Caracterización fenotípica y molecular de cepas de Pasteurella multocida aisladas de exudado nasal de bovinos, en dos cuencas lecheras de México
Phenotypic and molecular strain characterization of Pasteurella multocida isolated from cattle nasal exudate from two dairy complexes in Mexico
Víctor Manuel Campuzano Ocampo* Alma Delia González Rodríguez** Rigoberto Hernández Castro*** Francisco Suárez Güemes** Francisco José Trigo Tavera† Carlos Julio Jaramillo Arango*
* Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.
]]> ** Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D.F.*** Dirección de Investigación, Hospital General Dr. Manuel Gea González, Secretaria de Salud, Av. Calzada de Tlalpan #4800 Col. Sector XVI, 14080, México, D.F.
† Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D.F.
Autor de correspondencia:
Carlos Julio Jaramillo Arango,
Correo electrónico: cjja@servidor.unam.mx
Recibido el 18 de mayo de 2010
Aceptado el 14 de diciembre de 2010.
Abstract
Two hundred and fifty strains of P. multocida isolated from nasal exudate were obtained, 182 clinically healthy bovine strains and 68 clinically ill with pneumonia bovine strains, from two dairy complexes, one in the Tizayuca region of Hidalgo state (n = 81), and another in the Region Lagunera of the states of Coahuila and Durango (n = 169), Mexico. Strains were identifed by conventional biochemical tests and API 20NE commercial system. Capsular typing was performed by testing hyauloronidase and acrifavine, as well as by a multiplex PCR for amplification of genes hyaC–hyaD and dcbF. The overall results of hyaluronidase by the test showed that 90.4% (226/250) of the strains were capsular type A and through the acrifavine test 9.6% (24/250) was capsular type D. Using the multiplex PCR, 92% (230/250) was capsular type A and 8% (20/250) was capsular type D. The comparison of results between biochemical tests and PCR are consistent in identifying strains of capsular type A but not with the capsular type D. It was possible to confrm that capsular type A of P. multocida is predominat in Mexico.
Key words: Pasterurella multocida, capsular types, phenotypic characterization, molecular characterization, nasal exudate, cattle, PCR.
Resumen
Se obtuvieron 250 cepas de P. multocida aisladas de exudado nasal, 182 cepas de bovinos clínicamente sanos y 68 cepas de bovinos clínicamente enfermos de neumonía, de dos complejos lecheros, uno en la región de Tizayuca estado de Hidalgo (n = 81), y otro en la Región Lagunera de los estados de Coahuila y Durango (n = 169), México. Las cepas fueron identificadas mediante pruebas bioquímicas convencionales y el sistema comercial API 20NE. La tipificación capsular se realizó por medio de las pruebas de hiauloronidasa y acrifavina, así como por medio de una PCR múltiple para la amplificación de los genes hyaD–hyaC y dcbF. Los resultados globales mediante la prueba de hialuronidasa mostraron que 90.4% (226/250) de las cepas fueron del tipo capsular A y por medio de la prueba de acrifavina, 9.6% (24/250) fue del tipo capsular D. Por medio de la PCR múltiple, 92% (230/250) fue tipo capsular A y 8% (20/250) fue tipo capsular D. La comparación de los resultados entre las pruebas bioquímicas y la técnica de PCR concuerdan en la identificación de las cepas del tipo capsular A, pero no así con las del tipo capsular D. Se corrobora que en México el tipo capsular predominante de P. multocida es el A.
Palabras clave: Pasterurella multocida, tipos capsulares, caracterización fenotípica, caracterización molecular, exudado nasal, bovinos, PCR.
