Contenido de poliaminas en anteras y durante la germinación de polen en Pyrus pyrifolia Nakai
Polyamine content in anthers and during pollen germination in Pyrus pyrifolia Nakai
Omar Franco–Mora1,2* y Kenji Tanabe1
1 Laboratory of Horticulture, Faculty of Agriculture. Tottori University. Koyama Minami 4–101; 680–8553 Tottori. Tottori, Japan. *Autor responsable:(ofm@uaemex.mx) (tanabe@muses.tottori–u.ac.jp).
2 Dirección actual: Laboratorio de Genética, Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Fitomejoramiento, Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Autónoma del Estado de México, Campus El Cerrillo. 50200. Toluca, México.
]]>Recibido: Octubre, 2007.
Aprobado: Junio, 2008
Resumen
En dos ciclos de producción, 2003 y 2004, se determinó por la técnica de cromatografía líquida de alta resolución el contenido de poliaminas en anteras de pera japonesa (Pyrus pyrifolia Nakai), cvs. Niitaka, Housui y Choujuurou, 3, 2, 1 y 0 d antes de la antesis (DAA). En los tres cultivares el contenido de putrescina disminuyó de entre 9.8 y 11.2, a 4.2 y 5.6 µmol g–1 biomasa húmeda, al pasar de 3 a 2 DAA. El contenido de espermidina fue superior (p<0.05) en Housui y Choujuurou que en Niitaka a 3 DAA y al inicio de antesis (DIA), pero no a 2 y 1 DAA. Los contenidos de espermina fueron valores menores de 1 µmol g–1 BH en Niitaka, mientras que en Housui y Choujuurou se duplicaron de 4 a 8 y 3 a 6 µmol g–1 BH, de 3 DAA a DIA. La disminución de putrescina sugiere que hubo síntesis de espermidina y espermina en la maduración de las anteras productoras de polen. Durante la germinación de polen con los dos cvs. androfértiles, Housui y Choujuurou, incubados en medio líquido por 0, 0.5, 1.5, 3, 4 , 6 y 8 h, se alcanzó una germinación aproximada de 90% en 4 h. En dicha germinación la putrescina decreció significativamente en los primeros 30 min y la espermidina hasta las 4 h, en ambos cultivares. En cambio, la espermina aumentó significativamente (p<0.05) a los 30 min y a las 3 h, lo que sugiere su biosíntesis durante la germinación del polen.
Palabras clave: Pyrus pyrifolia, espermidina, espermina, germinación del polen, putrescina, tubo polínico.
Abstract
In two production cycles, 2003 and 2004, the polyamine content in anthers of Japanese pear (Pyrus pyrifolia Nakai), cvs. Niitaka, Housui and Choujuurou, was determined through the technique of high performance liquid chromatography, 3, 2, 1 and 0 d before anthesis (DBA). In the three cultivars, the putrescine content decreased from between 9.8 and 11.2, to 4.2 and 5.6 µmol g–1 humid biomass (HB), when passing from 3 to 2 DBA. The spermidine content was higher (p<0.05) in Housui and Choujuurou than in Niitaka at 3 DBA and at day of onset of anthesis (DOA), but not at 2 and 1 DBA. The spermidine contents values were lower than 1 µmol g–1 HB in Niitaka, whereas in Housui and Choujuurou they doubled from 4 to 8 and 3 to 6 µmol g–1 HB, from 3 DBA to DOA. The reduction in putrescine suggests that there was synthesis of spermidine and spermine in the maturation of the pollen producing anthers. During the germination of pollen in both androfertile cvs., Housui and Choujuurou, at 0, 0.5, 1.5, 2, 3, 4, 6 and 8 h, an approximate germination of 90% was reached in 4 h. In this germination, putrescine decreased significantly (p<0.05) in the first 30 min and the spermidine in 4 h, in both cultivars. In contrast, the spermine increased significantly at 30 min and at 3 h, which suggests its biosynthesis during the germination of the pollen.
]]> Key words: Pyrus pyrifolia, spermidine, spermine, germination of pollen, putrescine, pollen tube.
INTRODUCCIÓN
Las poliaminas son productos naturales presentes, en forma libre y conjugada, en todas las células vegetales. Putrescina, espermidina y espermina son las principales poliaminas, por su relación con numerosos procesos celulares, como división celular, empaquetamiento de ácidos nucleicos, replicación de ADN, y otros (Galston y Kaur–Sawhney, 1995; Childs et al., 2003). Las células vegetales parecen haber desarrollado mecanismos para regular los niveles intracelulares de poliaminas, ya que niveles insuficientes provocan bajas tasas de crecimiento y en algunos casos la muerte celular; además, niveles altos de poliaminas pueden promover transformación celular y, en ocasiones, generan apoptosis (Childs et al., 2003). La biosíntesis de poliaminas en vegetales se inicia con la agmatina o la ornitina, hasta la formación de putrescina, seguida de espermidina, y finalmente de espermina (Bagni y Tassoni, 2001).
