Conservación de vainilla (Vanilla planifolia Jacks.) bajo condiciones de lento crecimiento in vitro
In vitro conservation of vanilla (Vanilla planifolia Jacks.) under slow growth conditions
Jericó J. Bello-Bello1, Giovanna G. García-García2 y Lourdes Iglesias-Andreu2*
1 Campus Córdoba, Colegio de Postgraduados. Km 348 carr. federal Córdoba-Veracruz, Congregación Manuel León. 94946, Municipio de Amatlán de los Reyes, Veracruz, México.
]]> 2 Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Campus para la Cultura, las Artes y el Deporte, Universidad Veracruzana. Av. de las Culturas Veracruzanas No. 101, Col. Emiliano Zapata. 91090, Xalapa, Veracruz, México. *Autor para correspondencia: xliglesias@gmail.com
Recibido: 27 de Junio del 2013
Aceptado: 26 de Enero del 2015
RESUMEN
En México, la vainilla (Vanilla planifolia Jacks.) es considerada una especie endémica sujeta a protección especial debido a las severas afectaciones que ha sufrido su hábitat natural. En atención a esta problemática, es importante emprender programas para el rescate y conservación de este valioso recurso genético. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de cuatro concentraciones (0, 10, 20 y 30 g L-1) de dos agentes osmóticos: manitol y polietilenglicol (PEG), y cuatro concentraciones (0, 1, 2 y 3 mg L-1) de dos inhibidores del crecimiento vegetal: ácido abscísico (ABA) y paclobutrazol (PAC), sobre la supervivencia y crecimiento in vitro de plantas de V. planifolia. En todos los tratamientos se utilizaron brotes de 0.5 cm de altura regenerados in vitro. Estos brotes fueron cultivados en medio de cultivo (MS). A los 180 d de cultivo se evaluó porcentaje de supervivencia, longitud de la planta, número de hojas, número y longitud de raíces. Los cultivos in vitro mostraron valores menores en las variables evaluadas de crecimiento, cuando fueron incrementadas las concentraciones de los agentes osmóticos e inhibidores en el medio de cultivo. Los tratamientos con PAC mantuvieron 100 % de supervivencia de los brotes. Sin embargo, este compuesto provocó la presencia de anormalidades en la parte apical y radical de las plántulas in vitro. Respecto al ABA, al utilizar 3 mg L-1 los brotes mostraron valores menores en todas las variables evaluadas y 90% de supervivencia. Estos resultados permitieron establecer un método de conservación in vitro a mediano plazo de V. planifolia que prolonga el periodo entre subcultivos cada 180 d, sin afectar la viabilidad y fenotipo de las plantas.
Palabras clave: Vanilla planifolia, ácido abscísico, crecimiento mínimo, manitol, paclobutrazol, polietileneglicol.
ABSTRACT
]]> In México, vanilla (Vanilla planifolia Jacks.) is considered an endemic species that requires special protection due to severe changes in its natural habitat. Thus, development of conservations programs for rescuing this genetic resource is important. This study evaluated the effect of four concentrations (0, 10, 20 y 30 g L-1) of two osmotic agents: mannitol and polyethylene glycol (PEG); and four concentrations (0, 1, 2 y 3 mg L-1) of plant growth inhibitors: abscisic acid (ABA) and paclobutrazol (PAC); on survival and in-vitro growth of V. planifolia plants. In-vitro regenerated shoots, 0.5 cm tall, were used for all treatments. These shoots were grown on MS culture medium. Survival percentage, plant height, leaf number, root number and root length were recorded after 180 d in culture. Results showed a reduction in all response variables when osmotic agent concentrations increased. PAC treatments maintained 100 % survival; however, this compound affected the in-vitro phenotype of plantlets. Instead, ABA at 3 mg L-1 caused a reduction in all variables, except survival percentage, which was 90 %. These results provide an in-vitro conservation method for V. planifolia, that extends lapses between subcultures to 180 d, without affecting their viability and normal phenotype.Key words: Vanilla planifolia, abscisic acid, mannitol, paclobutrazol, polyethylene glycol, slow growth.