Introducción
]]> Pasteurella multocida es un cocobacilo Gram negativo, comensal habitual del tracto respiratorio superior de los rumiantes domésticos y silvestres. Sin embargo, bajo diversas condiciones se convierte en el agente etiológico de enfermedades que ocasionan grandes pérdidas económicas en todo el mundo.1–4 Se tienen identificados cinco tipos capsulares (A, B, D, E y F), cada uno generalmente asociado, pero no restringido completamente a un huésped. Asimismo, se clasifica en 16 tipos somáticos (1 al 16). P. multocida ocasiona dos enfermedades de gran impacto en el ganado bovino, la septicemia hemorrágica y la pasteurelosis neumónica. La septicemia hemorrágica es producida por los tipos B y E y afecta a los búfalos de agua y al ganado bovino en Asia, África Central y sur de Europa. Los tipos capsulares A y D afectan al ganado bovino en todo el mundo con tasas de morbilidad y mortalidad que oscilan de 4.6 a 89% y 1 a 13% respectivamente.3–8 El diagnóstico de las enfermedades producidas por P. multocida se ha basado tradicionalmente en signos clínicos y la identificación de características fisicoquímicas del agente. Estas pruebas se realizan con base en características fenotípicas; sin embargo, las condiciones de cultivo pueden influir en la expresión de propiedades, como la morfología, fermentación de carbohidratos y propiedades serológicas, y con ello disminuir la sensibilidad y la especificidad de los métodos basados en estas características para la identificación bacteriana.9 En años recientes las técnicas moleculares han demostrado ser un método rápido y sensible para el diagnóstico de las enfermedades particularmente en los casos de brote. El desarrollo de técnicas de PCR múltiple tipo específico para P. multocida ha aumentado el conocimiento del agente y de la epidemiología de la enfermedad.10Para el desarrollo de la PCR múltiple que permite la identificación de los tipos capsulares de P. multocida se diseñaron iniciadores específicos con el siguiente criterio de selección: los iniciadores fueron localizados dentro de los genes establecidos para cada uno de los tipos capsulares (hyaD, bcbD, dcbF ecbJ y ficb1) y el fragmento amplificado para cada gen permitió diferenciar a cada tipo capsular. Los genes se encuentran dentro de la región 2 del loci que codifica para la síntesis capsular.11,12
Para el caso particular de los tipos capsulares presentes en nuestro país, los genes a amplificar fueron hyaD–hyaC para el tipo A que codifica para la síntesis de ácido hialurónico y el gen dcbF para el tipo D que codifica para la síntesis de una glicosiltransferasa.11,13
El objetivo del presente trabajo fue identificar, a nivel molecular, cepas de P. multocida aisladas de exudado nasal de bovinos en dos cuencas lecheras de México.
Material y métodos
Origen y características de las cepas
Se obtuvieron 250 cepas de P. multocida aisladas de exudados nasales de 182 bovinos clínicamente sanos y 68 clínicamente enfermos de neumonía, de dos complejos lecheros, uno en la región de Tizayuca estado de Hidalgo (TZY) (n = 81) y otro en la Región Lagunera de los estados de Coahuila y Durango (RLA) (n = 169), México.
Identificación bacteriana
Las cepas fueron identificadas utilizando pruebas bioquímicas convencionales de oxidasa, fermentación de carbohidratos y ácido sulfhídrico (TSI), utilización de citrato, motilidad, producción de indol, producción de urea y fermentación de trehalosa y esculina. La identificación definitiva se realizó mediante el sistema comercial para bacilos Gram negativos, no enterobacterias y no exigentes API 20NE.* Los resultados fueron ingresados en el software API WEB (http://www.biomerieux.com), para determinar el género y la especie bacteriana. Todos los procesos se llevaron a cabo siguiendo las especificaciones del fabricante.
]]> De acuerdo con los valores propuestos por el sistema de API 20NE, se consideró que las cepas con un porcentaje de identificación (%ID) por encima de 90% pertenecían a la misma especie (P. multocida), con un %ID por encima de 80% pertenecían al mismo género (Pasteurella spp) y con un %ID debajo de 80% tenían un perfil aceptable.Tipificación capsular
La tipificación capsular se realizó por medio de pruebas bioquímicas descritas por Carter y Rundell para las cepas del tipo capsular A (SA) y Carter y Subronto para las del tipo capsular D (SD).11,12
Pruebas de hialuronidasa y acrifavina
Para la prueba de hialuronidasa las cepas se resembraron en agar sangre por estría continua y fueron cruzadas con una cepa nodriza de Staphylococcus aureus productora de hialuronidasa, e incubadas por 24 horas. La identificación de las cepas de P. multocida del SA se observó por una disminución en el tamaño de la cápsula cercana a la cepa nodriza.
