Rosellinia necatrix in Rosa sp. and an evaluation of its sensitivity to fungicides

Rómulo García–Velasco^1*; Justino Gerardo González–Díaz¹; Grisel Domínguez–Arizmendi¹; Victoria Ayala–Escobar²; Sotero Aguilar–Medel¹

¹ Centro Universitario Tenancingo. Universidad Autónoma del Estado de México. km 1.5 Carretera Tenancingo–Villa Guerrero. Tenancingo, Estado de México. C.P. 56400 Correo–e: rgarciave@uaemex.mx (*Autor para correspondencia).

² Instituto de Fitosanidad. Colegio de Postgraduados. km 36.5 carretera México–Texcoco. Montecillo, Estado de México. C. P. 56230.

Resumen

En el año 2006 el cultivo de rosa en los municipios de Tenancingo, Villa Guerrero y Coatepec Harinas cubrió una superficie de 415 ha, siendo importante su valor de producción equivalente a 688,722,450.00 pesos. Este cultivo presenta una pudrición blanca en raíces, ocasionando pérdidas de plantas, ya que su control es poco efectivo. El presente estudio tuvo por objetivos la identificación de la especie del hongo asociado a la pudrición blanca de raíz en plantas de rosa, y la evaluación de su sensibilidad a fungicidas. Se colectaron muestras de plantas con raíces infectadas en Tenancingo, Villa Guerrero y Coatepec Harinas, en el Estado de México, obteniendo nueve cepas. Se evaluaron los fungicidas quintozeno, benomilo, fluazinam y tiofanato metílico, a dosis de 1 g·L^–1, 0.6 g·L^–1, 0.5 ml·L^–1 y 0.6 g·L^–1, respectivamente. El hongo asociado a la pudrición blanca de raíz presentó micelio con hinchamientos piriformes antes de la septa; como signos se encontraron cordones miceliales en raíz y cuello de la planta. El hongo fue identificado taxonómicamente como Rosellinia necatrix Prill. (Dematophora necatrix (Hart.) Berl.); lo cual fue corroborado mediante análisis molecular. Las cepas T1GRJ, T2GRJ y T3GRJ, de Tenancingo, y las cepas VG1GRJ, VG2GRJ, VG3GRJ y VG4GRJ, de Villa Guerrero, fueron insensibles al fungicida quintozeno, mientras que con los fungicidas benomilo, fluazinam y tiofanato metílico no presentaron crecimiento micelial. La cepa T4GRJ de Tenancingo presentó sensibilidad a todos los fungicidas. La cepa CH1GRJ de Coatepec Harinas, fue insensible a quintozeno y presentó ligero crecimiento con fluazinam; mientras que con benomilo y tiofanato metílico el crecimiento fue nulo.

Palabras clave: Resistencia, quintozeno, benomilo, fluazinam, tiofanato metílico.

Abstract

In 2006 rose cultivation in the municipalities of Tenancingo, Villa Guerrero and Coatepec Harinas covered an area of 415 ha, representing a significant production value equivalent to 688,722,450.00 pesos. This crop is attacked by white root rot disease, resulting in plant losses since control methods are ineffective. The objectives of this study were to identify the fungus species associated with white root rot disease in rose plants and evaluate its sensitivity to fungicides. Samples of plants with infected roots were collected in Tenancingo, Villa Guerrero and Coatepec Harinas in the State of Mexico, obtaining nine strains. The fungicides quintozene, benomyl, fluazinam and thiophanate methyl were evaluated at doses of 1 g·L¹, 0.6 g·L^–1, 0.5 ml·L^–1 and 0.6 g·L^–1, respectively. The fungus associated with white root rot disease presented mycelium with pyriform swellings before the septum; as symptoms, mycelial cords were found on the root and neck of the plant. The fungus was identified taxonomically as Rosellinia necatrix Prill. (Dematophora necatrix (Hart.) Berl.), which was confirmed by molecular analysis. The strains T1GRJ, T2GRJ and T3GRJ of Tenancingo and the strains VG1GRJ, VG2GRJ, VG3GRJ and VG4GRJ of Villa Guerrero were insensitive to the fungicide quintozene, while with the fungicides benomyl, thiophanate methyl and fluazinam no mycelial growth appeared. The strain T4GRJ of Tenancingo showed sensitivity to all fungicides. The strain CH1GRJ of Coatepec Harinas was insensitive to quintozene and presented slight growth with fluazinam, while with benomyl and thiophanate methyl there was no growth.

