Contenido fenólico y acción antioxidante de extractos de acículas de Pinus cooperi, P. durangensis, P. engelmanii y P. teocote

Phenolic content and antioxidant action in needle extracts from Pinus cooperi, P. durangensis, P. engelmanii and P. teocote

María de los Ángeles Sáenz–Esqueda¹, Martha Rosales–Castro², Nuria Elizabeth Rocha–Guzmán¹, José Alberto Gallegos–Infante¹ y Rubén Francisco González–Laredo¹

¹ Instituto Tecnológico de Durango. Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica. Felipe Pescador 1830 Ote. 34080 Durango, Dgo. México. gonzalezlaredo@gmail.com.

² CIIDIR Unidad Durango. Instituto Politécnico Nacional. Becaria de COFAA–IPN.

Manuscrito recibido el 20 de febrero de 2009
Aceptado el 9 de marzo de 2010

RESUMEN

Durango es uno de los estados con mayor riqueza forestal, siendo el pino el género dominante en sus bosques, de ahí el interés por evaluar química y biológicamente extractos de acículas de Pinus cooperi (COO), P durangensis (DUR), P engelmanii (ENG) y P teocote (TEO). Se practicaron extracciones sucesivas con acetona y metanol acuosos de acículas de pino desengrasadas previamente con hexano, en las cuales DUR y ENG mostraron respectivamente los mejores rendimientos. Los valores más altos del contenido de fenoles totales fueron los extraíbles acetónicos de TEO y los metanólicos de ENG. Se realizó una purificación cromatográfica a los extraíbles acetónicos de TEO, generando cinco fracciones; F3–TEO con 489,6 EC presentó el mayor contenido fenólico. Los extractos acetónicos y metanólicos de TEO y la fracción purificada F3–TEO presentaron la mayor concentración de taninos condensados. En el ensayo de DPPH, los extractos más relevantes según su concentración efectiva media (CE₅₀) fueron los acetónicos de TEO (223,5 ppm) y las fracciones F3–TEO (145,0 ppm) y F4–TEO (150,8 ppm). De manera similar, en el ensayo de ABTS, los extractos de TEO en acetona (27,7%) y en metanol (18,2%), así como las fracciones F3–TEO (60,1%) y F4–TEO (55,8%) mostraron la supresión más elevada de la oxidación. En el ensayo de la oxidación de LDL, la mayor actividad inhibitoria fue mostrada por extractos acetónicos, particularmente por ENG (99,4%) a una concentración de 90 ppm. Los extractos acetónicos de TEO y de ENG presentan potencial como fuente de polifenoles bioactivos.

Palabras clave: ABTS, acículas, antioxidante, DPPH, LDL, polifenoles.

ABSTRACT

Coniferous trees are a vast resource in Durango, Mexico forests and a potential nontimber source of these chemicals, thus, our study for analyzing phenolic content and biological activity in needle extracts from Pinus cooperi (COO), P. durangensis (DUR), P. engelmanii (ENG) and P. teocote (TEO). Pine needles were dewaxed with hexane and extracted with aqueous acetone and methanol. DUR and ENG extracts showed the higher yields, while acetone TEO and methanol ENG extracts showed the highest catechin equivalent (CE) contents. A partial chromatographic purification on acetone TEO extracts produced five fractions, the third one (F3–TEO) had the highest phenolic content (489,6 CE). In condensed tannins contents, acetone and methanol TEO extracts, as well fraction F3–TEO were the best (24,3, 15.7 and 44,4 mg/g extract, respectively). In DPPH activity, the more effective CE₅₀ were obtained from TEO acetone extract (223,5 ppm) and fractions F3–TEO (145,0 ppm) and F4–TEO (150,8 ppm). In ABTS assay, TEO acetone (27,7%) and methanolic (18,2%) extracts, and fractions F3–TEO (60,1%) and F4–TEO (55,8%) were the best. In LDL assay the highest inhibitory activity was shown by acetone extracts, particularly ENG (99,4%) at 90 ppm. Therefore acetone extracts from TEO and ENG may have utilization as a potential source of bioactive phenolics.

INTRODUCCIÓN

El particular hábitat de la sierra mexicana ha favorecido la mayor variedad de especies de Pinus en el mundo. El bosque de pino se caracteriza por ser una comunidad siempre verde asociada con encinares y otras especies, y es el de mayor importancia económica para la industria forestal de México, sustentando actividades forestales como aserrío, resinación, producción de pulpa celulósica, postería y recolección de semilla. Sin embargo, el follaje conífero está por recibir aún un adecuado aprovechamiento como recurso natural no maderable.

