se repitió tres veces para cada muestra, luego las muestras fueron colocadas en geles, realizando cuatro repeticiones de cada gel. Seemüller et al. (1998) reportaron que la secuenciación del gen 16S RNAr proporciona datos más precisos que los obtenidos por patrones de restricción. Sin embargo, el hecho de tener diferencias de uno o varios nucleótidos no implica necesariamente que estos estén codificando para aminoácidos diferentes y probablemente no se trate de grupos diferentes; por tanto, estos autores concluyen que es válido el agrupamiento por análisis de enzimas de restricción. Al comparar los patrones de restricción obtenidos en este trabajo con los obtenidos para PPT (Potato Purple Top o punta morada de la papa, Leyva et al., 2002) se observa una similitud en los patrones de las enzimas Alu I y Kpn I. Por tanto, los fitoplasmas encontrados se asocian con el PPT perteneciente al grupo I del Aster Yellow (Leyva et al., 2002; Davis et al., 1997; Lee et al., 1998), lo cual concuerda con lo reportado por Almeyda et al. (2001) usando las enzimas Alu I y Eco R1.

Coeficiente de similitud

La amplificación de la secuencia 16S rDNA mediante PCR anidada y el análisis de los patrones de restricción con seis enzimas, caracterizaron y diferenciaron a los fitoplasmas en tres grupos con un coeficiente de similitud de 0.7. El grupo A contiene las muestras positivas con el mayor número de iniciadores y en este grupo están los testigos positivos de papa y de cocotero, aunque con cierto distanciamiento entre ellos. De hecho, la muestra positiva de coco fue la más distante al resto del grupo (Figura 3), lo cual se debe a que el amarillamiento del cocotero está ubicado en el grupo IV del Amarillamiento del aster (Davis y Sinclair, 1998; Lee et al., 1998), diferentes de los fitoplasmas reportados por Leyva et al. (2002) para papa. Los grupos B y C incluyen a las muestras con menores amplificaciones. Al comparar este diagrama con la información del Cuadro 1 se observa que no hubo coincidencia entre los agrupamientos y los progenitores o genotipos de los hospedantes de los cuales fueron aislados los fitoplasmas. La similitud en la formación de grupos con la PCR directa, la PCR anidada y los patrones generados por las enzimas de restricción dan validez al análisis de RFLP para la caracterización y diferenciación a nivel de grupos (Lee et al., 1998). Por tanto, los resultados del presente trabajo se asocian con lo reportado para fitoplasmas en México (Cadena, 1993; Ley va et al., 2002).

La separación en grupos muestra que la presencia del fitoplasma sí determinó la asociación. El uso del coeficiente de asociación de Jaccard (Sneath y Sokal, 1973) eliminó la consideración de las dobles ausencias como motivo de similitud que frecuentemente conduce a errores, ya que pueden ser ausencias no homólogas, es decir es un coeficiente de asociación que omite los valores de ausencia (Johnson, 2000). De esta manera el resultado es menos afectado por bandas erráticas (Moreno, 2001). En un estudio de especies diploides y morfológicamente muy similares del género Solanum, Spooner et al. (1996) calcularon que 650 es el número mínimo de bandas requeridas para establecer relaciones genéticas precisas a nivel intraespecífico. En el presente estudio no se pudo delimitar las bandas que correspondían a esta característica en cada iniciador usado. Las plantas infectadas de las asintomáticas y con síntomas fueron diferenciadas respecto a los testigos positivo y negativo. El análisis de los resultados sugiere la búsqueda o el uso como progenitores de estos materiales como posibles fuentes de resistencia hacia la enfermedad, lo que concuerda con Jansky y Rouse (2003) quienes afirman que las especies silvestres son la fuente de genes de resistencia a múltiples enfermedades.

Con base en el número de fragmentos amplificados en el ADN de las distintas muestras de plantas de papa, fue generado un dendrograma (Figura 4) conformado por tres grupos. El grupo A fue dividido en dos grupos homogéneos; en uno fueron ubicados los clones A00535–2, A00499–38 y A02499–462, sin progenitores comunes entre ellos. El grupo B incluye a A00419–68, A00419–40 y al A00419–73, con detección de fitoplasma con pocos iniciadores, siendo los tres clones progenie de una misma cruza (A96764–19 X Stirling). El grupo C fue el más numeroso y heterogéneo, incluyendo al resto de los clones de papa y al testigo positivo. La mayoría de las muestras resultaron positivas a fitoplasma con un número significativo de iniciadores, excepto el clon LB 436 que amplificó con dos iniciadores para fitoplasma, y el clon LB 99 que amplificó con cuatro iniciadores y con un alto coeficiente de similitud con el testigo positivo. Este grupo comparte al menos un progenitor entre ellos, aunque los RAPD tienen bajo nivel de reproducibilidad y son marcadores dominantes (Torres y Moreno, 2001; Weising et al., 2005). Ipek et al. (2003) compararon AFLP, RAPD e isoenzimas en ajo, encontrando 70 % de similitud entre los AFLP y los RAPD, con una correlación entre dendrogramas de 0.96 indicando alta concordancia entre ambas técnicas para el agrupamiento del ajo. Esta situación se ha repetido en melón (Cucumis melo, García et al., 2000), arroz (Oryza sativa, Virk et al., 2000) y chile (Capsicum Nahum, Lefebvere et al., 2001), por lo que el uso de RAPD fue considerado válido para la presente investigación.

El análisis multivariado factorial por correspondencia simple de los resultados permitió agrupar las bandas obtenidas de cada clon de papa con los cinco iniciadores usados, lo cual facilitó la interpretación del análisis en forma numérica (Cuadro 4 y Figura 5), donde se explica la variabilidad entre los componentes principales (Johnson, 2000). Así, el clon A02499–46 se aleja de la agrupación con el iniciador de la serie G–10 (ROTH), al igual que los clones A00535–2 y A00499–38 con el iniciador de la serie C–09 (ROTH). Los iniciadores que mejor explicaron la agrupación de bandas en este análisis fueron los de la Serie C, particularmente el 09, siendo los mismos que mostraron los polimorfismos en los geles de acrilamida.

CONCLUSIONES

La mayoría de los iniciadores incluidos en el presente estudio detectaron la presencia del fitoplasma asociado a la punta morada, identificándose tres grupos, todos ubicados como del grupo I del Amarillamiento del aster (Western aster yellows). Se tipificaron tres grupos del hospedante y sólo en uno de ellos se detectó relación hospedero–patógeno.

AGRADECIMIENTOS

LITERATURA CITADA

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