Keywords: Resistance, quintozene, benomyl, fluazinam, thiophanate methyl.

INTRODUCCIÓN

El Estado de México es el principal productor de flores en el país, destacando el cultivo de Rosa sp. (rosa) (Terrazas, 2002). En el año 2006 el municipio de Villa Guerrero contó con una superficie de 265 hectáreas dedicada a este cultivo, el municipio de Tenancingo con 115 y el de Coatepec Harinas con 35 ha. La producción respectiva de los tres fue de 2,208,248, 958,295 y 291,655 toneladas de tallos florales, con un valor de 529,978,800, 114,995,400 y 43,748,250 pesos,respectivamente (SEDAGRO, 2006).

Este cultivo frecuentemente es atacado por una serie de fitopatógenos. En México se tienen reportes de la presencia de Rosellinia necatrix Prill. dañando del área radical y cuello de la planta (Mendoza, 2002). Este hongo se encontró por primera vez en 1978, dañando plantaciones de manzano en el estado de Puebla (Romero–Cova, 1993).

Rosellinia sp. es un parásito facultativo con un amplio rango de hospedantes (García et al., 2005). Se ha reportado su daño en alrededor de 170 especies en 63 géneros y 30 familias (Khan, 1959). Ataca a un gran número de especies leñosas y semileñosas, aunque se ha encontrado en bulbos y rizomas (Pérez–Jiménez, 2006), pero principalmente árboles frutales, forestales y plantas ornamentales (Fresa, 1975; Streets, 1979).

La enfermedad se presenta en manchones, sobre todo en zonas del terreno con exceso de humedad. En el suelo se pueden observar las raíces invadidas por micelio blanco algodonoso que se torna negro conforme envejece (Fresa, 1975; Simons, 1997). En la parte aérea, las plantas presentan follaje escaso, además de muerte de ramas; las hojas muertas pueden permanecer adheridas a las ramas durante mucho tiempo (Romero–Cova, 1993).

El control químico de Rosellinia necatrix se basa en tratamientos de esterilización de suelo (Ruano–Rosa et al., 2007; García et al., 2005; Smith et al., 1992) mediante aplicaciones preventivas de bromuro de metilo (Fresa, 1975), o en aplicaciones de fungicidas en cuanto aparecen los primeros síntomas de la enfermedad (Tamayo, 2007). En México los fungicidas químicos más utilizados para el control de Rosellinia necatrix son quintozeno, benomilo, fluazinam y tiofanato metílico (Mendoza, 2002).

Algunos autores reportan que este método de control no da buenos resultados (Ruano–Rosa, 2006; García et al., 2005; Fresa, 1975), lo que posiblemente se deba a la presencia de resistencia. La resistencia se puede definir como la capacidad adquirida de un microorganismo para crecer en presencia de un compuesto al que habitualmente era sensible (Madigan et al., 2004; Dekker, 1977).

En un estudio realizado en España por López–Herrera y Zea–Bonilla (2007) para determinar la resistencia de R. necatrix procedente de raíces de aguacate, fueron probados in vitro e in vivo los efectos del benomilo, carbendazim, tiofanato metílico y fluazinam, todos pertenecientes al grupo de los bencimidazoles. En los ensayos in vitro los compuestos inhibieron totalmente el crecimiento del hongo, mientras que las evaluaciones in vivo mostraron que el carbendazim y el benomilo son menos efectivos.