Para la prueba de acrifavina las cepas fueron depositadas en tubos de 15 ml estériles con 3 ml de caldo infusión cerebro corazón (BHI)** y se incubaron a 37°C por 18 h. Posteriormente, se centrifugaron a 6000 g durante 10 minutos y se eliminaron 2.5 ml del sobrenadante, para después ser resuspendidos con 0.5 ml de una solución de acrifavina neutra 1:1,000; la reacción se visualizó a los 5 minutos. La identificación de cepas del SD se realizó por la formación de un fóculo. Para ambas pruebas se utilizaron cepas de referencia P. multocida A y D (donadas por el Dr. GH Frank y el Dr. B. Briggs, NADC, USDA) y como testigo negativo, una cepa de E.coli DH5α.
Extracción de ADN cromosomal
El ADN fue obtenido por el método de ebullición, brevemente se colocó una asada de la muestra bacteriana en 200 µl de agua estéril, la cual se sometió a una temperatura de 92°C durante 15 minutos, se centrifugó a 6000 g durante 15 minutos, y se tomaron 5 µl del sobrenadante que se utilizó como templete de ADN en la mezcla para PCR.
Tipificación capsular por PCR
Los tipos capsulares se determinaron por medio de una PCR múltiple, tomando como base el protocolo descrito por Townsend et al.,13 para la amplificación de los genes hyaD–hyaC y dcbF.
]]> Se colocaron 32.5 µl de agua destilada estéril, 5µl de amortiguador 1x PCR, 3 µM MgCl2, 1.6 µM de DNTP'S, 3.6 µM de cada uno de los iniciadores, 5 µl de ADN y 2.5 U de Taq ADN Polimerasa,*** la amplificación se realizó en un termociclador**** bajo las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 95°C por 5 minutos, seguido de una desnaturalización a 95°C por 30 segundos, alineación a 56.5°C por 30 seg y extensión a 72°C durante 30 seg por 30 ciclos. La extensión final se realizó a 72°C por 5 min para amplificar los genes hyaD–hyaC para el SA y el gen dcbF para el SD. La visualización de los productos amplificados se realizó en geles de agarosa a 1% teñidos con bromuro de etidio. Se utilizó el marcador de peso molecular 1 KB Plus (Invitrogen). El tamaño del producto de amplificación para el SA fue de 1,044 pb y para el SD de 657 pb. En cada PCR múltiple se utilizaron cepas de referencia de P. multocida SA y P. multocida SD y como testigo negativo se utilizó una cepa de E. coli DH5α.Análisis estadístico
Se realizó con el Programa para Análisis Epidemiológico de Datos Tabulados versión 3.0 (EPIDAT), Organización Panamericana de Salud (OPS/OMS) 2003.
Con los datos obtenidos se calcularon las frecuencias de los tipos capsulares (A y D) identificados en cada uno de los grupos según la identificación capsular o molecular.
La determinación de la concordancia entre los resultados de las pruebas de PCR y los resultados de las pruebas de hialuronidasa y acrifavina, se llevó a cabo mediante el cálculo de la concordancia absoluta y la concordancia específica y la prueba de Kappa.14,15
Resultados
Identificación de cepas mediante API 20NE
De acuerdo con los valores establecidos por el software API WEB, se lograron identificar 250 cepas de P. multocida, de las cuales 97.2% (243/250) mostró un porcentaje de identificación de 96%, y una tipicidad de 1 a P. multocida; 2.8% (7/250) presentaron 87.2% de identificación y 0.72 de tipicidad a P. multocida.