La vegetación forestal está dominada por pinos con alturas promedio de 15 m a 30 m. Estos pinares tienen un estrato inferior relativamente pobre en arbustos, pero con abundantes gramíneas, esta condición los expone a frecuentes incendios y a tala inmoderada. Las especies más comunes en México son pino (P. hartwegii), ocote blanco (P. montezumae), pino lacio (P pseudostrobus), pino (P rudis), pino escobetón (P michoacana), pino chino (P. teocote), ocote trompillo (P. oocarpa), pino ayacahuite (P. ayacahuite), pino (P. pringlei), P. duranguensis, P. chihuahuana, P. engelmanii, P. lawsonii, P. oaxacana, entre otros (Conafor, 2000–2006).

Durango, México es uno de los principales productores de madera de pino, contando con aproximadamente veinte especies, de las cuales diez son las más aprovechadas por su abundancia y calidad de madera, algunas de ellas son Pinus durangensis, P. arizonica, P. engelmannii y P. cooperi (García y González, 2003). Otras especies representativas son P. leiophylla, P. ayacahuite y P chihuahuana. Del aprovechamiento de la madera se generan altos volúmenes de corteza que representan de 10% a 15% del peso total del árbol (Kofujita et al., 1999). Adicional–mente se generan volúmenes no cuantificados de follaje de alta riqueza fitoquímica. Los extraíbles o metabolitos secundarios presentes en la madera, corteza y follaje de las pináceas, son múltiples compuestos orgánicos de naturaleza diversa que incluyen grasas, ceras, ácidos resínicos, terpenoides, esteroides y polifenoles (flavonoides y taninos). Todos ellos son producidos por el árbol como protección o defensa ante ataques microbianos o de insectos (Perry, 1991). A los metabolitos secundarios se les consideraba sustancias de desecho o errores de las rutas metabólicas primarias de las plantas. Sin embargo, su gran abundancia, su variedad estructural y el descubrimiento de rutas biosintéticas y de enzimas específicas para su síntesis han cambiado este enfoque. Un caso particular son los polifenoles o taninos vegetales que poseen al menos un anillo aromático con grupos hidroxilo en su estructura química. Los polifenoles son micronutrientes abundantes en nuestra dieta y existen evidencias de su rol en la prevención de enfermedades degenerativas como el cáncer y enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas (Markham, 1989). Los polifenoles tienen diversa función, tamaño y arreglo estructural y se pueden clasificar en ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos y lignanos. Los flavonoides comparten una estructura común de dos anillos aromáticos unidos por una cadena propánica (Bors et al., 1990). En función de sus características estructurales se pueden clasificar en chalconas, flavanos, flavanoles, flavonas, antocianidinas e isoflavonoides. Entre otras, se les atribuyen actividades antifúngica y bactericida, e importante capacidad para fijar metales como hierro y cobre, además de conferir color que promueve fenómenos de polinización (Formica y Regelson, 1995). Algunas patentes norteamericanas registran el uso de extractos de hojas de pino como ingredientes para combatir la alopecía (Uchida et al., 1996), como ingrediente para preparar tofu (Im, 2000), bebidas tonificantes (Kang, 1987) y nutracéutico cardiprotector (Ji, 2001).

OBJETIVO

A través de la evaluación del contenido fenólico y de la acción bioquímica de los extractos de acículas de Pinus cooperi (COO), P. durangensis (DUR), P. engelmanii (ENG) y P. teocote (TEO), determinar el potencial antioxidante del follaje de estas especies, que fundamente su eventual aprovechamiento.

Material de estudio. Las acículas se colectaron en el ejido Chavarría Viejo, del municipio de Pueblo Nuevo, Durango. Las muestras fueron identificadas y depositadas en el Herbario del CIIDIR–IPN Unidad Durango. Las acículas se secaron a la sombra, se cortaron en segmentos pequeños y se molieron.

Extracciones sucesivas. El material previamente desengrasado con hexano se extrajo con acetona acuosa (70%) y se separó por filtración; el extracto se concentró en rotaevaporador y se liofilizó. El material remanente fue extraído con metanol acuoso (50%), filtrado y el extracto, rotaevaporado y liofilizado.

Evaluación de fenoles totales. Se prepararon muestras de extractos crudos y fracciones purificadas a 100 ppm en agua libre de CO₂. A una muestra (125 µL) se le adicionó agua (500 µL) y reactivo Folin Ciocalteu 2N (125 µL), se agitó y dejó reposar 6 minutos, luego se agregó Na₂CO₃ 7% (1,25 mL) y agua libre de CO₂ (1 mL). Los tubos se agitaron nuevamente y dejaron reposar (90 minutos), protegidos de la luz (Waterman y Mole, 1994). Después se midió la absorbancia a 760 nm en un espectrofotómetro Cary50. Se construyó una curva de calibración de catequina como estándar (40 µg/mL –120 µg/mL). Los resultados se reportan como miligramos equivalentes de catequina por gramo de extracto seco.

