Crotalaria incana L. and Leucaena leucocephala Lam. (Leguminosae) as indicators of toxicity by petroleum hydrocarbons in soil
Dinora VÁZQUEZ–LUNA, Mepivoseth CASTELÁN–ESTRADA, María del C. RIVERA–CRUZ, Ángel I. ORTIZ–CEBALLOS y Francisco IZQUIERDO R.
Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Km. 36.5 carretera México–Texcoco, Montecillo 56230, Estado de México, México, dinovaz@colpos.mx.
Recibido julio 2009
Aceptado mayo 2010
RESUMEN
En este estudio se evaluaron los efectos tóxicos que produce un suelo Gleysol mólico contaminado con petróleo crudo, sobre plántulas de dos especies de leguminosas. Para ello se generó un índice de impacto fitotóxico (IIF) que integra cinco parámetros, medidos a través de índices relativos de impacto (IRIF(x)) para las variables emergencia, altura, longitud radicular, biomasa aérea y biomasa radicular. Los bioensayos se realizaron bajo un diseño completamente al azar, con tres repeticiones, en condiciones semicontroladas, para evaluar la sensibilidad de Leucaena leucocephala y Crotalaria incana a diferentes concentraciones de HTP (hidrocarburos totales del petróleo). En general, se observaron efectos altamente significativos (P ≤ 0.01) al aumentar la concentración de HTP en el sustrato. La emergencia de L. leucocephala fue 29 % menor con 80 000 mgkg–1 de HTP, mientras que C. incana disminuyó 30 % con 32 000 mgkg–1 de HTP. Respecto a los testigos, ambas especies mostraron un retraso de cinco días en la emergencia de las plántulas cuando se expusieron a altas concentraciones de HTP. Una disminución significativa en la acumulación de materia seca (MS) con concentraciones superiores a 20 000 mgkg–1 de HTP se observó en ambas especies. Los IIF respectivos mostraron una disminución de 50 % con 80 000 y 25 000 mgkg–1 de HTP; sin embargo, L. leucocephala no presentó efectos significativos con 10 000 mgkg–1 de HTP. Por su parte, la CE50 en L. leucocephala,se presenta con 80 000 mgkg–1 de HTP, mientras que en C. incana este parámetro se observa a partir de 25 000 mgkg–1 de HTP.
Palabras clave: CE50, contaminación del suelo, índice de fitotoxicidad, petróleo crudo.
ABSTRACT
This study assesses the toxic effects produced by a Gleysol molic soil contaminated with crude oil on seedlings of two species of legumes. A phytotoxic impact index (IIF) was generated, which includes five parameters measured by relative rates of impact (IRIF(x)) for variables; emergency, height, root length, aboveground biomass and root biomass. Bioassays were conducted under a completely randomized design with three replications under semi–controlled conditions, to assess the sensitivity of Leucaena leucocephala and Crotalaria incana at different concentrations of HTP (total petroleum hydrocarbons). Effects were highly significant (P ≤ 0.01) with increasing concentrations of HTP in substrate. The emergence of L. leucocephala was 29 % lower with 80 000 mgkg–1 HTP, while C. incana decreased 30 % with 32 000 mgkg–1 HTP respect to control. Both species showed a five–day delay in the emergence of seedlings when exposed to high levels of HTP. A significant decrease in the accumulation of dry matter (DM) at concentrations above 20 000 mgkg–1 HTP was observed in both species. The respective IIF declined of 50 % with 80 000 and 25 000 mgkg–1 TPH, but L. leucocephala had no significant effect with 10 000 mgkg–1 TPH. Finally, the EC50 in L. leucocephala, is presented with 80 000 mgkg–1 TPH whereas in C. incana this parameter is noted from 25 000 mgkg–1 TPH.
Key words: EC50, crude oil, phytotoxicity index, soil pollution, total petroleum hydrocarbons.
