Efecto del coumestrol sobre la producción espermática y la conducta de exploración olfatoria de perros estimulados con moco vaginal estral

Effect of coumestrol on sperm production and smell exploratory behavior in dogs stimulated with vaginal mucus

Juan José Pérez–Rivero*^,** José Juan Martínez–Maya** Mario Pérez–Martínez*** Álvaro Aguilar–Setién† Héctor Serrano‡

* Programa de Doctorado en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

** Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

† Unidad de Investigación Médica en Inmunología, Instituto Mexicano del Seguro Social, Centro Médico Nacional Siglo XXI, Hospital de Pediatría, Avenida Cuauhtémoc 330, Col. Doctores, 06720, México, D. F.

‡ Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana–Iztapalapa, San Rafael Atlixco 186, Col. La Purísima, 09340, México, D. F., Tel.: 5804–4733, Fax: 5804–4727, correo electrónico: hser@xanum.uam.mx

Recibido el 8 de enero de 2008
Aceptado el 13 de octubre de 2008.

Abstract

Dog overpopulation is a major health problem in developing countries due to the existence of some zoonotic diseases in which dogs act as reservoirs, besides the aggressive events to humans. Distribution, behavior patterns and combined methodologies are needed aspects in the design of successful dog population control programs. Coumestrol is a phytoestrogen which induces alterations in the reproductive male system, when bind to alpha and beta estrogen receptors acting as an agonist or antagonist fashion. Both receptor types also exist in central nerve regions governing sexual behavior of those animals such as the preoptic area, ventro medial nucleous, the amygdala and the olfactory bulb. In this study, 300 μg/kg coumestrol was orally administered to male dogs, once a week for a 4 week period. Dogs were freed for 5 min in a 9 m² area having a recipient containing vaginal discharges from estrous dog females and other similar vessel containing sterile saline solution. Smelling latency time for each recipient, smelling frequency and territory marking in response to stimulus, was recorded. At the end of the test, semen was collected and evaluated. A significative difference (P < 0.005) in smelling latency time and smelling frequency to the vaginal discharge was found; sperm count decreased from 518.4 ± 215.4 × 10⁶ to 57.6 ± 50.4 × 10⁶ at week 4 and the abnormal sperm morphology increased from 14.7 ± 3.3% at 0 week to 60.0 ± 20%. In conclusion, 300 μg/kg coumestrol given orally to male dogs for 4 weeks induces alterations in the olfactory behavior along with an oligo and teratospermic effect.

Key words: olfactory exploration, coumestrol, dogs, sperm production, vaginal mucus.

Resumen

La sobrepoblación canina es un problema importante de salud pública debido a la transmisión de enfermedades zoonóticas y las agresiones hacia el humano. En el diseño de programas para controlar la población canina se requiere del conocimiento de su distribución, comportamiento y metodologías combinadas para tener éxito. El coumestrol es un fitoestrógeno que induce alteraciones en el aparato reproductor de los machos al unirse a los receptores estrogénicos alfa y beta, en donde actúa de manera dosis–dependiente como agonista o antagonista. Estos receptores también existen en las estructuras del sistema nervioso que regulan el comportamiento sexual, como la región preóptica, núcleo ventromedial, la amígdala y el bulbo olfatorio. En este estudio se administró coumestrol (300 μg/kg) por vía oral a perros machos, una vez por semana durante cuatro semanas; los perros se colocaron durante cinco minutos en un área aislada de 9 m² en donde se colocó un frasco conteniendo secreciones vaginales obtenidas de perras en estro y otro con solución salina estéril. Se registró el tiempo de latencia de los perros para olfatear cada frasco, su frecuencia de respuesta y la frecuencia con que se presentó conducta de marcaje en respuesta al estímulo. Una vez concluido el experimento, se obtuvo semen y se evaluó. Se encontró diferencia significativa (P < 0.005) en el periodo de latencia y frecuencia con la que el macho se acercó a oler las secreciones vaginales y el conteo espermático disminuyó de 518.4 ± 215.4 × 10⁶ al inicio del estudio a 57.6 ± 50.4 × 10⁶ en la semana cuatro y el porcentaje de anormalidades espermáticas aumentó de 14.7 ± 3.3 puntos en la semana 0 a 60.0 ± 20.0% en la semana cuatro. Se concluye que el tratamiento de perros con coumestrol durante cuatro semanas ocasiona alteraciones en la conducta de exploración olfatoria y tiene un efecto oligospérmico y teratospérmico.