Evaluación de taninos condensados. Los extractos crudos y fracciones purificadas se prepararon a 1000 ppm. A 50 µL de muestra se le agregaron 3 mL de vainillina (4% en metanol), 1,5 mL de HCl (concentrado), se agitó y dejó reposar 15 minutos en la oscuridad. Después se midió la absorbancia a 500 nm contra un blanco de metanol. Al mismo tiempo se construyó una curva de calibración con catequina en un rango de 100 ppm a 600 ppm (Heimler et al., 2005). Los resultados se reportan como miligramos equivalentes de catequina por 100 mg de extracto.

Evaluación de capacidad antioxidante

Método del DPPH (2,2–difenil–1–picrilhidracilo). Los extractos acetónicos se evaluaron a 200, 250, 300 y 350 ppm, los de metanol a 500, 750, 1000 y 1200 ppm y las fracciones purificadas a 100 y 2000 ppm. Se colocaron 2900 µL del reactivo de DPPH y 100 µL de muestra, se agitó y midió la absorbancia a 515 nm a tiempo cero y a 30 minutos (Brand–Williams et al., 1995). Se calculó la concentración efectiva media (CE₅₀) de cada muestra como indicador de la concentración requerida para estabilizar 50% del radical presente. Los resultados se reportan como CE₅₀ en ppm.

Método del ABTS (ácido 2,2'–azinobis–3–etilbenzotiazolin–6–sulfónico). Las muestras se probaron a 100 ppm en etanol absoluto. El radical se diluyó a una absorbancia de (0,70±0,1) nm a 754 nm. Se utilizaron 40 µL de muestra y 960 µL de radical y se leyó a 754 nm; la absorbancia se monitoreó a 1 y 6 minutos después de adicionar el radical (Re et al., 1999). Los resultados obtenidos se reportan como capacidad atrapadora de radicales libres (%RSA).

Inhibición de la oxidación de Lipoproteínas de Baja Densidad (LDL). Las LDL se precipitaron a partir de plasma de voluntarios sanos. Las muestras se probaron a 30, 60 y 90 ppm. En tubos falcon de 15 mL, se colocaron 400 µL de buffer de fosfatos, 100 µL de sulfato de cobre, 100 µL de muestra y 400 µL de LDL. Se agitaron e incubaron a 37 °C por 180 minutos. Luego se agregó 1 mL de ácido tricloroacético (5%) y 1 mL de ácido tiobarbitúrico (0,37%), se agitó por 20 minutos en baño María a punto de ebullición, después se enfrió en hielo por 10 minutos y se agregaron 2 mL de butanol, se mezcló bien y centrifugó a 3500 rpm (10 min). Se extrajo el sobrenadante (fracción soluble en butanol) y se leyó a 532 nm contra un blanco de butanol (Re et al., 1999). Se utilizó catequina como referencia. Los resultados se reportan como porcentaje de inhibición de oxidación de LDL.

Purificación en columna. Una parte del extracto crudo de acetona se purificó en una columna con Fractogel HW–40. Se eluyó primero con metanol, separando dos fracciones de 100 mL (F1, F2), posteriormente se eluyó con acetona 70%, y se obtuvieron tres fracciones más de 150 mL (F3, F4 y F5).

Análisis estadístico. Los datos obtenidos se valoraron mediante análisis de varianza de una sola vía (α= 0,05). Se realizó una prueba de comparación de medias por el método de Tukey (α= 0,05). En todos los casos los experimentos fueron realizados al menos por duplicado.

RESULTADOS

Los rendimientos obtenidos en las extracciones sucesivas de acículas de pino con acetona 70% y metanol 50% se muestran en la tabla 1. Salvo por el extracto COO, los extractos acetónicos presentaron un rendimiento similar cercano a 10%, mientras que ENG sorprende con un rendimiento aún mayor en el extracto metanólico.

La evaluación de fenoles totales se muestra en la tabla 2. Los extractos acetónicos oscilaron entre 169,6 y 399,2 equivalentes de catequina (EC), mientras que los extractos metanólicos resultaron considerablemente más bajos (p<0,05) de 49,0 a 140,6 EC. El contenido de fenoles totales en las fracciones purificadas a partir del extracto acetónico de TEO varió entre 163,5 y 489,6 EC (Tabla 3), en un rango similar al que presentan los extractos acetónicos.