INTRODUCCIÓN
]]> La industria del petróleo en México ha tenido un impacto negativo sobre los recursos naturales. En el sureste del país extensas zonas han sido afectadas por derrames que ocurren durante la extracción, conducción y transporte del petróleo (Rivera–Cruz et al. 2005). Los efectos negativos aumentan debido al mal estado de los ductos y a la dispersión de los contaminantes (Vega et al. 2009) causados por las abundantes precipitaciones características de regiones tropicales (Rivera–Cruz y Trujillo–Narcia 2004).Para entender el efecto de los contaminantes del petróleo sobre los suelos es necesario conocer la relación que existe entre la cantidad, composición y grado de afectación sobre los organismos vivos (Al–Mutairi et al. 2008). Los estudios de contaminación de suelos se pueden realizar por dos vías: mediante análisis químico de los suelos (Kisic et al. 2009), o bien por la evaluación de la respuesta in vivo de plantas que crecen en suelos contaminados (Shahriari et al. 2007), lo cual permite evaluar los efectos del contaminante sobre los organismos (Porta et al. 1999). El último es el método empleado en este estudio, por lo que se hacen pruebas de toxicidad en plántulas para medir la respuesta fisiológica a diferentes concentraciones de HTP (hidrocarburos totales del petróleo) (Chaîneau et al. 2003).
La fitotoxicidad estudia los cambios perjudiciales en el funcionamiento, aspecto y crecimiento de las plantas en respuesta a una sustancia dada (OECD 1984). Por ello, en el presente trabajo se hicieron pruebas de toxicidad mediante bioensayos ex–situ para determinar el efecto fitotóxico en plántulas de Leucaena leucocephala y Crotalaria incana expuestas a suelo contaminado con diferentes concentraciones de petróleo crudo. El objetivo de este estudio es desarrollar y evaluar un índice que permita establecer parámetros de referencia estadísticamente confiables para determinar el impacto fitotóxico que generan los hidrocarburos contaminantes del suelo sobre la emergencia, longitud radicular, altura y acumulación de materia seca (MS) en especies leguminosas.
MATERIALES Y MÉTODOS
El suelo empleado en los bioensayos corresponde a un Gleysol mólico (FAO 1998) que fue colectado en el ejido Arroyo Hondo Santa Teresa, municipio de Cárdenas, Tabasco. Se determinó el contenido de HTP en las muestras, encontrando un valor de 150 mgkg–1 de peso seco; según la NOM–138–SEMARNAT/SS–2003 este suelo se considera no contaminado (SEMARNAT 2005).
Para establecer los bioensayos se empleó un diseño completamente al azar (DCA) con tres repeticiones y dos leguminosas Leucaena leucocephala Lam., y Crotalaria incana L. Estas fueron seleccionadas por ser especies que crecen silvestres en áreas contaminadas con petróleo; la primera presenta tolerancia, mientras que la segunda muestra sensibilidad a altas concentraciones de petróleo crudo (Rivera–Cruz y Trujillo–Narcía 2004, Rivera–Cruz et al. 2005). Por lo anterior, con L.leucocephala se evaluaron seis tratamientos a altas concentraciones, mientras que con C.incana se evaluaron siete tratamientos a bajas concentraciones (Rivera–Cruz et al. 2005). En cada bioensayo se utilizó el Protocolo 208 de la Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico (OECD 1984) modificado (Rivera–Cruz y Trujillo–Narcia 2004), que permite identificar en forma sencilla los síntomas de estrés en la planta (Wang y Freemark 1995).
El suelo fue secado a la sombra hasta 13 % de humedad, se molió y tamizó a 5.0 mm. Los sustratos para los ensayos se prepararon a partir de suelo testigo (150 mgkg–1 HTP) que se mezcló con diferentes cantidades de petróleo crudo ligero y se homogeneizó, sin agregar solvente alguno; las concentraciones a probar se calcularon en base seca (p/p). Leucaena leucocephala se evaluó con 150 (testigo), 10 000, 20 000, 40 000, 60 000 y 80 000 mgkg–1 de HTP. Para Crotalaria incana se evaluaron concentraciones de 150 (testigo), 1700, 3500, 7000, 12 000, 25 000 y 32 000 mgkg–1 de HTP.
