Avances de clonación in vitro de árboles adultos de raulí (Nothofagus alpina Poepp. et Endl.) Oerst.) para propagación comercial
In vitro cloning advanced of adult tress of rauli (Nothofagus alpina Poepp. et Endl.) Oerst) trees for commercial propagation
Ana M. Sabja1*, Oriana Ortiz2 y Claudia Triviño3
1 Fundación Chile, casilla 567, Valdivia, Chile. *Autor responsable: (asabja@uach.cl).
2 INFOR, Casilla 109 C, Concepción, Chile. (oortiz@infor.cl).
]]> 3 GENFOR S.A, Casilla 567, Valdivia Chile, (ctrivino@uach.cl)
Recibido: Noviembre, 2007.
Aprobado: Abril, 2008.
Resumen
Raulí, Nothofagus alpina (= N. nervosa) es una especie nativa con potencial comercial en Chile. En el presente trabajo se describe el procedimiento para establecer in vitro fenotipos adultos de raulí de dos orígenes: terreno e injerto cultivados in vitro por periodos de varios años y producir plantas de tamaño y forma adecuada para usar a escala comercial. Se discuten los resultados obtenidos en la fase de enraizamiento, donde esta especie mantenida en cultivo in vitro en concentración constante de BAP (0.125 mg L–1) se propaga sin declinar el potencial de enraizamiento después de varios años de subcultivos sucesivos en laboratorio. Para evaluar el potencial rizogénico en el tiempo se aplicaron dos tratamientos: enraizamiento de brotes después de un año del inicio del establecimiento in vitro y cuatro años después de subcultivos sucesivos. No hubo diferencias significativas en los porcentajes de enraizamiento entre ambos tratamientos y orígenes. La posibilidad de mantener el potencial rizogénico de una especie cultivada in vitro por períodos prolongados es una ventaja para implementar un programa de producción clonal de plantas a gran escala mediante técnicas de micropropagación.
Key words: Raulí, micropropagación, cultivo in vitro
Abstract
]]> Rauli, Nothofagus alpina (= N. nervosa) is a species native to Chile with commercial potential. This study describes the procedure for in vitro establishment of adult phenotypes of rauli from two sources, field and graft, cultivated in vitro for periods of several years to produce plants of adequate size and form for commercial scale use. We discuss the results obtained in the rooting phase. The species kept in in vitro culture with constant concentration of BAP (0.125 mg L–1) propagates with no decline in rooting potential after several years of successive subcultures in the laboratory. To evaluate rhizogenic potential over time, two treatments were tested: shoot rooting one year after establishment in vitro and four years of successive subcultures. No significant differences in percentages of rooting were found for treatments or sources. The possibility of maintaining rhizogenic potential of a species cultivated in vitro for prolonged periods is an advantage in implementing a program of large–scale production of clones using micropropagation techniques.Key words: Rauli, micropropagation, in vitro culture.
INTRODUCCIÓN
Las plantaciones forestales tienen una función creciente en el abastecimiento futuro de la industria forestal mundial y liberan presión sobre el uso maderero de los bosques naturales. Al respecto, Sedjo (1997) destacó el aporte de las innovaciones en genética y biotecnología para obtener árboles de buen crecimiento y con características deseadas. Sin embargo, la concentración de la producción industrial en plantaciones forestales con unas pocas especies plantea el desafío de la diversificación con nuevas especies para asegurar una producción forestal sostenible.