En especies frutales, las poliaminas se han relacionado con procesos de la fructificación; como polinización, fecundación y desarrollo precosecha y postcosecha del fruto (Del Duca et al., 1997; Franco–Mora et al., 2005a). Se ha propuesto que la biosíntesis de poliaminas es necesaria para la maduración del polen y el crecimiento del tubo polínico en tabaco (Nicotiana tabacum) y tomate (Solanum lycopersicum, antes Lycopersicon esculentum) (Chibi et al., 1993; Chibi et al., 1994; Song et al., 2001). En el mutante de tomate "sin–estambres–2" las cantidades altas de poliamina, en comparación con los contenidos normales, se han asociado con la expresión de esterilidad masculina (Biasi et al., 2001). En kiwi (Actinidia deliciosa), se ha asociado un contenido alto de poliaminas con la degeneración del polen en flores femeninas y la división celular de óvulos; la espermidina se ha propuesto como un marcador bioquímico adecuado para estudios de diferenciación sexual en flores (Biasi et al., 2001).
En pera japonesa Housui (Pyrus pyrifolia Nakai) se determinó que el contenido de poliaminas en estilos polinizados varía con la fuente de polen, compatible o auto–incompatible (Franco–Mora et al., 2005b). Cultivares como Niitaka y Kumoi no desarrollan polen o éste es estéril (Kajiura y Sato, 1990; Masseron et al., 1992). Debido a que cantidades anormales pueden estar relacionados con la esterilidad masculina en vegetales (Rastogi y Sawhney, 1990), en este trabajo se determinó el contenido de poliaminas en anteras próximas a apertura floral de tres cultivares de pera japonesa: dos con producción normal de polen y uno con escasa presencia. La hipótesis fue que la cantidad de poliaminas en las anteras de Niitaka sería estadísticamente diferente al de Housui y Choujuurou. Además, se determinó el contenido de poliaminas durante la germinación del polen para observar su cinética durante este proceso.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se emplearon árboles de tres cultivares del Huerto Otzuka de la Universidad de Tottori, Tottori, Japón; esta prefectura produce más de 50% de la pera japonesa en ese país, y se localiza entre 133° 56' 56" y 134° 26' 37" E y 35° 34' 11" y 35° 16' 6" N. Los árboles del cv. Niitaka tenían 10 años de edad, y se encontraban en un sistema de conducción de pérgola; los árboles del cv. Housui tenían 24 años y son manejados en pérgola, mientras que los de Choujuurou tenían 24 años y su sistema de conducción es en líder central. Los árboles de Niitaka y Housui están establecidos en líneas de 12 y se usó tres árboles centrales de cada línea como una repetición. Choujuurou es usado tradicionalmente como donador de polen para los cultivares que actualmente se comercializan en el mercado japonés, como Niitaka y Housui (Franco–Mora et al., 2005b). Sus árboles están establecidos en los bordos del huerto y de él se usaron dos árboles contiguos por repetición. Durante dos ciclos de cultivo (2003 y 2004) se hicieron muestreos en los mismos árboles en los primeros días de abril, cuya temperatura media es 16.9 °C, máxima 21.7 °C y mínima 12.7 °C, con una humedad relativa de 72% (Masseron et al., 1992). Todos muestreos se realizaron a las 7 h.
]]> Cuantificación de poliaminas en anterasDurante 3 d antes de antesis (DAA) y hasta el día de inicio de antesis (DIA) se recolectaron flores en el mismo estadío de apertura, en cinco repeticiones por cultivar y por día, y se transportaron durante 10 min a 4 °C al laboratorio. Una vez separadas las anteras de los otros componentes, se pesó 0.1 g de ellas y se agregó 1 mL de ácido perclórico 5% (v/v, en agua destilada) que contenía 1,6–hexanediamina a 5 µmol como estándar interno. Del tejido macerado se extrajeron poliaminas por 1 h a 4 °C. Después de centrifugar las muestras a 4 °C por 15 min a 10000 g, se obtuvo el sobrenadante y se almacenó a –20 °C (Smith y Davies, 1985; Franco–Mora et al., 2005b).