Después de homogenizar las mezclas se les adicionó agua destilada hasta llevarlas a 28–30 % de humedad; se incubaron 24 horas y posteriormente se sembraron 50 semillas de C.incana y 25 de L. leucocephala por repetición, respectivamente, en contenedores de vidrio de 32 x 22 x 5.5 cm de profundidad. La cantidad de semillas sembradas por especie vegetal, se calculó según el tamaño de la semilla (Leishman et al. 2000), la viabilidad de la especie (Carreras et al. 2001, Bosco 2009) y el área del contenedor (Rivera–Cruz y Trujillo–Narcia 2004). Las semillas fueron escarificadas previamente para eliminar los tegumentos impermeables que constituyen una barrera para la germinación (Antoniolli et al. 1993, Carreras et al. 2001). La escarificación consistió en sumergir las semillas en ácido sulfúrico durante 15 minutos y posteriores lavados sucesivos con agua corriente hasta eliminar todos los residuos de ácido (Huachin y Carvajal 1998). Se realizaron pruebas de germinación para determinar la viabilidad inicial de las semillas, encontrando valores estándar de viabilidad en ambos lotes (Carreras et al. 2001, Bosco 2009).
Durante los ensayos se proporcionó agua para mantener la humedad del sustrato a capacidad de campo; no se aportaron nutrimentos N, P y K, para evitar interferencia sobre el crecimiento de los ejemplares. Las variables observadas fueron emergencia, emergencia acumulada, altura, longitud radicular y acumulación de MS aérea y radicular. La primera se midió cada cinco días, mientras que las siguientes variables se evaluaron 30 días después de la siembra; al finalizar dicho período se extrajeron las plántulas de los contenedores y se eliminó el exceso de suelo, se separó la parte aérea de la radicular, se colocaron en bolsas de papel etiquetadas y se secaron en estufa (75 °C, 48 h). El material se pesó en una balanza analítica para obtener los valores de MS. La comparación múltiple de medias se realizó mediante la prueba de Tukey (a = 0.05). Los resultados numéricos fueron analizados mediante el software SAS (1999) versión 9.1, utilizando el procedimiento PROC GLM.
]]> El índice relativo de impacto fisiológico (IRIF) propuesto, se calculó para cada variable (x) en ambas especies bajo estudio. Para medir el efecto de tratamientos, los IRIF(x) de cada variable fueron comparados con la correspondiente del testigo (150 mg.kg–1 de HTP). El IRIF(x) se obtuvo al restar una unidad al índice de tolerancia (Porta et al. 1999), ya que éste permite evaluar la respuesta biológica en un suelo contaminado. El índice de impacto fitotóxico (IIF) se obtuvo de la suma de todos los IRIF(x), divididos entre el total de las variables estudiadas, cuyo valor representa la respuesta de la planta al contaminante en función del total de las variables fisiológicas estudiadas. Para ello se utilizaron las ecuaciones siguientes:
donde: IRIF(x): índice relativo de impacto fisiológico para la variable x
IIF: índice de impacto fitotóxico
Tp: concentración de HTP
Tt: testigo
R1: repetición 1…n
n: número de variables
Los resultados se interpretaron con los siguientes criterios: si el IRIF(x) es igual a cero, los HTP no afectan la variable en ningún sentido; si el IRIF(x) es menor a cero, los HTP aumentan la expresión de la variable; si el IRIF(x) es mayor a cero, los HTP producen efectos negativos sobre la variable.
Se determinó además la CE50 (concentración–efecto) que produce efectos observables en 50 % de la muestra, y la CNOE (concentración efecto no observable), que es la máxima concentración que puede existir en el medio sin que se observen efectos después de 30 días de exposición al petróleo.