Tipificación capsular
]]> Los resultados globales mediante la prueba de hialuronidasa mostraron que 90.4% (226/250) de las cepas fue SA y por medio de la prueba de acrifavina, 9.6% (24/250) fue SD.De acuerdo con la región de origen, el porcentaje de identificación en la cuenca lechera de TZY fue de 80.25% (65/81) para el SA y 19.75% (16/81) para el SD, para la RLA, 95.26% (161/169) fue SA y 4.74% (8/169) SD (Cuadro 1).
En relación con el estado de salud en los animales clínicamente sanos 91.76% (167/182) fue SA y 8.24% (15/182) SD, en los clínicamente enfermos 86.76% (59/68) fue SA y 13.24% (9/68) SD (Cuadro 1).
Tipificación molecular
Mediante la prueba de PCR se amplificaron los genes hyaD–hyaC para el SA y el gen dcbF para el SD cuyos productos de amplificación tuvieron un peso molecular esperado de 1044 pb para el SA y de 657 pb para el SD (Figura 1).
Por medio de la PCR múltiple los resultados globales fueron de 92% (230/250) SA y 8% (20/250) SD. De acuerdo a la región de origen, en TZY el 100% (81/81) fue SA y en la RLA el 88.16% (149/169) SA y 11.84% (20/169) SD. De acuerdo con el estado de salud, en los animales clínicamente sanos 91.2% (166/182) fue SA y 8.8% (16/182) fue SD. Entre los bovinos clínicamente enfermos, 94.11%(64/68) fue SA y 5.89% (4/68), SD (Cuadro 2).
Se evaluó la concordancia de las pruebas de hialuronidasa y acrifavina con la PCR múltiple. La concordancia específica entre la prueba de hialuronidasa y la prueba de PCR fue de 90% y la concordancia absoluta, de 98%; la concordancia específica entre la prueba de acrifavina y la prueba de PCR fue de 8%, y la concordancia absoluta, de 98%. La concordancia entre las pruebas bioquímicas y la PCR con la prueba de Kappa, mostró una concordancia casi perfecta, igual a 0.9% y un valor de P de 0.0001, con un intervalo de confianza de 95%.
Discusión
Las patologías respiratorias representan grandes pérdidas económicas en la industria bovina en el país, por ello es relevante identificar y caracterizar los agentes etiológicos implicados en esta enfermedad, para así poder aplicar las medidas de diagnóstico, tratamiento y prevención adecuadas.16 A nivel mundial, los principales agentes bacterianos involucrados en problemas respiratorios en el ganado bovino son Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida e Histophilus somni.9 En México, se han identificado los tipos capsulares de P. multocida A y D como los responsables de ocasionar la pasteurelosis neumónica en los bovinos.17–19
Para la identificación bioquímica de P. multocida se dispone de métodos alternativos, los cuales se basan en sistemas comerciales que facilitan y agilizan la identificación, entre los cuales se encuentra el sistema API 20NE para bacilos Gram negativos, no enterobacterias y no exigentes, que ha demostrado ser un método de fácil aplicación y de alta confiabilidad para la identificación del género y la especie bacteriana, y que ha sido usado satisfactoriamente en aislamientos de P. multocida y M. haemolytica.20 Los resultados obtenidos por medio de este sistema mostraron un alto porcentaje de identificación y una tipicidad completa a P. multocida en todos los aislamientos. No se presentaron diferencias entre los grupos de animales sanos y enfermos.
Diversos autores21,22 han utilizado las pruebas bioquímicas de hialuronidasa y acrifavina para la caracterización fenotípica de cepas de P. multocida. Ellos mencionan que son una herramienta útil, de fácil realización, que disminuye muchos de los problemas presentes en la identificación mediante la prueba de hemoaglutinación indirecta, pero también presentan problemas relacionados con su limitada certeza, la confusión de resultados y las condiciones de cultivo que influyen en la expresión de algunas de las características fenotípicas de estas cepas, pudiendo presentar resultados falsos negativos o falsos positivos, además de requerir de personal técnico con amplia experiencia en la realización e interpretación de estas técnicas.
