Desarrollo y validación de un método analítico para la detección y cuantificación de plaguicidas organoclorados en grasa de ganado porcino con un sistema GC/PTV/EI/MS²

Development and validation of an analytical method for the detection and quantification of organochlorine pesticides in pork fat with a GC/PTV/EI/MS² system

Osvaldo Nicolás Rodríguez Valdés^* Laura Renné Velázquez Chong^* Sonia del Carmen Soto Alvarado^* Guillermo Rodríguez Ventura^**

* Laboratorio de Toxicología Analítica, Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, Universidad Autónoma de Baja California, km. 3.5 Carretera Mexicali–San Felipe, Fracc. Campestre s/n, 21386. Mexicali, Baja California, México.

Correspondencia:
Osvaldo Nicolás Rodríguez Valdés,
Teléfono: (01) 686 5 63 69 06.
Fax: (01) 686 5 63 69 07,
Correo electrónico: osvr_jim@hotmail.com

Recibido el 7 de julio de 2010.
Aceptado el 16 de diciembre de 2010.

Abstract

A capillary gas chromatography/mass spectrometry method was developed based on the requirements of the NMX–EC–17025–IMNC–2006/ISO/IEC17025:2005 and the Commission Decision 2002/657/EC in what regards to organochlorine pesticides measurement in swinish livestock fat: α–BHC, γ–BHC (lindane), β–BHC, δ–BHC, heptachlor, aldrin, heptachlor epoxide, γ–chlordane, α–chlordane, endosulfan I, p,p'–DDE, dieldrin, endrin, endosulfan II, p,p'–DDD, endrin aldehyde, p,p'–DDT, endosulfan sulfate, methoxychlor and mirex, in order to suggest a technological alternative that the NOM–021–ZOO–1995 may determine, and fulfill the NOM–004–ZOO–1994. The optimization in the selection of the precursor ion for each pesticide was done changing the pressure in the ion trap increasing the ions product signals, and achieving MS² measurements with higher sensitivity that overcome to electronic capture detectors (ECD). The decision limit CC_α and detection capability CC_β fulfilled the maximum residue limits (MRL) for both regulations with r > 0.990 and recoveries between 70–110%.

Key words: Porcine fat, organochlorine pesticides, analytical method, ion trap, GC/PTV/EI/MS².

Resumen

Se desarrolló un método empleando un sistema de cromatografía gaseosa–espectrometría de masas, de acuerdo con los requisitos de la NMX–EC–17025–IMNC–2006/ISO/IEC17025:2005 y la decisión de la Comisión 2002/657/EC, para la medición de plaguicidas organoclorados en grasa de ganado porcino: α–BHC, γ–BHC (lindano), β–BHC, δ–BHC, heptacloro, aldrín, heptacloro epóxido, γ–clordano, α–clordano, endosulfán I, p,p'–DDE, diedrín, endrín, endosulfán II, p,p'–DDD, endrín aldehido, p,p'–DDT, endosulfán sulfato, metoxicloro y mirex, con el fin de proponer una alternativa tecnológica para la determinación de la NOM–021–ZOO–1995, y dar cumplimiento a la NOM–004–ZOO–1994. La optimización en la selección del ion precursor de cada plaguicida se realizó variando la presión en la trampa de iones para incrementar las señales de los iones producto, logrando mediciones por MS² con sensibilidad superior a los detectores de captura electrónica (ECD). Los límites de decisión (CC_α) y capacidad de detección (CC_β), cumplen con los límites máximos de residuos (MRL) para ambas regulaciones con r > 0.990 y recuperaciones entre 70–110%.

Palabras clave: Grasa de porcino, plaguicidas organoclorados, método analítico, trampa de iones, GC/PTV/EI/MS².

