López–Rodríguez Guadalupe, Suárez–Dieguez Teodoro

Laboratorio de Nutrición Molecular, Instituto de Ciencias de la Salud, Centro de Investigación Interdisciplinaria en Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. Carretera Actopan–Tilcuautla S/N, Ex Hacienda de la Concepción, San Agustín Tlaxiaca, Hidalgo. C.P 42162. Corresponding author: Tel +52 (771) 7172000 Ext 5116, Fax 5111, glopez@uaeh.edu.mx

Received Agosto 2010.
Accepted December 2010.

ABSTRACT

Keywords: polyunsaturated fatty acid, lipid peroxidation, antioxidant capacity, TBARS.

RESUMEN

En humanos, la evaluación de la capacidad antioxidante (CA) representa la suma de todos los antioxidantes contenidos en la muestra biológica, por lo que los resultados no pueden ser discutidos de acuerdo al tipo de molécula responsable de la CA. Por esta razón, se evaluó in vitro la CA de proteínas, vitaminas y enzimas en una mezcla de ácidos grasos poliinsaturados sometidos a una reacción de Fenton, en donde se probaron concentraciones fisiológicas de ácido ascórbico, α y γ–tocoferol, β–caroteno, albúmina, transferrina, superóxido dismutasa, catalasa, glutatión y glutatión peroxidasa. Se cuantificó la cantidad de moléculas que reaccionan al ácido tiobarbitúrico (TBARS) producidas en cada reacción, la cual se comparó con una muestra control. Los tocoferoles α y γ se comportaron de forma similar, ambos redujeron las TBARS un 24.9 ± 3.0% y 23.0 ± 2.2% respectivamente, p<0.01; la apo–transferrina fue la molécula con mayor CA (–71.5 ± 1.7% p<0.01) seguida de la albúmina (–52.3 ± 1.7%, p<0.01), el efecto antioxidante observado en la albúmina comprometió su estructura, fragmentándola en péptidos de bajo peso molecular. Los resultados obtenidos indican que al igual que los tocoferoles, la albúmina y transferrina son antioxidantes que previenen la oxidación in vitro de ácidos grasos poliinsaturados expuestos a una reacción de Fenton.

Palabras clave: ácidos grasos poliinsaturados, lipoperoxidación, capacidad antioxidante, TBARS.

INTRODUCCIÓN

El estrés oxidativo caracterizado por un desequilibrio oxidante / antioxidante de una célula intacta es una condición que se ha asociado con múltiples patologías en diferentes estados del desarrollo (Guggenheim & Wolinsky, 1981). Al respecto, los estudios se han centrado en aclarar cuál es el rol que el estrés oxidativo tiene en la etiología y progresión de enfermedades crónicas no transmisibles (ECNT) (Blake et al., 1989; Collins, Duthie, & Ross, 1994; Gey, 1986), estados de desnutrición (Golden & Ramdath, 1987; Manary, Leeuwenburgh, & Heinecke, 2000; Ohtsuka, Kojima, Ohtani, & Hayashi, 1998) así como en procesos tan inherentes al hombre como el envejecimiento (Cutler, 1991).

El estado antioxidante representa el equilibrio entre las defensas antioxidantes y los oxidantes en un organismo vivo (Lapenna, Ciofani, Pierdomenico, Giamberardino, & Cuccurullo, 2001), un desequilibrio en cualquiera de los dos componentes pueden causar estrés oxidativo. En humanos las moléculas a las cuales se les ha conferido una función antioxidante son múltiples, las de origen endógeno son principalmente enzimas, como la glutatión peroxidasa (GPx), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) así como proteínas de transporte como transferrina y albúmina; y algunas provenientes de la dieta como vitaminas y minerales, siendo el selenio, ácido ascórbico, β–caroteno y el α–tocoferol los más estudiados.

Para fines de evaluación clínica y/o poblacional se requiere utilizar métodos de bajo costo que reflejen adecuadamente un estado antioxidante, además, es necesario conocer cuales son las moléculas o nutrientes que tienen la mayor actividad antioxidante en los sistemas in vitro o en los métodos seleccionados para realizar la evaluación; para tal efecto en este estudio se determinó la CA in vitro de antioxidantes de distinta naturaleza en una mezcla de ácidos grasos poliinsaturados sometidos a una reacción de Fenton (AGPFent). Se evaluaron de forma independiente algunos nutrientes o proteínas con función antioxidante descrita, se probaron concentraciones fijas de ácido ascórbico, α–tocoferol, γ–tocoferol, β–caroteno, albúmina, transferrina; así como de enzimas como CAT, SOD, glutatión reducido (GSH) y GPx.