Las frecuencias en la identificación capsular mediante estas pruebas son muy variadas en todo el mundo, y según algunos autores el principal tipo capsular encontrado en problemas neumónicos es el A, con porcentajes que pueden ir desde 80 hasta el 100%. Trabajos similares se han realizado en ovinos, caprinos, cerdos y aves alrededor del mundo, donde el tipo capsular más frecuentemente encontrado es el A, con porcentajes que van desde 77 hasta 97.3%, mientras que del SD el rango es de 0.02 hasta 27%.23,24
Los resultados encontrados en el presente trabajo (SA 90.4% y SD 9.6%), en los que predomina el SA, son similares a los registrados por otros autores en el país. García et al.,25 a partir de exudado nasal encontraron 100% de cepas SA, mientras que a partir de pulmones neumónicos Blanco et al.26 registraron 61% para el SA, 25% SD y 14% de cepas no tipificables; Jaramillo et al.18 obtuvieron 100% de cepas pertenecientes a SA, y Jaramillo et al.19 a partir de pulmones neumónicos encontraron 98.7% para el SA y 1.2% para el tipo capsular D.
Diversos autores han empleado distintas técnicas moleculares como la ribotipificación y la reacción en cadena de la polimerasa, ya que permiten detectar con claridad las variaciones genéticas entre las cepas. Debido a su versatilidad, la PCR puede ser útil para el diagnóstico de rutina de la pasteurelosis en las diferentes especies y en la realización de estudios epidemiológicos, sin tener que recurrir a las pruebas fenotípicas, las cuales pueden llevar varios días antes de obtener un resultado.23,27–29
Estudios realizados, utilizando la PCR para la identificación molecular de los tipos capsulares de P. multocida en aislamientos de origen bovino, registran elevados porcentajes de identificación para el SA, que van de 92.3 a 99%, estos resultados son similares a los hallazgos de este trabajo, en los que 92% de los aislamientos correspondieron a SA.30,31 En México no existen datos publicados en los cuales se utilice la prueba de PCR para la identificación de los tipos capsulares de P. multocida.
]]> No existen diferencias significativas entre los aislamientos de los dos tipos capsulares en los complejos lecheros estudiados. Esto puede deberse al comportamiento tan homogéneo que presentan estos tipos capsulares alrededor del mundo y del país.La comparación de los resultados entre las pruebas bioquímicas (hilauronidasa y acrifavina) y la técnica de PCR concuerdan en la identificación de las cepas del SA pero no así con las del SD, ya que existen 20 cepas identificadas como SD mediante estas pruebas bioquímicas, que por medio de la PCR fueron SA; esto puede deberse a los problemas que enfrentan las pruebas fenotípicas, en las que las condiciones del cultivo puede influenciar la expresión de los atributos fenotípicos como la morfología, fermentación de carbohidratos y propiedades serológicas, asimismo las cepas de P. multocida presentan tres variantes: mucoides, lisas iridiscentes y lisas no iridiscentes, todo ello puede generar confusión en la identificación de este organismo.9,32,33
Se corrobora que, de manera similar a otros países de Europa y América, en México el tipo capsular predominante de P.multocida en bovinos es el tipo A.
Las técnicas bioquímicas y la prueba de PCR mostraron diferencias en la identificación de los tipos capsulares de P. multocida, las cepas identificadas como SD son verdaderamente SA, esto se debe a la subjetividad de las pruebas bioquímicas que se encuentran influenciadas por la presentación de las características fenotípicas que pueden variar de una cepa a otra.
Agradecimientos
Se agradece a la UNAM, mediante el proyecto PAPIIT IN208708 y al Conacyt a través del proyecto CB104031, por el apoyo brindado a este trabajo. A los Departamentos de Microbiología e Inmunología y Medicina Preventiva y Salud Pública de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM por el apoyo y las facilidades otorgadas para la realización de este trabajo.
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