Introducción

Las metodologías para la determinación de los plaguicidas organoclorados en grasa de ganado porcino han sido poco estudiadas en los sistemas de cromatografía gaseosa/espectrometría de masas (GC/ MS). Sus modos de operación son básicamente tres: barrido total (SCAN), monitoreo de iones selectivos (SIM) y espectrometría de masas por etapas (MSMS o MS²). Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas en la medición de plaguicidas. En el análisis de OCL por el modo SCAN, se produce el espectro completo que puede ser buscado en las bases de datos existentes, pero para lograr buenos resultados los OCL deben estar en concentraciones elevadas, ya que en concentraciones bajas el método pudiera producir falsos negativos.⁴ Con el modo SIM se controlan tres o cuatro iones específicos. En esta matriz se pueden generar falsos positivos y falsos negativos por variación de los tiempos de retención, producto de los compuestos colaterales que se extraen, lo que representa una fuerte limitante en las matrices complejas de origen animal. El tiempo de retención es fundamental en este modo de adquisición de datos, por lo que las determinaciones por SIM presentan problemas para los laboratorios que se dedican al análisis de residuos en los alimentos para consumo humano. Ello se debe a que en concentraciones bajas uno o más iones de los seleccionados interfieren con los iones que se originan de la matriz. Con la finalidad de mejorar la sensibilidad para el análisis, se han probado diversas técnicas y metodologías; entre ellas, la reducción de la interferencia de la matriz, utilizando el método GC/MS con la técnica de ion selectivo,⁵ mediante el empleo del método de ionización química negativa (NCI),⁶ aunque ésta presenta el problema de que para obtener los iones pseudomoleculares, se tienen que controlar variables relacionadas con la temperatura y la presión de la cámara de ionización. La disminución de la degradación térmica en el puerto de inyección mediante el uso de diferentes inyectores, favorece límites de detección más bajos.^7,8 Sin embargo, estas metodologías han mostrado limitantes importantes tales como los niveles de detección,⁹ el requerimiento de mayores volúmenes de inyección,¹⁰ costos prohibitivos¹¹ o bien, no se han estudiado estos sistemas utilizando una matriz de grasa porcina.^12,13

En los últimos años, el modo de adquisición de datos por GC/MS² ha tenido mayor popularidad debido a que elimina los efectos de la matriz en los modos GC/MS y GC/MS/SIM. La selectividad en la trampa de iones se realiza seleccionando el ion principal denominado precursor y éste es fragmentado con las condiciones analíticas del método, produciendo un segundo espectro de masas (MS²), donde se realiza la cuantificación con una adecuada seguridad analítica. En ese sentido, existe información acerca de determinaciones de plaguicidas organoclorados en vegetales, aplicando el sistema de GC/MS², en las cuales se evalúa la influencia del controlador de flujo automático del gas helio en la trampa con los diferentes métodos de adquisición barrido total (Full Scan), SIM y MS², estudiando el incremento de las señales.¹⁴ Por otra parte, el análisis por GC/MS² en matrices biológicas fue aplicado con éxito, usando una trampa de iones en la determinación de residuos de organoclorados en muestras de origen marino.¹⁵

El propósito de este estudio fue comparar la eficacia del sistema GC/PTV/EI/MS² con respecto al GC/ ECD en la determinación de residuos de plaguicidas organoclorados en grasa de ganado porcino. Para ello, se utilizó un inyector de vaporización de temperatura programable (PTV), a fin de obtener la menor degradación de los OCL en el puerto de inyección, así como minimizar la pérdida de estos plaguicidas al inicio del análisis en la columna cromatográfica. En la detección por espectrometría de masas, se utilizó la técnica de selección del ion precursor (MS²), evaluando la influencia de los diferentes valores de flujo de helio, con la finalidad de obtener la máxima señal de los iones producto a partir de los iones–precursores seleccionados para cada uno de los plaguicidas.

Material y métodos

El desarrollo de este método se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Toxicología Analítica, del Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias de la Universidad Autónoma de Baja California, con aprobación No. Const–028 como laboratorio de constatación en salud animal ante el Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) de la SAGARPA y acreditación SA–010–001/06 como laboratorio de ensayos en la rama de sanidad agropecuaria por la entidad mexicana de acreditación, A. C.

Preparación de soluciones madre

A partir de una mezcla de 20 plaguicidas organoclorados CLP de 2000 μg/ml,^* con pureza entre 96.9~99.9% de α–BHC, γ–BHC (lindano), β–BHC, δ–BHC, heptacloro, aldrín, heptacloro epóxido, γ–clordano, α–clordano, endosulfán I, p,p'–DDE, diedrín, endrín, endosulfán II, p,p'–DDD, endrín aldehído, p,p'–DDT, endosulfán sulfato, endrín cetona y metoxicloro, se preparó una solución madre de 80 μg/ml, diluyendo la mezcla en 25 ml de hexano^**: tolueno^*** 50:50 en un matraz volumétrico clase A.

Por separado, se pesaron 10 mg de mirex,^**** 99.4% de pureza, en una balanza analítica^***** y se diluyó con hexano:tolueno 50:50 en un matraz volumétrico clase A de 100 ml, para obtener una solución madre con 100 μg/ml aproximadamente, ya que se ajustó la concentración considerando la pureza del plaguicida.