Entre las especies con potencialidad de uso comercial por su rápido crecimiento y calidad y uso de la madera está el raulí, Nothofagus alpina (Nothofagus procera (Poepp. et Endl.) Oerst =. Nothofagus nervosa (Phil.) Krasser, una de las principales especies de su género. Árbol endémico de los bosques subantárticos de Chile y Argentina, crece en las laderas de las montañas, a altitudes intermedias entre 300–1 200 m, en suelos profundos con buen drenaje (Hoffmann, 1982). En Chile, las plantaciones con especies nativas se inician desde semillas sin ninguna mejora genética y en algunos casos mediante semillas depuradas obtenidas del programa de mejoramiento genético para raulí. Sin embargo, los niveles de producción de semillas tienen fluctuaciones anuales que corresponden a patrones cíclicos de variación en la especie (Gutiérrez, 2000; Ipinza y Espejo, 2000). Para aumentar la productividad del recurso y obtener un beneficio sostenible, se enfatiza la aplicación de herramientas de mejoramiento genético junto con técnicas biotecnológicas y silvícolas en la propagación de esta especie (Kleinschmit et al., 1993). Las estrategias de mejoramiento de especies forestales incorporan técnicas de propagación asexual como la macropropagación (mediante injerto y estaca) y la micropropagación que permiten transferir toda la varianza genética a los descendientes, duplicando la ganancia genética asociada a los esquemas sexuales de propagación (Ikemori et al., 1994).
La macropropagación por estacas se aplica sólo en material juvenil de raulí, ya que luego pierde esa capacidad de enraizar (Ortiz y Gutiérrez, 2005). La micropropagación vía organogénesis directa se usa en la producción comercial de diversas especies forestales por la alta capacidad de multiplicación, reversión, mantención del estado juvenil y producción de plantas con buena estructura radicular, lo que permite una silvicultura altamente productiva (Ahuja, 1997; MacRae y Cotterill, 1997; Smith 1997). En especies de Nothofagus la organogénesis directa se inicia con trozos de tejidos, yemas, secciones nodales y axilares obtenidos de plantas juveniles y adultas y se ha definido el estadio óptimo de los brotes y yemas a propagar (Martínez Pastur et. al., 1997a); la embriogénesis somática utiliza semillas como explante inicial (Castellanos et al., 2005). En el cultivo de estos tejidos se emplean los medios nutritivos Broadleaved Tree Medium (BTM), Murashige y Skoog (MS), modificado en las concentraciones de los macronutrientes, y Woody Plant Medium (WPM) con bajas concentraciones salinas, aminoácidos, reguladores de crecimiento y vitaminas (Martínez Pastur y Arena, 1995; Jordán et. al., 1996). El enraizamiento se ha realizado con éxito en oscuridad, distintos tipos y concentraciones de auxinas y aclimatación gradual en invernadero (Martínez Pastur y Arena, 1996; Martínez Pastur et. al., 1997b).
Sin embargo, los estudios anteriores no han considerado un número suficiente de árboles que permita evaluar el comportamiento de distintos fenotipos en un proceso de producción a escala comercial de manera continua. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue contribuir a la diversificación de las plantaciones con una especie nativa de Chile con potencial comercial, mediante técnicas de micropropagación, evaluando la capacidad morfogénica de un número considerable de fenotipos adultos de raulí establecidos in vitro de dos orígenes, terreno e injerto, por 4 años de cultivo in vitro. Como objetivo específico se evaluó el potencial rizogénico en el tiempo, brotes enraizados después de uno y cuatro años del establecimiento in vitro, así como el procedimiento para producir plantas plantables.
MATERIAL Y MÉTODOS
]]> Selección del material vegetal y establecimientoEl material vegetal a micropropagar correspondió a 126 árboles de raulí de 40 a 100 años de edad. Los árboles localizados en toda el área de distribución natural de la especie (35° a 41° S), fueron seleccionados fenotípicamente con base a la rectitud y volumen, con una intensidad de selección promedio de un árbol cada 50 ha, por las instituciones Corporación Nacional Forestal, Instituto Forestal, Complejo Maderero Panguipulli y Universidad Austral de Chile, con proyectos financiados por la Corporación de Fomento (CORFO) y la Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) de Chile.