En la región florícola sur del Estado de México, que incluye los municipios de Tenancingo, Villa Guerrero y Coatepec Harinas, no existen reportes formales de la presencia de Rosellinia spp. causando daños al cultivo de rosa, a pesar de que hay evidencias de tales daños. El presente estudio tuvo como objetivos determinar si Rosellinia necatrix Prill. se encuentra asociado a la pudrición blanca de raíz en el cultivo de rosal, y, de ser este el caso, evaluar su sensibilidad a los fungicidas utilizados para su control en los municipios de Tenancingo, Villa Guerrero y Coatepec Harinas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento del hongo

Se seleccionaron nueve invernaderos, cuatro en el municipio de Tenancingo, cuatro en Villa Guerrero y uno en Coatepec Harinas donde las plantas de rosa presentaban síntomas de marchitez, muerte de plantas y signos como cordones miceliales en raíz y cuello de las plantas; de cada invernadero se tomaron muestras de raíces que fueron etiquetadas y transportadas en frío al laboratorio para su procesamiento; los síntomas y signos de cada planta fueron registrados.

De las raíces seleccionadas se cortaron rodajas de 1 mm de grosor, y se desinfestaron durante 2 minutos en hipoclorito de sodio al 2 %; enseguida se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y se secaron con papel absorbente estéril. Posteriormente se colocaron en cajas Petri estériles con papel absorbente estéril durante 24 h; transcurrido este tiempo las rodajas fueron sembradas en medio de cultivo jugo V8 (3 g de carbonato de calcio, 200 ml de jugo V8, 20 g de agar–agar y 800 ml de agua destilada). Las siembras se mantuvieron a temperatura de 24–26 °C en oscuridad y fueron observadas diariamente para revisar el crecimiento micelial; una vez confirmada la presencia del hongo se obtuvieron colonias puras.

Identificación del fitopatógeno

En los nueve aislamientos obtenidos se realizaron preparaciones temporales de los cordones miceliales para la observación al microscopio de los hinchamientos raquetoides que presenta el micelio justo antes de la septa, los cuales son descritos por Holliday (1995), Freeman y Sztejberg (1992), Pérez–Jiménez (2006) y Khan (1959), como característica importante en la identificación del hongo. Los hinchamientos piriformes y el micelio que se encuentra antes de la septa fueron medidos, tanto en el material obtenido en campo como en el cultivado en laboratorio, con un micrómetro adaptado a un microscopio compuesto CarlZais®. La identificación se confirmó mediante PCR.

Extracción y amplificación de ADN de Rosellinia necatrix

Una vez identificadas taxonómicamente las nueve cepas como R. necatrix se seleccionaron tres: T1GRJ, VG1GRJ y CH1GRJ; de cada una se obtuvo ADN total por el método de CTAB 3 % descrito por Ahrens y Seemüller (1992) con 1 g de micelio del hongo cultivado en medio de cultivo jugo V8 por 20 días. Se realizó la reacción de PCR para la amplificación de las regiones intergénicas transcripcionales (ITS1–ITS2) del componente ADN 18S ribosomal de hongos (Edel, 2000). Los oligonucleótidos utilizados fueron ITS4 (5'–TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC–3') e ITS5 (5'–GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG GC–3') (White et al., 1990). El programa de amplificación consistió de: 1 ciclo a 94 °C por 3 min; 35 ciclos a 94 °C por 30 seg, 55 °C por 45 seg, 72 °C por 45 seg.; y 1 ciclo a 72 °C por 7 seg. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.0 % en una solución buffer TAE 1X a 80 volts por 45 min; se incluyó un marcador de peso molecular de 1 Kb (1 Kb Ladder, Invitrogen®) como referencia. El gel fue teñido con bromuro de etidio (0.5 mg·ml^–1) y se visualizó bajo luz ultravioleta en un fotodocumentador GelDoc marca Biorad^®. Los productos de la PCR fueron purificados según protocolo del kit (QIAquick PCR purification) y enviados a secuenciar a Macrogen Inc. Seoul, Korea. Las secuencias nucleotídicas obtenidas se alinearon al GenBank–NCBI y se compararon con las disponibles en ese mismo banco de datos, usando el método de Blast (Stephen et al., 1990)