Extracción

Se pesaron 0.18 g de grasa de porcino en vasos de precipitado de 100 ml, el siguiente lote de muestras: un blanco de solventes, un blanco de muestras, las recuperaciones de la curva de calibración y recuperaciones de 0.04 μg/ml para evaluación al desempeño del analista en la extracción.

Se transfirieron las muestras de grasa derretida con temperatura dentro de columnas empacadas en el laboratorio con alúmina activada neutra,^****** evaluadas previamente de acuerdo con el procedimiento de extracción de la NOM–021–ZOO–1995.^******* Se adicionó el volumen de elución de aproximadamente 70 ml de hexano, sin permitir que la columna se secara, agregando poco a poco y regulando el flujo de salida del eluato, y se recolectó en un matraz redondo de fondo plano con junta esmerilada de 250 ml. La concentración de la muestra se llevó a cabo en un rotavapor^******** a 0.034 × g y 47°C, hasta obtener un volumen aproximado de 2 ml. Se transfirió a un tubo de centrífuga de vidrio graduado y se llevó a volumen de 4 ml, finalmente se pasaron a viales ámbar de 2 ml de vidrio y tapón PTFE/Silicona, para su inyección en el sistema GC/PTV/MS².

Instrumentación analítica

Se utilizó un sistema de cromatografía gaseosa^********* con un inyector de temperatura programable (PTV), un sistema automatizado de inyección de muestras, AS 3000^®**********; y un espectrómetro de masas Polaris Q®^**********; con analizador de trampa de iones y módulo de control automático de flujo.

Procedimiento analítico

Se instaló una columna capilar TR–5MS^**********; (30m × 0.25 mm × 0.25 ym). Las condiciones de operación se describen a continuación. Inyector PTV: temperatura del inyector 240°C en modo CT sin división (CT splitless). Inyección de muestra 3 μl. Programa de separación cromatográfica: 50°C, 1 min, 25°C/min; 125°C, 1.00 min, 10 ml/min; 300°C, 2 min. Flujo del gas portador helio 1.0 ml/min. Línea de transferencia 220°C. El detector MS operó en el modo EI/MS², gas separador con flujo de helio de 0.3 a 2.0 ml/min y temperatura de la fuente 200°C.

La experimentación analítica se efectúo con el modo de adquisición de ionización electrónica (EI), realizando mediciones MS², con flujos variables de helio en la trampa de iones en el rango de 0.3–2 ml/min para optimizar el aislamiento de los iones precursores e incrementar la intensidad de los iones productos para los plaguicidas: α–BHC, γ–BHC (líndano), β–BHC, δ–BHC, heptacloro, aldrín, heptacloro epóxido, γ–clordano, α–clordano, endosulfán I, p,p'–DDE, diedrín, endrín, endosulfán II, p,p'–DDD, endrín aldehído, p,p'–DDT, endosulfán sulfato, metoxicloro y mirex.

Medición en el sistema GC/PTV/EI/MS²

Validación del método

Este método fue validado cumpliendo con las exigencias de la NMX–EC–17025–IMNC–2006/ISO/ IEC17025:2005¹⁶ y con la Decisión de la Comisión 2002/657/EC¹⁷ orientado en la detección y cuanti–ficación de 21 plaguicidas organoclorados de grasa de ganado porcino, determinando la especificidad del sistema analizando blancos de muestra (n = 20) de grasa de porcino, con el método desarrollado. La especificidad se midió realizando varios modos de operación (EI/MS y EI/MSMS) y estudiando las intensidades relativas de los iones precursores y de iones producto de los plaguicidas; la linealidad del sistema se determinó preparando curvas de calibración con cinco puntos, realizando tres repeticiones por punto y calculando el valor del coeficiente de correlación (r); la precisión y exactitud medida como el coeficiente de variación (%CV), en los enriquecimientos con la grasa de porcino, utilizando muestras controles enriquecidas a niveles de 0.005, 0.01 y 0.02 μg/ml, calculando los coeficientes de variación (CV%). El criterio de aceptación de los resultados se basó en la ecuación de Horwitz¹⁸ (CV = 2^{(1–0.5logC)}); la recuperación y repetibilidad se evaluaron en muestras fortificadas al nivel de 0.04 μg/ml.