Material y Métodos

Evaluación de la capacidad antioxidante

Para medir la CA se utilizó el principio de las TBARS, aplicando un método modificado de la técnica descrita por Hicks JJ y Medina–Navarro (Hicks & Medina–Navarro, 1995), denominado AGPFent. En un sistema de 2 mL, compuesto por un amortiguador trizma base 7.2 mM, pH 8.0, se colocó una mezcla de ácidos grasos poliinsaturados, linolénico (89.2 ηmoles) y linoleico (89.7 ηmoles), 1 μmol de FeCl₂ y 2.5 μmoles de H₂O₂ (pH 5.1). La mezcla se incubó 15 minutos a 37°C, adicionando 1.0 mL de ácido tiobarbitúrico al 0.375% (95°C durante 15 minutos), la reacción se detuvo con 500 μL de HCl 2 N y se leyó absorbancia a una longitud de onda de 532 nm, a esta mezcla se le consideró como la oxidación máxima (control).

Capacidad antioxidante de los principales compuestos antioxidantes

Con el fin de establecer la función in vitro de algunos nutrientes, proteínas y enzimas con mayor evidencia científica contra la lipoperoxidación de ácidos grasos poliinsaturados, se evaluó la CA del ácido ascórbico (Levine, 1986), α–tocoferol (Burton & Traber, 1990), γ–tocoferol (Devaraj & Traber, 2003), β–caroteno (Burton & Ingold, 1984), albúmina (Bourdon & Blache, 2001), transferrina (Aruoma & Halliwell, 1987), CAT (Calabrese & Canada, 1989), SOD (Fridovich, 1986), GPx (Ursini & Bindoli, 1987) y GSH (Anderson, Underwood, Bridges, & Meister, 1989), utilizando mezclas equivalentes a las concentraciones medias reportadas en rangos normales en plasma o suero de humanos. Los resultados del efecto antioxidante de cada uno de los compuestos se informan como porcentajes de reducción en relación con la oxidación máxima.

Las soluciones de moléculas y nutrientes antioxidantes se prepararon en el momento del análisis y se probaron de forma independiente en la mezcla de AGPFent, el volumen probado en cada reacción fue de 20 μL. Se utilizó L (+) ácido ascórbico (Mca Riedel–de Haën) a una concentración de 0.95 mg/dL (Devasena, Lalitha, & Padma, 2001), de la cual se tomaron 9.5 μg para adicionarlo a la mezcla de AGPFent. El (+)––acetato de tocoferol (SIGMA–Aldrich) se preparó a una concentración de 800 μg/dL y fue diluido en dimetil sulfóxido (Sokol, Heubi, Iannaccone, Bove, & Balistreri, 1984), de la solución se tomaron 0.16 μg. El γ–tocoferol utilizado fue (+)–γ–tocoferol (SIGMA–Aldrich) a una concentración de 4.18 μM (diluido con dimetil sulfóxido) (Gross, Yu, Hannan, Prouty, & Jacobs, 2003), del cual se tomaron 9.5 μg. El último antioxidante probado fue β–caroteno sintético (SIGMA–Aldrich) a una concentración de 0.32 μM (diluido con dimetil sulfóxido), y se probaron 3.5 ηg.

Se utilizó albúmina bovina (PM 70,000) a una concentración de 4.5 g/dL (SIGMA–Aldrich) de esta mezcla se probaron 0.9 mg en el sistema AGPFent para evaluar su efecto antioxidante independiente. La transferrina (PM 79,500) que se utilizó fue apotransferrina humana (SIGMA–Aldrich) a una concentración de 250 mg/dL, de la cual se probaron 50 μg.