El análisis de poliaminas se hizo con el método de dansilación (Smith y Davies, 1985): 100 µL del extracto con las poliaminas libres se mezclaron con 200 µL de solución saturada de carbonato de sodio y 400 µL de solución de cloruro de dansilo (Sigma) (7.5 mg mL–1 acetona). Después de agitar por 30 s con un vórtex, la solución se incubó a 60 °C en oscuridad por 1 h. El exceso de la solución de cloruro de dansilo se removió con 100 µL de una solución de prolina (100 mg mL–1 agua destilada) que se agregó a la mezcla y se incubó 30 min más. Las poliaminas fueron extraídas con 1 mL de tolueno, con agitación vigorosa conseguida con un vórtex por 30 s. La fase orgánica se secó al vacío y se disolvió en 1 mL de metanol grado reactivo para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Una vez filtrados, los derivados fueron analizados en un sistema HPLC (Hitachi Modelo 655A–12, Tokio) con una columna de sílica ODS–3056 (diámetro de partícula 5 µm, 4 x 250 mm). Las muestras fueron eluidas con metanol a un flujo de 1 mL min–1, cambiando la concentración de metanol de 60 a 95 % en 23 min. Se usó un detector de fluorescencia (Hitachi, Modelo F–1050), con excitación a una longitud de onda de 360 nm y emisión a 510 nm. Antes del análisis de muestras se prepararon curvas patrón con clorhidrato de putrescina (99% pureza), triclordidrato de espermidina (98% pureza) y tetrahidroclorhidrato de espermina (95% pureza). Los resultados se presentan en µmol g–1 biomasa húmeda (BH). Todos los reactivos se obtuvieron de Wako (Osaka, Japón), excepto cuando se indica otro proveedor.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron conforme a un diseño estadístico completamente al azar con dos factores: 3 cultivares (Niitaka, Choujuurou y Housui) y 4 días a apertura floral. Así, hubo 12 tratamientos, cada uno con cinco repeticiones. Para los cvs. Niitaka y Housui hubo 3 árboles por unidad experimental, y 2 para Choujuurou. Cuando los valores de F fueron significativos, las medias se compararon con la prueba de Tukey (p<0.05).
Cuantificación de poliaminas durante la germinación del polen
Para la germinación del polen se emplearon tres repeticiones por tiempo de incubación (0, 0.5, 1.5, 2, 3, 4, 6 y 8 h) para los cvs. Housui y Choujuurou; las anteras del cv. Niitaka tuvieron escasa producción de polen, por lo cual no fue posible incluirlo en el análisis de germinación de polen. El polen se obtuvo de anteras que se abrieron después de incubarse en el laboratorio a 20 °C con luz blanca proveniente de focos de 20 W durante 8 h; y se almacenó a –20 °C en frascos de vidrio con cápsulas de NaOH. Después, la germinación del polen se hizo en el medio líquido propuesto por Shivana y Heslop–Harrison (1981): H3BO3, Ca(NO3)2, MgCl2 y KNO3, todos a 10–3 M, más 10% (p/v) de sacarosa. En 1 mL de la solución se colocó 0.005 g de polen, se agitó por 20 s en un vortex, y se incubó a 24 °C en oscuridad. Para cada tiempo de incubación (0, 0.5, 1.5, 2, 3, 4, 6 y 8 h), se emplearon tres tubos por repetición. Al final de la incubación la solución del medio con el polen se centrifugó por 20 min a 10000 g para separar los componentes. La fase sólida, que contenía los granos de polen, se usó para determinar el contenido de poliaminas con el método de dansilación indicado.
El porcentaje de germinación del polen se determinó en una alícuota de una muestra de polen con medio. La solución se distribuyó en un portaobjeto y se tiñó con cinco gotas de ácido fucsínico a 1 % (p:v, en agua destilada). Luego, los granos de polen germinados se contaron bajo un microscopio óptico. Un grano de polen germinado fue el que presentó un tubo polínico con longitud mayor que el diámetro del grano. En tres repeticiones se hicieron tres conteos con un mínimo de 100 granos de polen en cada una, para cada tratamiento y tiempo de incubación.
El diseño experimental fue de bloques completos al azar con dos factores: 2 cultivares y 8 tiempos de incubación. Se hizo un análisis de varianza, y cuando el valor de F fue significativo se usó la prueba de Tukey (p<0.05) para comparar los contenidos de poliaminas en relación con los tiempos de incubación.