Palabras clave: exploración olfatoria, coumestrol, perros, producción espermática, moco vaginal.

Introducción

Los perros son una especie prolífica con características reproductivas particulares. Se estima que en seis años una perra y sus crías tienen el potencial para procrear 67 mil nuevos perros;^1,2 en este contexto, la sobrepoblación de perros callejeros constituye un problema de salud pública en la Ciudad de México.³

Los riesgos que implica la sobrepoblación canina estriban en que esta especie es susceptible de padecer varias enfermedades de tipo zoonótico, como rabia,⁴ leptospirosis,⁵ y distintas parasitosis.⁶ En ocasiones, los perros pueden transmitir este tipo de enfermedades al humano, ello aunado a los casos de agresiones físicas que en ocasiones inflingen, en las que los niños resultan afectados con mayor frecuencia.^7,8

La elaboración de programas de control de la población de perros callejeros requiere del conocimiento de su distribución, patrones de comportamiento, así como del empleo de metodologías combinadas para lograr dicho objetivo con éxito.

Además de la esterilización quirúrgica en ambos géneros y la inyección intratesticular con diferentes agentes químicos, las estrategias para controlar la función reproductiva de esta especie incluyen el uso de diferentes preparaciones proteínicas de la zona pelúcida porcina,⁹ de la hormona liberadora de gonadotropinas o incluso de las propias gonado–tropinas.¹⁰ Actualmente se estudia el uso de algunos fitoestrógenos para el control reproductivo en especies silvestres.¹¹ En este sentido, dentro de la lista de fitoestrógenos conocidos, el coumestrol parece tener efectos prometedores.

Además, se ha notificado que el coumestrol administrado en dosis de 100 μg/g en la dieta, afecta el desarrollo neuroendocrino de ratas lactantes en ambos géneros. En hembras adultas en lactancia, es posible inducir con varias exposiciones orales un síndrome anovulatorio. Los efectos aditivos del coumestrol se han observado cuando ingresan por vía oral y no por la vía parenteral, esto último como consecuencia de la prolongada vida media de eliminación. Yamada et al.¹⁵ proponen que es modificado en su estructura por la acción de bacterias presentes en el tracto digestivo, para su posterior adsorción y transporte en el sistema bascular, metabolismo hepático y finalmente su desecho en la orina. En machos se ha informado que ocasiona disminución importante de peso y de la líbido.^16,17

El COU se une a los receptores estrogénicos beta (ERβ con mayor afinidad que el 17β estradiol, así como a los receptores estrogénicos alfa (ERα) con menor afinidad y tiene efectos agonistas o antagónicos sobre ambos receptores, según la dosis administrada.¹⁸

Asimismo, los ERβ se expresan en diferentes regiones en el testículo, asociadas con la espermatogénesis, como los conductos eferentes, epidídimo y conductos deferentes, además de la próstata.¹⁹ Igualmente, se ha demostrado su expresión y acumulación en sitios relacionados con el comportamiento, como la región preóptica, implicada en la conducta sexual del macho, además del núcleo ventromedial, la amígdala y el bulbo olfatorio (BO), que intervienen en la modulación de la excitación sexual.^20,21

El sistema olfatorio de los mamíferos tiene la capacidad de detectar diferentes moléculas²² por medio de los sistemas quimiosensoriales, como las feromonas. Estas sustancias son secretadas hacia el exterior de un individuo y son captadas por otro individuo de la misma especie, en el que inducen una conducta especifica; 23 por ejemplo, el reflejo de Flehmen en muchas especies de rumiantes.²⁴ Esa misma señal es captada por diversos sistemas quimiosensoriales, como el epitelio olfativo principal, el cual está formado principalmente por neuronas sensoriales olfatorias ciliadas, cuyas proyecciones llegan al BO y al órgano vomeronasal.^25,26

La capacidad de los perros para detectar y asociar olores específicos está bien documentada,^27–29 incluso desde el nacimiento pueden asociar olores de los alimentos a los que su madre fue expuesta durante la gestación.³⁰ La detección de feromonas no es la excepción, éstas contienen elementos volátiles de bajo peso molecular, capaces de ejercer una acción atrayente de las hembras en celo hacia los machos, desde distancias considerables, estimulando la conducta de monta.