]]>RESULTADOS
El análisis de varianza de la emergencia acumulada en plántulas de L. leucocephala mostró diferencias estadísticas altamente significativas entre tratamientos (P ≤ 0.01). La mayor emergencia se concentró en los primeros cinco días, en los tratamientos con concentraciones de hasta 40 000 mgkg–1 de HTP, pero se observó un retraso de cinco días en la emergencia de plántulas expuestas a 60 000 y 80 000 mgkg–1. Se encontró una disminución altamente significativa en la emergencia acumulada con esta última concentración durante los 30 días de exposición al petróleo (Fig. 1). Lo anterior coincide con lo encontrado mediante el índice relativo de impacto fisiológico para la variable emergencia acumulada (IRIFe), el cual mostró ser 30 % menor respecto al testigo al final de la prueba.
El análisis de varianza de la emergencia acumulada de plántulas de C.incana, mostró diferencias altamente significativas entre tratamientos (P ≤ 0.01). La mayor emergencia acumulada durante 30 días de exposición al petróleo se presentó con 1700 mgkg–1, en tanto la menor emergencia se registró con 32 000 mgkg–1 (Fig. 2). El IRIFe disminuyó 30 % con respecto al testigo.
IRIF para las variables altura, longitud radicular y acumulación de MS
El análisis de varianza del IRIF para las variables altura, longitud radicular, biomasa aérea, biomasa radicular y biomasa total de plántulas de L. leucocephala y C. incana mostró diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01) entre los tratamientos, durante el periodo de exposición al petróleo. Tanto la altura como longitud radicular de L. leucocephala disminuyeron a mayores dosis de petróleo. El tratamiento con 80 000 mgkg–1 de HTP mostró el mayor IRIF sobre la altura y longitud radicular (Fig. 3), con una disminución respecto al testigo de 41 y 72 %, respectivamente. La mayor cantidad de biomasa aérea y radicular se encontró en el testigo y con 10 000 mgkg–1 de HTP, lo que indica que esa concentración no es tóxica para esta especie. La menor acumulación de MS se encontró en suelos con concentraciones de 20 000 a 80 000 mgkg–1 de HTP, donde se encontraron los mayores IRIF (Fig. 3). Este comportamiento se asoció con una producción 45 % menor de hojas; como consecuencia, el crecimiento de tallos y raíces fue afectado de manera sustancial, lo que redujo la biomasa radicular en 53 % respecto al testigo.
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En el bioensayo con C. incana, el análisis de varianza de los IRIF para las variables altura, longitud radicular y acumulación de MS, mostró efectos negativos con el incremento en la concentración de petróleo (Fig. 4). La altura y longitud radicular mostraron menor magnitud en concentraciones de 12 000 a 32 000 mgkg–1 de HTP, mientras que la mayor acumulación de MS aérea y radicular se encontró con concentraciones de 1700 a 7000 mgkg–1 de HTP. Esta diferencia se explica porque los tallos de C. incana con bajas concentraciones presentaron 20 % mayor longitud–diámetro y longitud de la radícula que en concentraciones mayores a 12,000 mgkg–1 de HTP.
Índice de impacto fitotóxico
El análisis de varianza del IIF en plántulas de L. leucocephala y C. incana expuestas a diferentes concentraciones de petróleo mostraron diferencias estadísticas altamente significativas (P ≤ 0.01). En ambas especies, losIIF se incrementaron al aumentar la concentración de petróleo en el sustrato, lo que tuvo repercusiones significativas sobre el crecimiento y desarrollo (Cuadro I). Excepcionalmente, en L. leucocephala con 10 000 mgkg–1 de HTP se encontraron efectos negativos de sólo 7 %.
La CE50 para L. leucocephala se observó en suelo con 80 000 mgkg–1 de HTP, mientras que para C. incana este parámetro fue obtenido a partir de 25 000 mgkg–1 de HTP. En plántulas de L. leucocephala se encontró la CNOE con 10 000 mgkg–1, ya que su efecto fue similar al testigo; en C. incana no se encontró una CNOE durante un periodo de 30 días de exposición al petróleo, lo que muestra una sensibilidad de la especie a concentraciones altas de petróleo (Fig. 5).