Electroforesis de proteínas

Una vez que se evaluó la CA de la albúmina y la transferrina en el sistema de AGPFent, se extrajo la proteína del medio con 100 μl de ácido perclórico 2 M, y se precipitaron centrifugando la mezcla a 14,000 rpm, 10 minutos a 4° C, se eliminó el sobrenadante y el paquete proteico se reconstituyó con buffer de fosfatos 100 mM. Para separar las proteínas se uso un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (PAGE–SDS), el gel separador fue preparado con buffer tris 3M pH 8.8, acrilamida al 30%, con una relación bis acrilamida/acrilamida de 1:37, TEMED al 0.06%, SDS al 10% y persulfato de amonio al 10%. EL gel concentrador se preparó con buffer tris 0.5 M, pH 6.8, TEMED al 0.06%, acrilamida al 30%, SDS al 10% y persulfato de amonio al 10%.

Análisis Estadístico

Todos los análisis se realizaron en el software SPSS (SPSS versión 10, Chicago, IL).

Los datos se presentan como el promedio de cada grupo experimental ± la desviación estándar. Se realizó una prueba de ANOVA de una vía con una post prueba de Turkey para comparar las diferencias entre los grupos. Las diferencias entre dos grupos se establecieron con la prueba t–Student. Se consideró un nivel de significancia con un valor de p<0.05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se evaluó in vitro la capacidad antioxidante de cada uno de los nutrientes, proteínas y enzimas antioxidantes con mayor evidencia científica en los procesos de peroxidación de lípidos. La oxidación máxima (control) sin antioxidantes produjo en promedio 10.2 ± 0.5 ηmoles de TBARS, lo que representó el 100% de oxidación. Con el ácido ascórbico se cuantificó un aumentó del 10% en la cantidad de TBARS al compararse con el control, esto está relacionado con su función prooxidante debido a que el acido ascórbico reduce el Fe³⁺ en Fe ²⁺ y de esta manera mantiene el sustrato para continuar con la reacción de Fenton, esta evidencia es bien conocida y se da principalmente en estados de sobredosis de hierro (Chen et al., 2000; Dasgupta & Zdunek, 1992; Miller & Aust, 1989).

El α–tocoferol es referida como la molécula con una mayor CA en soluciones de lípidos (Liebler, 1998; Skinner & Parkhurst, 1970), sin embargo, en este experimento el efecto antioxidante del α–tocoferol y el γ–tocoferol fue semejante en la mezcla de AGPFent, estas moléculas redujeron la cuantificación de TBARS un 24.9 ± 3.0% vs 23.0 ± 2.2% respectivamente. La capacidad antioxidante de los tocoferoles está relacionada con la inactivación en este medio del radical hidróxilo y peróxido, además se ha descrito que entre la forma α y γ existe una similitud en su actividad como atrapadores para el singulete de oxígeno (100/100) (Kaiser, Di Mascio, Murphy, & Sies, 1990).

Los resultados obtenidos con la albúmina bovina permiten proponerla como un efectivo antioxidante durante la liporer–oxidación, ésta fue capaz de evitar en más del 50% el daño producido por el radical hidroxilo, producto de la reacción del H₂O₂ y el hierro; la albúmina redujo en promedio la cuantificación de TBARS en la mezcla AGPFent un 52.3 ± 1.7 %o; esta proteína se fragmento durante su actividad antioxidante, el gel de poliacrilamida/SDS reveló bandas de aproximadamente 10, 15, 40 y 70 kDA (Figura 1), estas bandas presentan un peso similar a las observadas en albúmina expuesta a Cu y ascorbato (Marx & Chevion, 1986). La fragmentación de las proteínas es ocasionada por los radicales hidróxilo así como los iones perferrilo (Davies, Lin, & Pacifici, 1987; Dubinina et al., 2002); esto se aplica también para la albúmina, la cual puede prevenir la peroxidación quelando hierro y atrapando radicales libres de oxígeno (Fukuzawa, et al., 2005). La fragmentación de la albúmina durante estados de estrés mediados por hierro podría tener implicaciones muy importantes en la nutrición humana, principalmente en la fisiopatología del kwashiorkor; es posible que en estados graves de desnutrición la albúmina pierda su conformación estructural y de esta manera su función antioxidante así como su capacidad oncótica en el plasma y como consecuencia se presente el edema característico en el Kwashiorkor.