El material vegetal óptimo para el inicio del cultivo in vitro de raulí adulto corresponde a brotes apicales de yemas en desarrollo. Sin embargo, dado que este material vegetal se obtiene en primavera (inicio de crecimiento vegetativo), para avanzar en esta investigación, los primeros cultivos se hicieron en verano usando brotes apicales de siete árboles (fenotipos) adultos injertados en plantas juveniles y mantenidos en invernadero. En la práctica, el uso de esta metodología es cara pues demanda un número inicial alto de injertos para obtener una cantidad adecuada de brotes apicales. Por esta razón se decidió usar brotes de ramas recolectadas en terreno de 119 árboles adultos seleccionados a inicios de primavera, al término del periodo de receso vegetativo de la especie. Las ramas recolectadas (longitud 30 a 40 cm) fueron llevadas al laboratorio, donde se sumergieron 20 min en una solución de Captan 80WP (Cis–N–((triclorometil)tio)–4 ciclohexen–1, 2–dicarboxamida), 1g L–1; las ramas fueron enjuagadas en agua potable y forzadas a brotar en un ambiente controlado (22±2 °C; humedad 80%; fotoperíodo16 h luz). Los brotes apicales cosechados (1–2 cm longitud), con uno a dos pares de hojas, fueron desinfectados 10 min en una solución al 10% (v/v) de hipoclorito de sodio comercial, más dos gotas L–1 de Tween 20®, más cuatro enjuagues sucesivos en agua destilada estéril por 4 min. Todo el proceso fue con agitación constante dentro de la cámara de flujo laminar. Inmediatamente los brotes se cultivaron en medio nutritivo Broad–leaved Tree Medium (Chalupa, 1983), con un suplemento 3% de sacarosa (Merck), 0.125 mg L –1 de 6–benzilaminopurina (BAP; Sigma), vitaminas de Murashige y Skoog, 2 mg L–1 de glutamina (Sigma), 2.3 g L–1 de Gelrite® (Sigma); el pH se ajustó a 5.7. Los explantes se mantuvieron 30 d en una cámara de incubación a 22±2 °C, con un fotoperíodo de 16 h.
Multiplicación de brotes
Los brotes originados de los explantes fueron transferidos a medio nutritivo fresco BTM cada 21 d, usando la misma concentración hormonal de la etapa anterior pero reduciendo la concentración de sacarosa al 2%. El número de brotes originados desde un explante fue contabilizado mensualmente durante un año.
Enraizamiento
Se emplearon 35 fenotipos para evaluar la etapa de enraizamiento después de un año (año 1) y cuatro años (año 2) del cultivo in vitro, para determinar si el potencial de enraizamiento decrece con subcultivos sucesivos. Para ello 16 110 brotes apicales (2–3 cm longitud) con dos pares de hojas fueron cultivados en medio BTM con los macronutrientes diluidos en 50% (p/v), vitaminas de Murashige y Skoog, 0.12mg L–1 de ácido indol 3–butírico (AIB; Sigma), 15% sacarosa (Merck), 2.3 g L–1 de Gelrite® (Sigma); el pH se ajustó a 5.7. Los explantes fueron colocados 7 d en oscuridad, luego un fotoperíodo de 16 h luz por 18 d y se traspasaron a la etapa de acondicionamiento en laboratorio.
Acondicionamiento y pre–aclimatación en laboratorio
Para evitar las condiciones de estrés observadas al transferir plantas micropropagadas a invernadero, se acondicionaron previamente en laboratorio: los brotes enraizados en sustrato fueron cultivados tres semanas en envases con un filtro en la parte superior que permite intercambio gaseoso. Se adicionó medio líquido BTM estéril, diluido a 25% (v/v), al sustrato de turba y perlita (1:3).