El contenido de taninos condensados en los extractos acetónicos se presentó de 18,4 a 24,3 mg/g y en los metanólicos de 13,2 a 15,7) de extracto seco (Tabla 2), siendo diferentes unos de otros (p<0,05). Los taninos condensados en los extractos acetónicos fueron mayores, mostrando la misma tendencia que su contenido de fenoles totales. De manera similar, en las fracciones purificadas del extracto acetónico de TEO se encontró un contenido de taninos condensados disperso de 6,8 a 44,4 mg/g de extracto seco, siendo F3–TEO y F5–TEO las fracciones con la mayor concentración (Tabla 3).

En la evaluación de capacidad antioxidante por el método del DPPH, la CE₅₀ más eficiente que se obtuvo de los extractos crudos correspondió al extracto acetónico TEO con un valor de 223,5 ppm (Tabla 2). Entre los extractos metanólicos, esta misma especie fue la única que mostró actividad antioxidante suficiente por encima del umbral de 50%, aunque a concentraciones muy altas (784,1 ppm), ya que para las condiciones del análisis, los otros tres extractos mostraron una actividad máxima del orden de 30%, que es insuficiente para estimar su CE₅₀.

Entre las fracciones purificadas, destacan la F3–TEO y la F4–TEO con CE₅₀ de 145,0 ppm y 150.8 ppm, respectivamente, como las más eficientes de las muestras analizadas (Tabla 3). Sin embargo, estos valores están aún alejados del estándar catequina con una CE₅₀ de 90,5 ppm. Se encontraron diferencias significativas (p<0,05) entre los extractos acetónicos excepto para COO y ENG. De igual manera se analizaron los resultados de las fracciones purificadas, mismas que mostraron diferencias significativas (p<0,05) entre los extractos excepto entre F3–TEO y F4–TEO.

Los resultados de la actividad antioxidante de los extractos acetónicos ante el radical libre ABTS, expresados como porcentaje de actividad antioxidante, se encontraron en el rango de 18,8% a 27,7%, mientras que los metanólicos de 10,3% a 18,2% (Tabla 2) muy alejados del estándar catequina (66,83%). Sin embargo las fracciones purificadas de TEO oscilaron entre 32,51% a 64,33%, donde F3 y F4 presentaron una actividad comparable a dicho estándar (Tabla 3).

En el análisis cromatográfico por HPLC de las 13 muestras analizadas, 11 resultaron positivas cualitativamente para el compuesto catequina–galato. Sin embargo, sólo en cinco de ellas se les encontró de manera significativa, como fue el caso de los extractos crudos acetónicos de TEO, ENG y DUR, así como en las primeras fracciones purificadas F1 y F2, del extracto acetónico de acículas de TEO, aunque la F3 fue la que mostró mayor respuesta antioxidante (Figura 1).

DISCUSIÓN

Como era previsible el rendimiento de los extractos acetónicos es mayor que los metanólicos, excepto por los extractos de ENG que muestran contenidos similares en ambos casos (p<0,05). El rendimiento de las extracciones acetónicas de las cuatro especies es similar excepto en los extractos de COO que corresponden aproximadamente a la mitad del resto de los pinos (p<0,05). En los extractos metanólicos, ENG presentó el máximo valor acumulado cercano a 19%. Cabe señalar que la extracción de compuestos fenólicos de material vegetal está influenciada por la naturaleza química de éste, por el método de extracción, el tamaño de partícula, el tiempo y las condiciones de almacenamiento (Prior y Cao, 1999).

Se puede observar la mayor selectividad por polifenoles del solvente acetona acuosa al comparar los valores obtenidos con metanol acuoso, aunque se debe recordar que son extracciones sucesivas. El metanol como segundo solvente solamente extrae los componentes fenólicos residuales que no fueron extraídos por la acetona (Heimler et al., 2007). Esta diferencia en el solvente de extracción determina el rendimiento y calidad del contenido fenólico de ambos extractos (Stratil et al., 2006; Ninfali et al., 2005).

La determinación de taninos condensados es un indicador del contenido de proantocianidinas presentes en los extractos crudos tanto acetónicos como metanólicos. Este es un grupo muy importante de flavonoides que brindan en su mayoría pigmentación a las plantas que los contienen. Al analizar individualmente los resultados de los extractos crudos de cada especie de pino, se encontró que TEO, tanto en su extracto acetónico como en el metanólico, resultó con el mayor contenido de taninos condensados (p<0,05). En las fracciones purificadas a partir de TEO se observó una mayor concentración de taninos en las fracciones F3–TEO y F5–TEO, lo que sugiere al menos dos fracciones polifenólicas oligoméricas de diferente grado de polimerización. Se encontraron diferencias significativas (p<0,05) entre los extractos acetónicos de TEO y ENG respecto a COO y DUR, y los extractos metanólicos de TEO y ENG, así como en las fracciones F2–TEO y F4–TEO.