Evaluación de sensibilidad a fungicidas

Diseño experimental

Se realizaron tres experimentos, uno por municipio; en Tenancingo y Villa Guerrero el experimento se realizó bajo un diseño completamente al azar con arreglo factorial, siendo factores fungicida y cepa. En el factor cepa, los niveles fueron las cepas aisladas en cada municipio; en el factor fungicida los niveles fueron quintozeno, benomilo, fluazinam, tiofanato metílico y testigo sin fungicida. Los tratamientos fueron el resultado de la combinación de los niveles de cada factor, dando un total de 20; cada tratamiento tuvo siete repeticiones; cada repetición consistió en una caja Petri. En el municipio de Coatepec Harinas se aisló solamente una cepa; el diseño experimental fue completamente al azar con cinco tratamientos, que consistieron en los fungicidas mencionados más el testigo sin fungicida; cada tratamiento tuvo siete repeticiones, y cada repetición fue en una caja Petri.

Los datos resultantes de los experimentos se sometieron a los procedimientos de análisis de varianza y en su caso, comparación de medias por prueba de Tukey con el programa Statgraphics Plus® Windows® Versión 5.

Para la representación gráfica del crecimiento del hongo con los diferentes fungicidas a través del tiempo, se utilizó regresión simple por cepa y fungicida, seleccionando el de mejor ajuste con base en el coeficiente de regresión; la significancia de los coeficientes se verificó mediante análisis de varianza. Para los cálculos, se utilizó el procedimiento de regresión simple del software Statgraphics Plus^® Windows^® Versión 5. En todos los modelos la variable dependiente Y fue crecimiento del hongo y la variable independiente X, días.

RESULTADOS

Síntomas registrados en plantas de rosa

La enfermedad se presenta en manchones y avanza en línea recta en las camas de cultivo. Inicialmente, la planta comienza a mostrar marchitez y la muerte se presenta en poco tiempo. En otros casos, conforme avanza la enfermedad las plantas presentan follaje pequeño y escaso, el cual se vuelve clorótico y se marchita hasta llegar a la muerte. Sin embargo, éstas conservan sus hojas por algún tiempo, mostrando un color anaranjado brillante. Es común encontrar plantas con algunos tallos muertos y otros, en apariencia, en buen estado (Figura 1a y 1b).

En la parte subterránea de la planta inicialmente se puede apreciar sobre la corteza de las raíces micelio blanco, algodonoso, que da origen a la formación de cordones miceliales que rodean a las raíces; éstos son de color blanco y conforme maduran se tornan de color gris oscuro a negro. Posteriormente, las raíces se vuelven blandas a causa de la pudrición ocasionada por el hongo, por lo que es fácil desprenderlas del suelo (Figura 1c).

Se obtuvieron nueve cepas del hongo, las cuales fueron denominadas para el municipio de Tenancingo como T1GRJ, T2GRJ, T3GRJ y T4GRJ, para Villa Guerrero VG1GRJ, VG2GRJ, VG3GRJ y VG4GRJ, y para Coatepec Harinas CH1GRJ.

El hongo presentó micelio septado de color blanco algodonoso con hinchamientos piriformes (micelio raquetoide) justo antes de la septa. El micelio forma cordones miceliales que inicialmente son de color blanco, pero a medida que pasa el tiempo se tornan de color gris a negro, en los cuales los hinchamientos piriformes del micelio son más evidentes; estas características corresponden a Rosellinia necatrix Prill., estado asexual Dematophora necatrix (Hart.) Berl., (Khan, 1959; Freeman y Sztejnberg, 1992); [Makambila, 1978 citado en Pérez–Jiménez (2006); Sivanesan etal. (1972), citado en Holliday, 1995]. Los hinchamientos piriformes obtenidos de micelio maduro (color gris a negro) de raíces enfermas midieron en promedio 8.7 u de ancho; el micelio que se encontró después de la septa midió 4.1 u; mientras que estas estructuras en condiciones de laboratorio midieron 5.2 u y 2.6 u, respectivamente (Figuras 1d y 1e).