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DISCUSIÓN
Los resultados de este estudio muestran efectos evidentes sobre la altura y la longitud de la raíz, lo que condujo a una menor acumulación de biomasa en ambas especies. Estos resultados son similares a los encontrados por Chaîneau et al. (1997, 2003), Issoufi et al. (2006) y Reynoso–Cuevas et al. (2008). Los efectos provocados por exposiciones agudas y generalizadas pueden ocasionar problemas de gran magnitud y desequilibrios en el ecosistema (Labud et al. 2007).
Durante el desarrollo metodológico de los bioensayos, la escarificación de las semillas fue una estrategia adecuada: al retirar los tegumentos impermeables se eliminó una barrera física para la germinación (Antoniolli et al. 1993, Carreras et al. 2001), lo que permite concluir que las respuestas observadas fueron resultado de las concentraciones de HTP en el sustrato.
Por otra parte, se encontró que la emergencia de ambas especies se retrasó cinco días con altas concentraciones de HTP. Esto puede deberse a que la capa hidrofóbica formada por el petróleo disminuye la retención de agua hasta en 50 % respecto a suelos no contaminados (Li et al. 1997, Sawatsky y Li 1997) y afecta la primera etapa de la germinación (Ross y Salisbury 2000), que consiste en la hidratación de proteínas y otros coloides e inicia la activación de las enzimas que aumentan el metabolismo, la elongación de las células de la radícula y la emergencia de la plántula. Resultados similares fueron reportados por Quiñones et al. (2003) en dos variedades de maíz expuestas en suelo con 35 000 mgkg–1 de petróleo. Otros autores también encontraron disminución e inhibición de la germinación en diferentes especies (Dorn y Salanitro 2000, Chaîneau et al. 2003, Besalatpour et al. 2008,Kisic et al. 2009).
Las plántulas de C. incana fueron más sensibles a los HTP que aquellas de L. leucocephala, a pesar de que las primeras fueron expuestas a menores concentraciones. Esto indica que esta última especie presenta una tolerancia espontánea al petróleo en el suelo. Por otra parte, las semillas de L. leucocephala son de mayor tamaño que las de C. incana y numerosos estudios muestran que existe un efecto protector relacionado al tamaño de la semilla (Dolan 1984). Leishman et al. (2000) mencionan que el tamaño de la semilla es una característica evolutiva. Algunos estudios señalan que la germinación puede ser afectada por las fracciones volátiles de los hidrocarburos, las cuales penetran y dañan el embrión de las semillas, disminuyendo la germinación hasta en 70 % (Labud et al. 2007), lo que finalmente afecta la emergencia (Hou et al. 1999). Al respecto, Chaîneau et al. (1997) afirman que la fracción ligera del petróleo (naftas) es veinte veces más tóxica que la fracción pesada. Sin embargo, estudios realizados por Rivera–Cruz y Trujillo–Narcia (2004) mencionan que Mimosa pigra y dos especies de Cyperus aumentaron la germinación en 200 % por efecto del petróleo en el suelo. Bossert y Bartha (1985) y Salanitro et al. (1997) señalan que ciertas fracciones del petróleo pueden funcionar como fitohormonas promotoras de la germinación.
La fitotoxicidad observada en plántulas de L.leucocephala y C. incana incrementó con las concentraciones de petróleo en el sustrato; sin embargo, cada especie mostró diferente sensibilidad. Este efecto puede deberse a que las plántulas de L. leucocephala tienen cotiledones más grandes y, por tanto, mayor cantidad de reservas que le permiten a la plántula mantenerse independiente de su medio durante un periodo mayor. Al respecto, Hampton y Coolbear (1990) mencionan que las diferencias en el vigor de las plántulas está asociado principalmente a la cantidad de reservas y eficiencia en el metabolismo, lo que podría representar una condición ventajosa para las especies con cotiledones de mayor tamaño. Por otra parte, los cotiledones de las leguminosas tienen una reserva importante de proteínas que se metaboliza durante el desarrollo de las plántulas (Chrispeels et al. 1976) para proveer al organismo en crecimiento de aminoácidos y energía antes del inicio de la fotosíntesis; si se presentan alteraciones en este proceso, el crecimiento posterior de la plántula será afectado.