En la apo–transferrina se observó el mayor efecto antioxidante en relación a todas los antioxidantes probados, se cuantificó un 71.5 ± 1.7 % menor cantidad de TBARS cuando a la mezcla de AGPFent se le adicionó apo–transferrina, este resultado es concordante con la función de la proteína, la cual trasporta hierro y la reacción de Fenton se evita sin la disponibilidad de hierro libre (Cairo, Recalcati, Pietrangelo, & Minotti, 2002). A diferencia de la albúmina, la transferrina no mostró alteraciones en su estructura (Figura 2), por lo que se supone que solo se saturó de hierro. Las enzimas CAT, SOD, GPx y el GSH tuvieron comportamientos similares en su CA, en estas proteínas se cuantificó en promedio de 40–50% menos TBARS en relación con la muestra control (Tabla 1). En estas condiciones de reacción es posible que la CAT convirtiera al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno (Eremin & Metelitsa, 1996), de tal forma que se evitó que reaccionara con el hierro, la GPx catalizó la reducción de óxidos a alcoholes y el GSH redujo los hidroperóxidos lipídicos y/o neutralizó radicales hidroxilo. Debido a que la principal función de la SOD es la dismutacion del anión superóxido, el cual se forma durante la descomposición del ácido linoleico inducido por el ion ferroso (Kambayashi et al., 2003), la SOD pudo evitar la disponibilidad del anión superoxido y la formación de su forma protonada y de esta forma la peroxidación (De Grey, 2002; Roginsky & Barsukova, 2001). La función de las enzimas antioxidantes puede estar relacionada también con la capacidad antioxidante de aminoácidos como el triptófano, la cisteína, tirosina, fenilalanina e histidina, por lo que la reducción del daño oxidativo observado en la emulsión de ácidos grasos podría ocasionar una modificación oxidativa de la estructura de cualquier proteína independientemente de su función (Dubinina, et al., 2002). Es necesario aclarar que en este trabajo de investigación se reporta la CA independiente de algunos antioxidantes, por lo que se realizó una mezcla de todas las moléculas probadas a la misma concentración, se observó que esta mezcla reduce en un 64.5 ± 4.1 % la cantidad de TBARS en relación al control; sin embargo, no se determinó que molécula pudo tener una mayor CA, ni se establecieron interacciones entre antioxidantes como potencializadores de reacciones, condiciones que in vivo son comunes.

Los resultados permiten proponer que las proteínas albúmina y transferrina tienen una potente actividad antioxidantes en los sistemas que producen lipoperóxidos a través de una reacción de Fenton, esto fue observado también en proteínas con actividad enzimática como la CAT y SOD, quienes presentaron un efecto antioxidante mayor al registrado para los tocoferoles, los cuales son reconocidos como los mejores antioxidantes contra la lipoperoxidación.

REFERENCIAS

Anderson, M. E., Underwood, M., Bridges, R. J., Meister, A. (1989). Glutathione metabolism at the blood–cerebrospinal fluid barrier. FASEB Journal 3: 2527–2531.         [ Links ]

Aruoma, O. I., Halliwell, B. (1987). Superoxide–dependent and ascorbate–dependent formation of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide in the presence of iron. Are lactoferrin and transferrin promoters of hydroxyl–radical generation? Biochemical Journal 241: 273–278.         [ Links ]

Blake, D. R., Merry, P., Unsworth, J., Kidd, B. L., Outhwaite, J. M., Ballard, R., et al. (1989). Hypoxic–reperfusion injury in the inflamed human joint. Lancet 1: 289–293.         [ Links ]

Bourdon, E., Blache, D. (2001). The importance of proteins in defense against oxidation. Antioxidants & Redox Signaling 3: 293–311.         [ Links ]

Burton, G. W. (1989). Antioxidant action of carotenoids. Journal of Nutrition 119: 109–111.         [ Links ]

Burton, G. W., Ingold, K. U. (1984). beta–Carotene: an unusual type of lipid antioxidant. Science 224: 569–573.         [ Links ]

Burton, G. W., Traber, M. G. (1990). Vitamin E: antioxidant activity, biokinetics, and bioavailability. Annual Review of Nutrition 10: 357–382.         [ Links ]

Cairo, G., Recalcati, S., Pietrangelo, A., Minotti, G. (2002). The iron regulatory proteins: targets and modulators of free radical reactions and oxidative damage. Free Radical Biology & Medicine 32: 1237–1243.         [ Links ]