El crecimiento de R. necatrix en medio de cultivo V8 en oscuridad en un rango de 24 a 26 °C tardó de 16 a 18 días en cubrir una caja Petri de 8 cm de diámetro. El crecimiento del micelio fue pegado al sustrato y radial, seguido de anillos concéntricos de micelio negro, en el cual se formaron microesclerocios sobre o inmersos en el sustrato al fondo de la caja Petri.

Al alinear la secuencia del producto amplificado en PCR con las secuencias reportadas en el GenBank–NC–BI se obtuvo 98 % de homología con Rosellinia necatrix en las tres cepas analizadas (GATCATTAAAGAGTTC–CACAACTCCCAAAACCCATGTGAACATACCACGCG–TTGCCTCGGCAGGTCGCGTCCTACCCTAGTACCC–TACCCTGTAGGGCCTACCCGGTAGGCGCGGGCCA–ACCTGCCGGCGGCCCACGAAACTCTGTTTAGCATT–GAATTCTGAACACATAACTAAATAAGTTAAAACTTTCA–ACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACG–CAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT–CAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC–CATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCG–TCATTTCAACCCTTAAGCCCCTGTTGCTTAGCGTT–GGGGGCCTGCAGCGCCTGCTGCAGCCCCTCGAAGT–CAGTGGCGGAGTCGGTCACACACTCTAGACGTAGTA–GATTTCTCATCTCGCCTATGGTTGTGCCGGCCCCCT–GCCGTAAAACACCCCCCATACCAAAGGTTGACCTCG–GATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA–ATAAGCGG).

Evaluación de sensibilidad a fungicidas

Cepas de Tenancingo

Los análisis de datos en las cepas T1GRJ, T2GRJ, T3GRJ y T4GRJ, mostraron diferencias estadísticas significativas (P<0.05) para los casos de cepas, fungicidas y la interacción cepa por fungicida (Cuadro 1). Los tratamientos sin fungicida presentaron el mayor crecimiento micelial 18 días después de su siembra, seguido por los tratamientos con quintozeno en las cepas T1GRJ, T2GRJ y T3GRJ, ya que este fungicida sólo retrasó el crecimiento micelial por alrededor de tres días (Figura 2), mientras que la cepa T4GRJ fue completamente sensible al no mostrar crecimiento micelial; con los fungicidas tiofanato metílico, fluazinam y benomilo el crecimiento micelial de Rosellinia necatrix fue nulo.

Cepas de Villa Guerrero

Las cepas VG3GRJ y VG4GRJ tratadas con el fungicida quintozeno presentaron crecimiento micelial cinco días después de su siembra, en tanto que las cepas VG1GRJ y VG2GRJ con el mismo tratamiento crecieron a partir del día siete (Figura 3); sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Fue hasta el día 13 cuando se encontraron diferencias estadísticas (P<0.05) para el caso de fungicidas y cepas (Cuadro 2). La comparación de medias de Tukey (P<0.05) mostró mayor crecimiento para el tratamiento sin fungicida, seguido por quintozeno, siendo diferentes entre ellos y diferentes a tiofanato metílico, fluazinam y benomilo, los cuales fueron estadísticamente iguales entre ellos. En las cuatro cepas de R. necatrix que fueron sensibles a benomilo, fluazinam y tiofanato metílico, no hubo crecimiento micelial durante el transcurso de la prueba.

Cuatro días después de la siembra, R. necatrix presentó crecimiento micelial en el tratamiento con el fungicida quintozeno (7.37 mm); para este mismo día el hongo tuvo un crecimiento de 25.19 mm en el tratamiento sin fungicida (Figura 4), mientras que en los tratamientos con tiofanato metílico, fluazinam y benomilo el crecimiento fue nulo, siendo estas diferencias estadísticamente significativas (P<0.05); para el día 16 el tratamiento con benomilo comenzó a presentar crecimiento micelial. Al final del experimento R. necatrix cepa CH1GRJ tratada con los fungicidas tiofanato metílico y benomilo no presentó crecimiento micelial (Cuadro 3).