Las dos especies en estudio evidenciaron disminución de la altura y longitud radicular de las plántulas por el efecto del petróleo en el suelo. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Chaîneau et al. (1997), quienes explican que la inhibición del crecimiento de las plantas muestra relación directa con el aumento de la concentración de hidrocarburos. Quiñones et al. (2003) afirman que concentraciones altas de hidrocarburos impiden la absorción de agua y nutrimentos debido a la formación de una capa hidrofóbica sobre las raíces. Los resultados obtenidos confirman que el mayor daño ocurre sobre la biomasa radicular debido al contacto con el petróleo. Kapustka y Reporter (1998) encontraron que concentraciones altas de hidrocarburos ocasionan daños severos e inhiben el rebrote de meristemos, disminuyen la elongación radicular y el crecimiento e impiden la difusión del oxígeno celular debido a las condiciones anóxicas del suelo (Rentz et al. 2003). Lo anterior coincide con Reynoso–Cuevas et al. (2008), quienes identificaron disminución de la longitud radicular a medida que aumenta la concentración del hidrocarburo. Este efecto puede atribuirse a que el petróleo forma una capa que limita la absorción de agua y nutrimentos por la raíz (Quiñones et al. 2003), lo cual puede afectar el posterior desarrollo y fructificación. Al respecto, estudios de fructificación en maíz muestran disminución de la viabilidad de la semilla (Ogboghodo et al. 2004) y reducción de la composición química (carbohidratos y proteínas) de las semillas (Agbogidi et al. 2007).
]]>CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en los ensayos con L. leucocephala y C. incana muestran que los HTP en el suelo desencadenan varios daños fisiológicos sobre las plantas expuestas a altas concentraciones, entre ellos el retraso y disminución de las tasas de emergencia. Esto podría reducir la presencia de las especies en ecosistemas cuyo suelo sea contaminado con petróleo crudo.
El índice relativo de impacto fisiológico (IRIF) permite medir los efectos de los tratamientos sobre las variables altura, longitud de la raíz y acumulación de MS en plántulas, y compararlos con su variable correspondiente en el testigo.
Los IRIF indican que las dos especies estudiadas disminuyeron de manera significativa su producción de MS en concentraciones mayores a 20 000 mgkg–1 de HTP, lo cual se expresó en menor producción de hojas, tallos y biomasa radicular respecto al testigo. Los resultados confirman que el daño principal ocurre sobre la radícula al entrar en contacto directo con el petróleo, lo cual afecta el posterior desarrollo de la planta.
Los IIF permitieron determinar que la CE50 en L. leucocephala,se presenta con 80 000 mgkg–1 de HTP, mientras que en C. incana este parámetro fue observado a partir de 25 000 mgkg–1 de HTP.
Los IIF permitieron determinar la CNEO en plántulas de L. leucocephala, quese observó con 10 000 mgkg–1 y representa una alta tolerancia a los HTP. En C. incana no se observó la CNEO durante los 30 días que duraron los ensayos, lo que muestra alta sensibilidad de la especie.
El índice de impacto fitotóxico (IIF) generado en este estudio es útil para integrar y ponderar los daños causados en plantas que crecen en presencia de petróleo en el suelo; proporciona el valor global de los efectos acumulados sobre los organismos estudiados y los expresa como porcentaje de daño respecto a un testigo sin daño. El IIF representa de manera numérica el impacto que producen los hidrocarburos sobre el crecimiento de las plántulas, con confiabilidad estadística y alta correspondencia con los efectos observados visualmente.
AGRADECIMIENTOS
]]> El primer autor agradece al CONACyT por la beca otorgada para realizar los estudios de posgrado, a la Dra. Luz del Carmen Lagunes Espinosa por su apoyo en el Comité Académico del Campus Tabasco y un agradecimiento especial a la Dra. Eustolia García López y Carlos Almeida por su ayuda para la identificación taxonómica de las especies utilizadas en el presente trabajo.
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