Calabrese, E. J., Canada, A. T. (1989). Catalase: its role in xenobiotic detoxification. Pharmacology & Therapeutic, 44: 297–307.         [ Links ]

Castenmiller, J. J., Lauridsen, S. T., Dragsted, L. O., van het Hof, K. H., Linssen, J. P., West, C. E. (1999). beta–carotene does not change markers of enzymatic and nonenzymatic an–tioxidant activity in human blood. Journal of Nutrition 129: 2162–2169.         [ Links ]

Collins, A., Duthie, S., Ross, M. (1994). Micronutrients and oxidative stress in the aetiology of cancer. Proceedings of the Nutrition Society 53: 67–75.         [ Links ]

Cutler, R. G. (1991). Antioxidants and aging. American Journal of Clinical Nutrition 53(1 Suppl): 373S–379S.         [ Links ]

Chen, K., Suh, J., Carr, A. C., Morrow, J. D., Zeind, J., Frei, B. (2000). Vitamin C suppresses oxidative lipid damage in vivo, even in the presence of iron overload. American Journal of Physiology – Endocrinology And Metabolism 279: E1406–1412.         [ Links ]

Dasgupta, A., Zdunek, T. (1992). In vitro lipid peroxidation of human serum catalyzed by cupric ion: antioxidant rather than prooxidant role of ascorbate. Life Sciences, 50: 875–882.         [ Links ]

Davies, K. J., Lin, S. W., Pacifici, R. E. (1987). Protein damage and degradation by oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein. The Journal of Biological Chemistry 262: 9914–9920.         [ Links ]

De Grey, A. D. (2002). HO2*: the forgotten radical. DNA Cell Biol, 21(4), 251–257.         [ Links ]

Devaraj, S., Traber, M. G. (2003). Gamma–tocopherol, the new vitamin E? American Journal of Clinical Nutrition 77: 530–531.         [ Links ]

Devasena, T., Lalitha, S., Padma, K. (2001). Lipid peroxidation, osmotic fragility and antioxidant status in children with acute post–streptococcal glomerulonephritis. Clinica Chimica Acta 308: 155–161.         [ Links ]

Dubinina, E. E., Gavrovskaya, S. V., Kuzmich, E. V., Leonova, N. V., Morozova, M. G., Kovrugina, S. V., et al. (2002). Oxidative modification of proteins: oxidation of tryptophan and production of dityrosine in purified proteins using Fenton's system. Biochemistry (Mosc) 67: 343–350.         [ Links ]

Eremin, A. N., Metelitsa, D. I. (1996). [Catalytic properties of catalase in microemulsions of surface–active agents in octane]. Biokhimiia 61: 1672–1686.         [ Links ]

Esterbauer, H., Striegl, G., Puhl, H., Rotheneder, M. (1989). Continuous monitoring of in vitro oxidation of human low density lipoprotein. Free Radical Research Communications 6: 67–75.         [ Links ]

Fechner, A., Bohme, C., Gromer, S., Funk, M., Schirmer, R., Becker, K. (2001). Antioxidant status and nitric oxide in the malnutrition syndrome kwashiorkor. Pediatric Research 49: 237–243.         [ Links ]

Fridovich, I. (1986). Superoxide dismutases. Advances in Enzymology & Related Areas of Molecular Biology 58: 61–97.         [ Links ]

Fukuzawa, K., Saitoh, Y., Akai, K., Kogure, K., Ueno, S., Tokumura, A., et al. (2005). Antioxidant effect of bovine serum albumin on membrane lipid peroxidation induced by iron chelate and superoxide. Biochimica et Biophysica Acta 1668: 145–155.         [ Links ]

Gey, K. F. (1986). On the antioxidant hypothesis with regard to arteriosclerosis. Bibliotheca nutritio et dieta 37: 53–91.         [ Links ]

Golden, M. H., Ramdath, D. (1987). Free radicals in the pathogenesis of kwashiorkor. Proceedings of the Nutrition Society 46: 53–68.         [ Links ]

Gross, M., Yu, X., Hannan, P., Prouty, C., Jacobs, D. R., Jr. (2003). Lipid standardization of serum fat–soluble antioxidant concentrations: the YALTA study. American Journal of Clinical Nutrition 77: 458–466.         [ Links ]