A partir de las secreciones de moco vaginal de las hembras en estro, se ha aislado una feromona identificada químicamente como metil p–hidroxibenzoato, que atrae sexualmente a perros machos.^31,32

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del COU administrado vía oral sobre la producción espermática y la conducta de exploración olfatoria de perros estimulados con moco vaginal de perras en estro.

Material y métodos

La evaluación del efecto de las secreciones vaginales se realizó de acuerdo con el criterio de Goodwin et al.³³ El experimento se realizó utilizando cinco perros mestizos clínica y reproductivamente sanos de 1.5 a tres años de edad y con peso promedio de 10.1 ± 3.3 kg. En estos machos se verificó ausencia de anticuerpos contra Brucella canis mediante la prueba de aglutinación en placa. Durante el experimento, los machos fueron alojados de manera individual en instalaciones con suficiente espacio para hacer ejercicio, con agua y alimento de tipo comercial ad libitum. A todos los perros se les proporcionó un juguete para morder con el fin de enriquecer su medio ambiente.³⁴

Antes de recibir el tratamiento con COU, se determinaron en los perros los parámetros a evaluar en el estudio: a este periodo se le consideró la semana cero, de tal manera que cada animal fuera su propio testigo y así compararlo con el efecto del tratamiento durante el tiempo del experimento. De esta manera, los valores notificados durante la semana cero corresponden a los perros sin tratamiento. A todos los animales se les administró vía oral una dosis semanal de 300 μg/ kg de COU, durante cuatro semanas.

Los experimentos se efectuaron en una habitación vacía y limpia de 9 m². En ésta se colocaron en el suelo y equidistantes al único acceso, dos frascos de cristal con tapas perforadas a tres metros de distancia entre ellos, fijados al piso con cinta adhesiva; uno de los frascos contenía las secreciones vaginales y el otro sólo puntas de algodón humedecidas con solución salina estéril (SSE).

Una vez por semana cada perro fue colocado en el cuarto de evaluación durante cinco minutos, en ese tiempo se observó y se registró con un cronómetro la latencia de respuesta, la cual se definió como el tiempo que tardó cada animal en manifestar interés por explorar olfatoriamente el contenido de los recipientes y el número de veces que se aproximó a cada uno de los dos frascos durante más de cinco segundos. Además, se registró el número de veces en que los perros orinaron, levantando la pata en el cuarto después de oler el contenido de alguno de los recipientes. Las evaluaciones individuales eran seguidas de limpieza de la habitación, con hipoclorito de sodio y ventilación por al menos dos horas antes de hacer la evaluación del siguiente perro.

Una vez concluido el experimento, mediante estimulación manual se recolectó semen de cada perro en un cono recolector de nailon.³⁵ En cada eyaculado se determinaron de manera manual, empleando un microscopio de contraste de fases* y un hemocitómetro, los números totales de espermatozoides sanos y de espermatozoides con alteraciones morfológicas.^36,37

Para el análisis estadístico de los resultados se empleó un análisis de varianza de mediciones repetidas, comparando el número total de espermatozoides de cada perro durante las semanas del experimento; asimismo, se comparó el periodo de latencia, la frecuencia de respuesta de la conducta de exploración olfatoria y del marcado de territorio con orina mediante prueba de Friedman de mediciones repetidas. Todo con las facilidades del programa de estadística SAS (SAS Institute, Cary, NC).^38,39

Resultados

La frecuencia de olfateo del recipiente con las secreciones vaginales disminuyó significativamente de la primera a la cuarta semanas. Estos valores variaron de 2.6 ± 1.95 veces en la semana cero a 0.6 ± 0.55 en la semana cuatro (P < 0.01). De igual manera, la menor frecuencia de marcado de territorio con orina de los perros se observó en la cuarta semana, iniciando en 2 ± 0.63 veces y culminando en 0.4 ± 0.49 ocasiones (P < 0.005). No se encontraron diferencias significativas (P > 0.05) en las respuestas a la SSE durante el periodo de evaluación (Figura 1).