Los valores obtenidos se compararon con una solución estándar de referencia, con cantidades de las sustancias correspondientes a 0.04 μg/ml. Los CC_α y CCj se calcularon de la siguiente manera: el límite de decisión se determinó analizando muestras fortificadas con concentraciones ascendentes de los compuestos (0.0025–0.04 μg/ml). Se calculó una curva de calibración y el límite de decisión y la capacidad de detección se calcularon con las expresiones matemáticas:¹⁹

Finalmente, para los estudios de robustez y reproducibilidad se realizaron ensayos con muestras diferentes en días consecutivos en dos sistemas diferentes de trampa de iones el Polaris Q^®**********; e ITQ 900^®,^**********; donde se obtuvieron resultados comparativos en las diferentes concentraciones.

Resultados

El método desarrollado por el sistema GC/PTV/EI/ MS² está basado en la optimización de los parámetros de medición del analizador de la trampa de iones (Cuadro 1). En este cuadro también se resumen los valores de energía de colisión inducida (CID) específicos, así como los iones precursores de los plaguicidas organoclorados analizados a partir de las fragmentaciones de sus estructuras moleculares.

Las afinaciones del sistema GC/MS², previas a las mediciones MS², se realizaron con los valores de flujo de helio de 0.3, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 ml/min utilizando perfluorotributilamina y logrando valores de siete cifras significativas para el ion m/z = 131 uma y seis cifras significativas para el ion m/z = 69 uma, este último ion con una intensidad relativa en el rango de 5070% mínima, para asegurar buena sensibilidad en las mediciones de MSMS.

La linealidad del método cumplió con las exigencias de la NOM–021–ZOO–1995, donde los coeficientes de correlación fue > 0.990 para todos los plaguicidas; en el Cuadro 2 se resumen los valores de linealidad obtenidos para las curvas de calibración con cinco puntos y tres repeticiones por concentración, en el rango de 0.0025~0.04 μg/ml.

En la Figura 1 se muestra la separación de los 20 plaguicidas y el espectro MS/MS de uno de ellos, mirex; las señales obtenidas cumplen con los MRL de la norma NOM–004–ZOO–1994, al analizar muestras fortificadas por debajo de estos niveles.

Discusión

Los laboratorios de constatación de salud animal en México tienen la responsabilidad de constatar la seguridad alimentaria de las carnes de importación y exportación destinadas al consumo humano, cumpliendo con las exigencias de las autoridades sanitarias del país destino. El dictamen de los resultados debe emitirse con el tiempo de entrega regulado en México por la Norma Oficial Mexicana NOM–004–ZOO–1994. Los resultados del seguimiento se informan a la Dirección General de Salud Animal, sobre todo los casos positivos que excedan los MRL.

El sistema convencional que se sugiere en la NOM–021–ZOO–1995, utiliza un detector semi–selectivo de captura de electrones (ECD) con un inyector en la modalidad operacional programada sin venteos de flujo (split–splitless) donde los plaguicidas organoclorados son inyectados a 230°C. El sistema de introducción de la muestra, utilizando el PTV, tiene la versatilidad de realizar diferentes modos de operación que se ensayaron en el desarrollo de este método. Los plaguicidas fueron analizados primero inyectando a bajas temperaturas para estudiar las degradaciones en puerto de inyección. Se probaron los modos PTV sin división de flujo (splitless) con temperatura de inicial del programa de 60°C y CT sin división de flujo (CT splitless con pulso), ambos modos dieron buenos resultados, aunque con el modo por pulso se lograron resultados adecuados para los propósitos del estudio, dada las recuperaciones de los enriquecimientos de la matriz para los diferentes niveles de la curva.

El método propuesto fue comparado con el de Butler y Conoley,⁵ quienes emplearon un inyector PTV con precolumnas de concentración, para realizar estudios estadísticos de las señales para plaguicidas organofosforados, comparando las señales de áreas y alturas con valores de flujo en trampa de iones de 0.3, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 4.0 y 5.0 ml/min. En el método desarrollado, la intensidad de los iones de los plaguicidas fue optimizada con un flujo de 1.0 ml/min para el aislamiento de los iones precursores y señales de los iones–producto, en el cual se obtuvieron valores de límites de decisión y capacidad de detección adecuados para cumplir con los MRL exigidos en la Norma Oficial Mexicana NOM–004–ZOO–1994.