Aclimatación en invernadero
]]> Luego del acondicionamiento en laboratorio, las plantas fueron trasladadas a invernadero y colocadas en tubetes circulares (120 cm3) con sustrato de turba y perlita (1:3) y Osmocote® 15–9–12, en dosis de 5 kg m–3. La humedad fue 90% por una semana bajo túnel de plástico, la que gradualmente (tres semanas) se redujo hasta condiciones ambientales normales.Análisis estadístico
Para evaluar el potencial rizogénico en el tiempo se usaron dos tratamientos de enraizamiento de brotes. La unidad experimental fue el fenotipo de dos orígenes: material adulto de injerto y material adulto de terreno. Los tratamientos fueron los dos períodos de tiempo para el enraizamiento: año 1 (después de un año de cultivo in vitro) y año 2 (cuatro años de multiplicación in vitro). Con los resultados de enraizamiento según tratamientos se hizo un análisis de varianza de una vía y las medias entre tratamiento se compararon con la prueba de Tukey (p<0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Selección del material vegetal y establecimiento
El uso de un número considerable de fenotipos permitió definir el comportamiento del material vegetal cultivado in vitro. A partir de 126 árboles o fenotipos adultos de raulí y usando dos orígenes (brotes apicales de injerto y brotes apicales de terreno) se establecieron in vitro 47 fenotipos (37%), de los cuales siete provenían de fenotipos adultos injertados y 40 de fenotipos adultos de terreno (Figura 1A). Los brotes apicales eran muy heterogéneos entre fenotipos en tamaño y expansión foliar, aspecto determinante en la oxidación del tejido de raulí y de otras especies de Nothofagus (Martínez Pastur et al., 1995), lo que condicionó que solo 47 fenotipos se establecieron in vitro.
Multiplicación de brotes
En explantes provenientes de injertos de material adulto, las respuestas de multiplicación de brotes se observan en los siete fenotipos (Figura 2). Su tasa de multiplicación fluctuó entre 1:1 a 1:2 brotes por explante a los dos meses, alcanzando 1:2 a 1:62 brotes a los 12 meses del cultivo in vitro. Algunos fenotipos mostraron una mejor capacidad de inducir brotes axilares, como los fenotipos 43 y 23 que alcanzan más de 50 brotes por explante a los 12 meses del inicio del cultivo.
]]>
La respuesta en multiplicación de brotes en fenotipos adultos de terreno se describe en 13 de ellos, con una tasa de 1:1 a 1:12 brotes originados por explante a los dos meses de cultivo y 1:1 a 1:230 brotes después de 12 meses, dependiendo del fenotipo. En los fenotipos 141 y 120 se obtuvieron más de 100 brotes por explante (Figura 3). Martínez Pastur y Arena (1996) señalan resultados similares: 1:7 a 1:11 al cabo de dos meses de cultivo usando material juvenil. Este buen resultado se debe al conocimiento adquirido previamente en el cultivo del material de injerto de invernadero.
En ambos casos, material adulto de injerto y material adulto de terreno, durante los primeros meses de cultivo los explantes presentan una baja proliferación de brotes. Pero al subcultivarse y estabilizarce se alcanzan niveles interesantes de multiplicación, es decir se requieren 12 meses para alcanzar tasas de propagación adecuadas (Figura 1B). En esta especie hubo un efecto positivo de los subcultivos sucesivos en medio con reguladores de crecimiento, respecto a otras especies que pierden la capacidad morfogénica de los tejidos (Vieitez et al., 1985).
Enraizamiento
No hubo diferencias significativas entre los porcentajes de enraizamiento (Figura 4) obtenidos en el año 1 (un año del cultivo in vitro) y en el año 2 (cuatro años del cultivo in vitro). Esto indica que los subcultivos sucesivos en medios nutritivos con la concentración constante de BAP usada no afectan significativamente el potencial de enraizamiento en el tiempo. Lo contrario ocurre en Castanea sativa y Eucalyptus sp, donde disminuye la respuesta durante el proceso rizogénico (Ríos et. al., 2005, Gómez et. al., 2007).
Al analizar los resultados de enraizamiento para el año 1 y año 2, diferenciados por origen del fenotipo (adulto de injerto y adulto de terreno), no hubo diferencias significativas para estos factores (Figura 5).