]]>RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Contenido de poliaminas en anteras
En los tres cultivares se observó un descenso significativo (p<0.05) del contenido de putrescina de 3 a 2 DAA; luego no hubo variación estadística, con excepción de Niitaka que descendió de 2 a 1 DAA (Figura 1). La espermidina decreció de 3 a 2 DAA en los cvs. Housui y Choujuurou pero no en Niitaka; después, la espermidina aumentó significativamente de 2 a 1 DAA, luego decreció en Niitaka y Housui, mientras que en Choujuurou aumentó (Figura 1). Entre cultivares varió el contenido de espermina: en Housui y Choujuurou, ambos con producción normal de polen, aumentó de 4 y 3 a 8 µmol g–1 BH, desde 3 DAA hasta DIA, pero en el cv. Niitaka permaneció estable en 1 µmol g –1 BH (Figura 1).
En mutantes de tomate se encontró relación entre contenidos altos de putrescina, espermidina y espermina en formas libres y la esterilidad masculina (Rastogi y Sawhney, 1990). Pero en la presente investigación en anteras sin producción de polen, (Niitaka), el contenido de espermina fue significativamente menor que en anteras productoras de polen. Según Chibi et al. (1994), durante el desarrollo de las anteras de tabaco la putrescina se convierte en esperdimina y luego en espermina (Bagni y Tassoni, 2001), ya que el contenido de ésta aumentó cuando el de putrescina disminuyó. Los resultados del presente estudio sugieren que la biosíntesis de espermina ocurrió únicamente en los cultivares con producción de polen mientras que en Niitaka disminuyó el contenido de putrescina, posiblemente porque esta poliamina sólo se transformó en espermidina (Bagni y Tassoni, 2001), pero sin evolucionar hasta espermina.
Contenido de poliaminas durante la germinación del polen
Los dos cultivares evaluados en esta fase, Choujuurou y Housui, mostraron contenidos estadísticamente diferentes (p<0.05) de putrescina, espermidina y espermina en diferentes tiempos de incubación del polen (datos no mostrados); sin embargo, el patrón de evolución de poliaminas fue similar en ambos cultivos. Putrescina decreció rápidamente a 30 min de iniciado el proceso, mientras que espermidina decreció significativamente hasta las 4 h y en espermina hubo un incremento tanto a los 30 min como a las 3 h (Figura 2). El porcentaje de germinación del polen no fue diferente (p<0.05) para ambos cultivares, lo cual parece indicar que los patrones de poliaminas observados, a pesar de ser estadísticamente diferentes en cuanto a contenidos (datos no mostrados), son similares en cuanto a cinética y sugieren una biosíntesis inicial de espermina, factor indispensable para la germinación de polen en especies como tomate (Song et al., 2001).
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Contrario a lo aquí reportado, Chibi et al. (1994) observaron un incremento en el contenido de putrescina, espermidina y espermina 60 min después del inicio de la germinación de polen de tabaco; pero son similares a los resultados de Bagni et al. (1981), quienes observaron una reducción de putrescina durante la germinación de polen de manzano (Malus domestica Borkh.) en medio líquido, reducción que atribuyeron a un mecanismo de secreción de esta poliamina. Al respecto, Del Duca et al. (1997) sugirieron que además de la probable dilución en el medio, la putrescina podría ligarse a proteínas de peso alto y salir del reservorio de poliaminas.
Por tanto, la disminución en el contenido de putrescina observada en este trabajo podría ser explicada por dos mecanismos. Uno es la biosíntesis de espermina desde la putrescina, con la espermidina como producto intermedio (Bagni y Tassoni, 2001). El otro sería la secreción de putrescina al medio, lo que explicaría su disminución en el polen (Bagni et al., 1981).
Según Song et al. (2001, 2002), la biosíntesis de espermidina y espermina es necesaria para la germinación del polen de tomate. Parece ser, entonces, que el incremento en el contenido de espermina en el polen durante su germinación en los cvs. Housui y Choujuurou está relacionada con su germinación normal. Estos resultados sugieren que la biosíntesis de espermina está presente durante la germinación del polen en pera japonesa.
CONCLUSIONES
El incremento del contenido de espermina durante el desarrollo de anteras con polen fértil y la germinación del grano de polen, sugiere, además de su biosíntesis, que este biorregulador vegetal tiene algunas funciones en el proceso de fructificación. Por el contrario, las anteras no funcionales siempre presentaron niveles bajos de espermina, pero no así de espermidina y putrescina. Durante los primeros 30 min de germinación in vitro del polen fértil, además del incremento de espermina, la putrescina disminuyó y la espermidina decreció o aumentó, según el cultivar.
LITERATURA CITADA
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