DISCUSIÓN

En los cultivos de rosa bajo invernadero de la región de Villa Guerrero, Estado de México, se encontró que son frecuentes y severos los daños producidos por R. necatrix; las plantas de rosa atacadas presentan marchitez, escaso y pequeño follaje, el cual permanece adherido a las ramas por algún tiempo aun en plantas muertas, lo cual coincide con lo mencionado por Romero–Cova (1993). Simons (1997) menciona que el hongo se presenta en manchones y que en la parte subterránea se observan cordones miceliales de color blanco, los cuales conforme envejecen se tornan de color negro; esto fue observado en las plantas muestreadas, sobre todo donde el ataque de R. necatrix era severo.

El diámetro de micelio proveniente de raíces enfermas de rosa midió 4.1 µ y los hinchamientos piriformes en promedio 8.7 µ, mientras que bajo condiciones de laboratorio midieron 2.6 µ y 5.2 µ, respectivamente; estos resultados difieren de lo descrito por Makambila (1978) citado en Pérez–Jiménez (2006) y Khan (1959), quienes reportan 13 u para los hinchamientos piriformes, cuatro o seis veces más que las hifas.

López–Herrera y Zea–Bonilla (2007), tras evaluar en España los efectos in vitro de los ingredientes activos benomilo, carbendazim, fluazinam y tiofanato metílico sobre R. necatrix proveniente de raíces de aguacate, encontraron que a dosis mayores o iguales a 0.5 g·L^–1 los fungicidas inhiben por completo el crecimiento del hongo, mientras que a la dosis de 0.1 g·L^–1 los fungicidas son menos efectivos. Lo anterior coincide con los resultados obtenidos en esta investigación, ya que con benomilo y tiofanato metílico a dosis de 0.6 g·L^–1 las cepas no presentaron crecimiento micelial. Ambos fungicidas, pertenecientes al grupo de los bencimidazoles, tienen acción sistémica y por tanto un sitio de acción específico, lo cual contribuye a su actividad altamente selectiva, factor que a su vez conlleva a riesgos de resistencia. Por su lado, fluazinam, a la dosis de 0.5 g·L^–1, inhibió el crecimiento de Rosellinia necatrix en las cepas de Villa Guerrero y Tenancingo; este último fungicida de contacto actúa inhibiendo la respiración al afectar la fosforilación oxidativa (Latin, 2011).

Los datos obtenidos en este estudio indicaron que ocho de las nueve cepas evaluadas de R. necatrix no presentaron sensibilidad a quintozeno, a pesar de ser un fungicida de contacto con diferentes sitios de acción, entre los cuales se reportan: degradación de lípidos en membrana celular, destrucción mitocondrial y destrucción de enzimas involucradas en síntesis de pared celular (Latin, 2011). Estos resultados sugieren que quintozeno ha perdido actividad letal para este hongo y en el cultivo en estudio. Sin embargo, existen evidencias de la efectividad que tiene en el control de algunos otros hongos fitopatógenos como Sclerotinia minor Jagger, al reducir la formación de inóculo (Brenneman et al., 1987); resultados similares son reportados con Sclerotium rolfsii Sacc. al señalar que este fungicida inhibe la formación de esclerocios por más de tres meses (Olivos y Mont,1993; Rondón et al.,1995); años más tarde, Shim et al. (1998) reportan la existencia de cepas de S. rolfsii tolerantes al mismo. Un estudio realizado con quintozeno a dosis de 3.64, 6.81 y 11.36 kg.ha^–1 para el control de Rizoctonia solani Kuhn en cultivo de frijol (Phaseolus vulgaris L.), reporta que a medida que aumentó la dosis, la incidencia y severidad de la enfermedad disminuyó, pero a dosis de 11.36 kg.ha^–1 el fungicida ocasionó fitotoxicidad (Pichardo, 1990).

CONCLUSIONES

LITERATURA CITADA

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