INTRODUCIÓN
La vainilla (Vanilla planifolia Jacks) es una orquídea nativa de las selvas tropicales del sureste de México y América Central (Soto-Arenas y Cribb, 2010; Salazar-Rojas et al., 2012). De ella se obtiene la vainillina, sustancia considerada como el saborizante más popular del mundo (Bory et al., 2008; Greule et al., 2010). V. planifolia se encuentra enlistada en la categoría de alto grado de erosión genética (FAO, 1995). En 2009, el Instituto Mexicano de la Propiedad Industrial (IMPI) otorgó la denominación de origen: "Vainilla de Papantla", para su protección.
De acuerdo con la norma NOM-059-SEMARNAT-2010, en México esta especie se encuentra en riesgo, sujeta a protección especial. Para atender esta problemática, es importante emprender acciones para el rescate y conservación de este valioso recurso genético. De acuerdo con Pence et al. (2002), los sistemas de conservación in vitro constituyen una herramienta económica para la conservación de los recursos fitogenéticos a mediano y largo plazo y, actualmente, son una alternativa viable a los sistemas tradicionales de conservación de germoplasma en huertos clonales, jardines botánicos o bancos de semillas.
Uno de los métodos más empleados para la conservación in vitro de algunas especies de importancia agrícola como la vainilla, consiste en la reducción del crecimiento de las células o tejidos, con el objetivo de prolongar los periodos entre subcultivos y disminuir los costos inherentes a la mano de obra y reactivos necesarios para la conservación de germoplasma. Para ello se emplean comúnmente reguladores osmóticos como manitol y sorbitol (Montalvo-Peniche et al., 2007; Hassan et al., 2014). Estos compuestos contribuyen a reducir el potencial osmótico del medio de cultivo y, por ende, la disponibilidad de agua para los tejidos (Montalvo-Peniche et al., 2007). Debido a sus propiedades como agente osmótico no penetrante, el polietilenglicol (PEG) puede ser un compuesto utilizado en los programas de conservación in vitro (Srivastava et al., 2013).
Otra alternativa para reducir la tasa de crecimiento es el uso de inhibidores del crecimiento como el ácido abscísico (ABA) (Pence et al., 2002; Sarasan et al., 2006; Barrueto y Carvalho, 2008) y el paclobutrazol (PAC) (Ziv, 2000). Este último compuesto perteneciente al grupo de los triazoles, es transportado por el xilema y puede ser absorbido por las hojas, tallos o raíces, y tiene como acción principal inhibir la síntesis del ácido giberélico por lo cual reduce la elongación celular (Jankiewicz, 2003). Además, el PAC ha sido utilizado en cultivo de tejidos vegetales dado el efecto positivo que ejerce en la inducción de los procesos de morfogénesis in vitro (Lorenzo et al., 1998; Ziv, 2000).
Métodos de crecimiento mínimo y crioconservación han sido reportados en Vanilla spp. por diferentes autores (Divakaran et al., 2006; González-Arnao et al., 2009; Divakaran y Babu, 2009). Sin embargo, a la fecha, no existen estudios comparativos sobre el efecto de osmorreguladores e inhibidores del crecimiento durante la conservación in vitro de esta especie.
El Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA) de la Universidad Veracruzana, ha establecido 14 "accesiones" in vitro que incluyen colectas de los estados de Veracruz, Oaxaca, Puebla y Quintana Roo, las cuales requieren constantes subcultivos para su conservación. Por ello, el objetivo de este estudio fue establecer las condiciones de cultivo para la conservación in vitro a mediano plazo de germoplasma de vainilla a través de un estudio comparativo entre osmorreguladores (manitol y PEG) e inhibidores del crecimiento vegetal (ABA y PAC).