]]>
Se clasificaron los fenotipos diferenciados por origen para el porcentaje de enraizamiento obtenido el año 2 (Figura 6) y se encontró una variación (40 a 90%) en las respuestas rizogénicas entre fenotipos. Además, la mayoría de los fenotipos presentaron una disminución en el porcentaje de enraizamiento durante el año 2 respecto al año 1. Sin embargo, como ya se indicó, el promedio del porcentaje de enraizamiento de los clones analizados por año no mostró diferencia significativa (Figura 4 y 5).
Acondicionamiento y pre–aclimatación en laboratorio
El acondicionamiento en laboratorio (Figura 1C y D) permitió aumentar la superficie foliar, elongación apical y radicular de las plantas antes de su traspaso a invernadero, aminorando así el estrés y la mortandad (Kosai, 1991).
Aclimatación en invernadero
El procedimiento usado para el acondicionamiento y aclimatación permitió alcanzar 94.3% (12 328) de sobrevivencia de plantas de 35 fenotipos llevadas a invernadero, luego de reducir la humedad a condiciones ambientales normales (Figura 1E y F).
]]> CONCLUSIONES
Raulí es una especie que puede cultivarse in vitro por períodos prolongados. Brotes de diferentes fenotipos enraizados después de cuatro años de cultivo sucesivos se propagan in vitro sin declinar el potencial morfogénico en proliferación de brotes y enraizamiento.
El uso de un sistema de pre–aclimatación en laboratorio redujo la mortandad de plantas después del traspaso a invernadero a 5.7%, aumentando significativamente la producción de plantas de raulí. El crecimiento de las plantas no se detuvo al traspasar a invernadero, lo que indica una disminución importante del estrés. Se produjeron 12 328 plantas de raulí proveniente de 35 fenotipos.
Se concluye que es posible implementar un programa de producción clonal de plantas de raulí de tamaño y forma adecuada a partir de material adulto, para usar a escala comercial. Esto es muy importante para lograr diversidad de las especies usadas en plantaciones forestales.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio es parte del Proyecto FDI 00C7FT–12. Silvicultura Clonal en Raulí para Aumentar la Productividad de Sitios Forestales en la IX y X Regiones del país.
LITERATURA CITADA
Ahuja, M. 1997. Biotechnology in forestry: expectations and challenges. In: Perspective of Forest Genetic Tree Breeding on a Changing World, IUFRO World Series. Vienna, Austria. 6:45–55. [ Links ]
Castellanos, H., M. Sánchez–Olate, y D. Ríos. 2005. Embriogénesis somática como alternativa potencial para la regeneración in vitro del género Nothofagus. In: Gutiérrez B., O. Ortiz, y M. P. Molina (eds). Clonación de Raulí. Estado Actual y Perspectivas. INFOR CEFOR UACH. pp: 59–74. [ Links ]
Chalupa, V. 1983. Micropropagation of conifer and broadleaved forest trees. Communicationes Instituti Forestalis Cechosloveniae. 13:7–39. [ Links ]
Gómez, C., D. Ríos, y M. Sánchez–Olate. 2007. Efecto del subcultivo sucesivo sobre la caulogénesis adventicia de Eucalyptus globulus. Bosque 28 (1): 13–17. [ Links ]
Gutiérrez, B. 2000. Áreas productoras de semillas en el mejoramiento genético de Nothofagus. In: Ipinza R., B. Gutiérrez, y V. Emhart (eds). Domesticación y Mejora Genética de Raulí y Roble. Universidad Austral de Chile/Instituto Forestal. pp: 215–235. [ Links ]