La CID es de importancia fundamental para la optimización de las señales de los iones producto obtenidos para estabilización de las diferentes transiciones iónicas. Cada valor asignado de CID produce la formación de los fragmentos de iones en el modo de operación de espectrometría de masas por etapas MS², y el rango de masas para detectar la huella característica del ion precursor depende de los valores de energía máxima de excitación (q), que oscilaron en un rango de 0.225 a 0.45. Estos valores son fundamentales para lograr optimizar las señales de los iones–producto así como el tiempo aplicado de valor de radiofrecuencia (R_f); el rango de tiempo comprendido oscila entre 50–60 ms para todos los plaguicidas analizados.

Se estudió el efecto de la presión del gas separador (damping flow) sobre la intensidad de los iones precursores para las determinaciones por la técnica de espectrometría de masas por etapas MS², estudiando las señales con valores presión de helio 100, 110 y 120 psi, en el que fue posible optimizar el efecto de carga con una presión de 110 psi para la entrada de helio directa en la trampa de iones, aplicando valores de flujo de 0.3, 1.0 y 2.0 ml/min sobre cada uno de los iones precursores y productos de los plaguicidas, para lograr la sensibilidad adecuada y requerida para cumplir con las regulaciones nacionales e internacionales.

Una gran ventaja del desarrollo tecnológico que han tenido en los últimos años las trampas de iones para los laboratorios que están al servicio de la seguridad alimentaria, es que son muy sensibles en los modos de barrido total y la espectrometría de masas por etapas. El modo de operación MS² es más utilizado en la actualidad, proporciona una mayor seguridad analítica en los análisis de alimentos que son controlados con esta tecnología. Además, cuando las mediciones analíticas se hacen con los controladores automáticos de flujos de helio para el interior de la trampa y el método de adquisición de datos es optimizado con los valores exactos de las masas moleculares de iones precursores seleccionados de los plaguicidas organoclorados con valores de dos cifras decimales, la eficiencia del trampeo de los fragmentos iónicos seleccionados son optimizados y supera a los sistemas cromatográficos ciegos de GC–ECD. Ello es muy importante en las mediciones con la técnica de MSMS porque aunque estos equipos sean de baja resolución, si los iones precursores no son controlados con pesos moleculares enteros, sin tener presentes las fracciones, la trampa no optimiza la selección de los iones precursores para los valores de radio frecuencia (R_f) necesarios en estos analizadores y, como consecuencia, no seleccionan adecuadamente las relaciones de masa/carga (m/z) de los iones precursores y se obtiene baja intensidad de los iones–producto.

El método desarrollado con la instrumentación analítica GC/PTV/EI/MS/MS elimina los efectos de interferencia de la grasa de ganado porcino que se obtienen con un detector semi–selectivo de captura de electrones. El límite de decisión y la capacidad de detección cumplen con los límites máximos de residuos exigidos por la Norma Oficial Mexicana NOM–004–ZOO–1994² y los requerimientos de la Unión Europea. La utilización del módulo de control de flujo automático para la trampa de iones optimiza la eficiencia del trampeo de los iones precursores, incrementando las señales de los iones–producto, teniendo límites de decisión y capacidad de detección con resultados mejores de los que se logran con los detectores de captura electrónica recomendados en la NOM–021–ZOO–1995.1 Con un flujo de 1 ml/min se observó para casi todos los plaguicidas el incremento de las señales entre 400–500% de los valores normales de 0.3 ml/min valor configurado de referencia en trampa de iones en el Polaris Q.

Agradecimientos

Se agradece al Dr. Alejandro Plascencia Jorquera, del Cuerpo Académico de Nutrición y Biotecnología de Rumiantes de la Universidad Autónoma de Baja California, por el apoyo brindado y sus aportaciones como revisor del artículo.

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Notas

^* Supelco. Sigma–Aldrich Co. Estados Unidos de América.

^** EMD Omnisolv®. VWR International. Estados Unidos de América.

^*** Grado Unisolv®. SPECTRUM. Estados Unidos de América.

^**** Chem Service. Sigma Aldrich Co. Estados Unidos de América.

^****** Brockmann1, grado estándar, ~150 malla. Aldrich. Sigma Aldrich Co. Estados Unidos de América.

^******* 23 de mayo de 1995.

^******** Büchi. Büchi Labortechnik AG. Suiza.

^********* Thermo Trace GC Ultra®. Thermo Fisher Scientific. 81 Wyman Street Waltham, MA 02454. Estados Unidos de América.

^********** Thermo Fisher Scientiic. 81 Wyman Street Waltham, MA 02454. Estados Unidos de América.