El número total de espermatozoides eyaculados disminuyó de manera significativa (P < 0.005) al pasar de 518.4 ± 215.4 × 10⁶ la semana cero a 57.6 ± 50.4 × 10⁶ hacia la semana cuatro. El porcentaje de espermatozoides que presentaron alteraciones en la morfología espermática pasó de 14.7 ± 3.3 puntos porcentuales en la semana cero a 60.0 ± 20.0% en la semana cuatro (P < 0.005) (Figuras 3 y 4).

Discusión

Los estrógenos son esenciales para la espermatogénesis. En el modelo experimental de ratones deficientes a los ERα (ERαKO) se ha observado que son infértiles, debido a que el ERα es necesario en los conductos deferentes, importante para la reabsorción de fluidos provenientes de la red testicular.⁴⁰

La capacidad del COU para unirse a los ERα y ERβα es conocida.⁴¹ En los perros, ambos tipos de receptores se hallan en los testículos,⁴² por lo que este fitoestrógeno puede actuar sobre ellos dependiendo de la dosis que se administre, como antagonista estrogénico sobre el ERa. Esta interacción induce un estado similar al del ERocKO en lo que se refiere a la reabsorción de fluidos a nivel de los conductos deferentes. Este efecto induce la reducción del número de espermatozoides que ingresan al epidídimo. Como consecuencia de la alteración de la dinámica de los fluidos, éstos se acumulan en los testículos, dañan el epitelio germinal de los conductos seminíferos y, por ende, producen alteraciones en el desarrollo de los espermatozoides.^40,43 En este estudio no se efectuó la evaluación histopatológica de los testículos; sin embargo, al igual que lo informado por Hess et al.,⁴⁰ es posible que estas alteraciones sean la causa de la oligospermia y teratospermia observadas en los animales del presente estudio.

Se ha demostrado la existencia de ERα en los núcleos ventromedial y preóptico medio del hipotálamo. Estas regiones anatómicas están relacionadas con el olfato y el comportamiento sexual. En ratones hembra se ha encontrado que el coumestrol antagoniza los efectos neuroendocrinos de los estrógenos a través del receptor estrogénico tipo a.⁴⁴

El aumento en el periodo de latencia de respuesta a las secreciones vaginales, observado en el presente estudio, es similar al que se presenta en ratas tratadas con COU en la dieta.¹⁶ La pérdida del comportamiento sexual en ratones se observa en los modelos experimentales ERαβKO, ello indica que ambos receptores se complementan para que el comportamiento sexual se efectúe.²¹ La capacidad de unión del COU a ambos receptores y su acción antagónica hacia éstos puede estar relacionada con las alteraciones en la conducta de exploración olfatoria de las secreciones de moco cervical de hembras en celo que se encontraron en este estudio.

Además de las alteraciones en la respuesta a feromonas, en el presente estudio se observó que el tratamiento de perros con dosis de 300 μg/kg de COU durante cuatro semanas tiene un efecto oligospérmico y teratospérmico. En conjunto, los cambios etológicos y las características morfológicas de los espermatozoides, observados en este estudio, indican que potencialmente el uso de COU podría servir de base para el desarrollo de nuevas estrategias para el control de poblaciones de perros no domiciliados, como un producto que se administre vía oral, interfiera con la respuesta sexual del macho y disminuya el conteo de espermatozoides eyaculados. Sin embargo, es necesario evaluar el efecto del COU sobre otros aspectos de la fisiología y endocrinología del perro, a fin de delimitar su utilidad para este fin y determinar sus posibles efectos secundarios.

Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, de México, la beca otorgada al primer autor para realizar los estudios de Doctorado en Ciencias de la Producción y la Salud Animal.

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Notas

*Carl Zeiss, Alemania.