Hoffmann, A. 1982. Flora Silvestre de Chile. Zona Austral. Fundación Claudio Gay. Santiago, Chile. Editorial Lord Cochrane. 258 p. [ Links ]
Ikemori, Y. K., R. M. Penchel, and F. L. G. Bertolucci. 1994. Integrating biotechnology into Eucalyptus breeding. International Wood Biotechnology Symposium. August 31th– September 1th. Tokio, Japan. pp: 77–84. [ Links ]
Ipinza, R., y J. Espejo. 2000. Biología Reproductiva en Nothofagus. In: Ipinza R., B. Gutiérrez, y V. Emhart (eds). Domesticación y Mejora Genética de Raulí y Roble. Universidad Austral de Chile/Instituto Forestal. pp: 75–93. [ Links ]
Jordán, M., J. Velozo, and A. Sabja. 1996. Organogenesis in vitro of Nothofagus alpina (P.et E.) Oerst., (Fagaceae). Plant Cell Report. 15:795–798. [ Links ]
Kleinschmit, J., D. K. Khunara, H.D. Gerhold, and W.J.Lobby. 1993. Past, present and anticipated applications of clonal forestry. In: Ahuja, M. R., and W.J. Libby (eds). Clonal Forestry II. Conservation and Application. Springer–Verlag. Berlin. pp: 9–41. [ Links ]
Kosai, T. 1991. Micropropagation under photoautotrophic conditions. In: Debergh, P. C., and R.H. Zimmerman (eds). Micropropagation: Technology and Application. Kluwer Academic Publishers. pp: 447–470. [ Links ]
MacRae, S., and P. Coterill. 1997. Macropropagation and micropropagation of E. globulus. Means of capturing genetic gain. Proceedings of the IUFRO Conference on Silviculture and Improvement of Eucalyptus v2: Biotechnology applied to genetic improvement of tree species. Salvador, Brasil. pp: 102–110. [ Links ]
Martínez Pastur, G., y M. Arena. 1995. Desarrollo preliminar de protocolos de cultivo in vitro para las especies de Nothofagus caducifolios patagónicos. Actas IV Jornadas Forestales Patagónicas. San Martín de los Andes. Argentina. pp: 127–136. [ Links ]
Martínez Pastur, G., M. Arena, and O. Caso. 1995. In vitro propagation of Nothofagus oblicua (Fagaceae). Aust. J. Bot. 43:601–607. [ Links ]
Martínez Pastur, G., and M. Arena. 1996. In vitro propagation of Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mil. Phyton. 58:1–7. [ Links ]
Martínez Pastur, G., M. Arena, y O. Caso. 1997a. Micropropagación de Nothofagus pumilio (Poepp. et End.) Krasser. Bosque. 18 (2): 43–50. [ Links ]
Martínez Pastur, G., M. Arena, and O. Caso. 1997b. In vitro propagation of Nothofagus antarctica from phaeroblasts and saplings. Biocell. 21(3): 231–236. [ Links ]
Ortiz, O., y B. Gutiérrez. 2005. Macropropagación vegetativa de raulí: Injertación y enraizamiento de estacas. In: Gutiérrez B., O. Ortiz, y M. P. Molina (eds). Clonación de Raulí. Estado Actual y Perspectivas. INFOR CEFOR UACH. pp: 9–40. [ Links ]
Ríos, D., M. Avilés, M. Sánchez–Olate, R. Escobar, y G. Pereira. 2005. Variación de la tasa de enraizamiento asociada al número de subcultivo y diámetro de microtallos de castaño Castanea sativa Mill. Agric. Téc. (Chile). 65(3): 258–264. [ Links ]
Sedjo, R.A. 1997. The forest sector: Important innovations. Discussion Paper 97–42. Resource for the Future, Washington, D.C. 55 p. [ Links ]
Smith, D. 1997. The role of in vitro methods in pine plantation establishment: the lesson from New Zealand. Plant Tissue Culture and Biotechnol. 3(2): 63 –73. [ Links ]
Vieitez, A., A. Ballester, M. San José, and E. Vieitez. 1985. Anatomical and chemical studies of vitrified shoots of chestnut regenerated in vitro. Physiologia Plantarum. 65: 177–184. [ Links ] ]]>