Guggenheim, Y. K., Wolinsky, I. (1981). Nutrition and nutritional diseases : the evolution of concepts. Lexington, Mass.: Collamore Press.         [ Links ]

Hicks, J. J., Medina–Navarro, R. (1995). Inhibitory capacity of human serum on induced microsomal lipoperoxidation. Archives of Medical Research, 26: 169–172.         [ Links ]

Kaiser, S., Di Mascio, P., Murphy, M. E., Sies, H. (1990). Physical and chemical scavenging of singlet molecular oxygen by tocopherols. Archives of Biochemistry and Biophysics 277: 101–108.         [ Links ]

Kambayashi, Y., Tero–Kubota, S., Yamamoto, Y., Kato, M., Nakano, M., Yagi, K., et al. (2003). Formation of superoxide anion during ferrous ion–induced decomposition of linoleic acid hydroperoxide under aerobic conditions. The Journal of Biochemistry 134: 903–909.         [ Links ]

Knutson, M. D., Handelman, G. J., Viteri, F. E. (2000). Methods for measuring ethane and pentane in expired air from rats and humans. Free Radical Biology & Medicine 28: 514519.         [ Links ]

Lapenna, D., Ciofani, G., Pierdomenico, S. D., Giamberardino, M. A., Cuccurullo, F. (2001). Reaction conditions affecting the relationship between thiobarbituric acid reactivity and lipid peroxides in human plasma. Free Radical Biology & Medicine 31 : 331–335.         [ Links ]

Lee, H. S., Shoeman, D. W., Csallany, A. S. (1992). Urinary response to in vivo lipid peroxidation induced by vitamin E deficiency. Lipids 27: 124–128.         [ Links ]

Levine, M. (1986). New concepts in the biology and biochemistry of ascorbic acid. The New England Journal of Medicine 314: 892–902.         [ Links ]

Liebler, D. C. (1998). Antioxidant chemistry of alpha–tocopherol in biological systems. Roles of redox cycles and metabolism. Subcellular Biochemistry 30: 301–317.         [ Links ]

Manary, M. J., Leeuwenburgh, C., Heinecke, J. W. (2000). Increased oxidative stress in kwashiorkor. Journal of Pediatrics 137: 421–424.         [ Links ]

Marx, G., Chevion, M. (1986). Site–specific modification of albumin by free radicals. Reaction with copper(II) and ascorbate. Biochemical Journal 236: 397–400.         [ Links ]

Miller, D. M., Aust, S. D. (1989). Studies of ascorbate–dependent, iron–catalyzed lipid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics 271 : 113–119.         [ Links ]

Nelson, G. J., Morris, V. C., Schmidt, P. C., Levander, O. (1993). The urinary excretion of thiobarbituric acid reactive substances and malondialdehyde by normal adult males after consuming a diet containing salmon. Lipids 28: 757–761.         [ Links ]

Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. (1979). Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 95: 351–358.         [ Links ]

Ohtsuka, A., Kojima, H., Ohtani, T., Hayashi, K. (1998). Vitamin E reduces glucocorticoid–induced oxidative stress in rat skeletal muscle. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo) 44: 779–786.         [ Links ]

Roginsky, V., Barsukova, T. (2001). Superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in micelles. Chemistry and Physics of Lipids 111 : 87–91.         [ Links ]

Skinner, W. A., Parkhurst, R. M. (1970). Antioxidant properties of alpha–tocopherol derivatives and relationship of antioxidant activity to biological activity. Lipids 5: 184–186.         [ Links ]

Sokol, R. J., Heubi, J. E., Iannaccone, S. T., Bove, K. E., Balistreri, W. F. (1984). Vitamin E deficiency with normal serum vitamin E concentrations in children with chronic cholestasis. New England Journal of Medicine, 310: 1209–1212.         [ Links ]

Squali Houssaini, F. Z., Arnaud, J., Richard, M. J., Renversez, J. C., Favier, A. (1997). [Evaluation of oxidative stress and antioxidant defences in malnourished Moroccan children]. Annals of Nutrition and Metabolism 41 : 149–159.         [ Links ]

Ursini, F., Bindoli, A. (1987). The role of selenium peroxidases in the protection against oxidative damage of membranes. Chemistry and Physics of Lipids 44: 255–276.         [ Links ]