De acuerdo con el contenido de taninos condensados presente en extractos crudos y fracciones purificadas, se observa una relación entre el contenido de taninos condensados y la capacidad antioxidante de los mismos representada por su CE₅₀ del ensayo DPPH. Esto indica que la actividad antioxidante de los extractos está en función directa con su contenido de taninos, y éstos juegan un papel muy importante en el metabolismo del género y sobre todo de la especie Pinus teocote (Katsube et al., 2004).

Al analizar la posible correlación entre el contenido fenólico y la actividad antioxidante de los extractos y considerando que los métodos utilizados para el análisis de ambos se fundamentan en el mismo mecanismo de propensión a donar hidrógenos, se puede tener una lectura predictiva de que a mayor contenido fenólico en el extracto, mayor será su capacidad antioxidante (Katsube et al., 2004). Sin embargo, esta correlación no se presenta en todos los casos. La correlación lineal obtenida entre el blanqueamiento del DPPH y el contenido fenólico de las fracciones purificadas fue de r² = 0,6836.

El ensayo del radical libre ABTS se recomienda para medir la actividad antioxidante de gran diversidad de sustancias, tanto en medios acuosos como lipídicos, sin embargo, en cada caso se encuentran diferentes radicales, por ejemplo, en medio lipídico se tienen radicales peroxilos (Rice–Evans et al., 1996). Esta técnica se utiliza como referente para confirmar los resultados obtenidos de la prueba de DPPH (Okonogi et al., 2007), ya que ambas se fundamentan en el mismo mecanismo de acción: la donación de electrones. Por ello se analizó una correlación lineal entre las dos técnicas, dando como resultado una r² de 0,684, lo cual nos indica que sí hay cierta relación entre las mismas.

La presencia dominante del compuesto catequina galato en extractos y fracciones purificadas activas sugiere una acción quelante y antioxidante por atrapamiento de radicales libres. Lo anterior confirma el carácter monomérico de las fracciones iniciales (F1 y F2). Sin embargo, la mayor actividad, contenido fenólico y de taninos condensados se presentaron en las fracciones subsecuentes (F3, F4, F5), resaltadas por el hecho que se trata de fracciones fenólicas oligoméricas y poliméricas bioactivas que podrían ser evaluadas en ensayos de mutagenicidad (Kwak et al., 2006).

CONCLUSIONES

Las acículas de pinos representan una fuente potencial de polifenoles aún por explotar. Los extraíbles polares presentes pueden representar hasta 19% en peso, como en el caso de P. engelmannii. Estos extractos constituyen un significativo contenido fenólico rico en taninos condensados que se correlaciona con la actividad antioxidante mostrada contra los radicales libres DPPH y ABTS, como resulta en el caso particular de los extractos de P. teocote y sus fracciones purificadas. Por otra parte, se muestra también acción contra metales, inhibiendo la oxidación de sistemas lipídicos como es el caso de los extractos de P engelmanii.

Catequina–galato se encontró de manera significativa en los extractos acetónicos de Pinus durangensis, P engelmanii y P. teocote al igual que en las fracciones purificadas iniciales (F1 y F2) de este último. En estas fracciones fenólicas monoméricas, catequina–galato puede ser el componente fenólico más significativo que explique su acción estabilizadora sobre radicales libres y metales óxido–reductores. Además, esta capacidad quedó mas evidenciada en las fracciones fenólicas oligoméricas (F4 y F5).

La actividad antioxidante que presentó la especie P. teocote fue la más relevante de las muestras evaluadas y está relacionada con el contenido de taninos condensados de la misma. Complementariamente, la actividad mostrada por P. engelmannii en modelos lipídicos resulta sobresaliente y puede relacionarse con su alto contenido fenólico.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento al fondo sectorial Conacyt–Conafor por el apoyo financiero (clave 2006–041839). Se agradece al Conacyt la beca para realizar estudios de Maestría en Ciencias.

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Nota

Este documento se debe citar como: Sáenz–Esqueda, M. Á., M. Rosales–Castro, N.E. Rocha–Guzmán, J.A. Gallegos–Infante y R.F. González–Laredo. 2010. Contenido fenólico y acción antioxidante de extractos de acículas de Pinus cooperi, P. durangensis, P engelmanii y P teocote. Madera y Bosques 16(3):37–48.