]]>MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se emplearon brotes obtenidos in vitro de vainilla (Vanilla planifolia Jacks Andrews morfotipo Mansa) de 0.5 cm de altura provenientes de la región del Totonacapan, Veracruz, México. Estos brotes se generaron después de tres subcultivos (cada 45 d) de yemas axilares (0.3-0.5 cm) en medio de multiplicación MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 2 mg L-1 de BAP (bencilamino purina, Sigma®), de acuerdo con la metodología propuesta por Lee-Espinoza et al. (2008).
Efecto de agentes osmóticos e inhibidores de crecimiento sobre la tasa de crecimiento in vitro
Se evaluó el efecto de diferentes concentraciones (0, 10, 20 y 30 g L-1) de dos agentes osmóticos: manitol y polieti-lenglicol PM-6000 (Sigma®) y diferentes concentraciones (0, 1, 2 y 3 mg L-1) de dos inhibidores del crecimiento vegetal: ácido abscísico (ABA, Sigma®) y paclobutrazol (PAC, Syngenta®) para desarrollar una alternativa de conservación in vitro por lento crecimiento in vitro de V. planifolia. Para ello se utilizaron tubos de ensaye de 22 x 220 mm con tapa de polipropileno (MOLLER®), que contenían 15 mL de medio MS y 0.22 % (w/v) de Gelrite™ (Sigma®) como agente gelificante.
El pH de los medios de cultivo se ajustó a 5.8 con NaOH 0.5 N y se esterilizaron durante 15 min en autoclave (FE-299 Felisa®, México) a 1.5 kg cm-2 de presión y 120 °C. Los recipientes de cultivo, con un brote cada uno, así como el tratamiento testigo (sin agentes osmóticos e inhibidores del crecimiento) desarrollados en medio MS se incubaron a 24 ± 2 oC y se mantuvieron bajo lámparas de luz fluorescente Philips® (40-50 (imol m-2 s-1) bajo un fotoperiodo de 16 h luz. Transcurridos 180 d de incubación se evaluó el porcentaje de supervivencia, longitud de planta, número de hojas y raíces de los brotes cultivados in vitro.
Enraizamiento y aclimatación de las vitroplantas
]]> Los brotes sobrevivientes fueron trasferidos a medio MS adicionado con 3 mg L-1 de ácido indolacético (AIA) para su enraizamiento. Para su aclimatación los brotes enraizados in vitro con una altura de entre 5-10 cm fueron enjuagados con agua corriente y sembrados en charolas de 50 x 30 x 5 cm, que contenían sustrato estéril de musgo turboso y agrolita (1:1), bajo condiciones de invernadero. Se aplicaron riegos con agua corriente tres veces por semana y la humedad relativa se mantuvo entre el 70 y 80 %, y con sombra de 50 %.Cuando las plantas alcanzaron 30 cm de altura, éstas se transfirieron a contenedores individuales con una mezcla de musgo turboso, agrolita y composta (1:1:1) como sustrato, y se aplicó fungicida (Tecto60®, 1 g L-1) y fertilización foliar (Fertiplus®) una vez por semana durante un mes. Finalmente, las plántulas fueron trasferidas a campo bajo malla sombra.
Análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar, con los tratamientos que se describen en el Cuadro 1, y se usaron 10 explantes por tratamiento. Los experimentos se realizaron por triplicado. Para lograr que las variables cumplieran con los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza, previo al análisis de varianza (ANDEVA) fue necesaria la transformación de valores (√ (X +1)). Los datos se procesaron utilizando el paquete estadístico SPSS® v. 11.5 para Windows y comparación de medias mediante la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los dos osmorreguladores de crecimiento utilizados en este estudio ejercieron un efecto negativo sobre las variables de supervivencia y crecimiento evaluadas. Este efecto se acentuó a medida que fueron incrementadas las concentraciones de estos compuestos (Cuadro 1).
Los tratamientos con 10, 20 y 30 g L-1 de manitol mostraron valores de supervivencia de 90, 70 y 53 %, respectivamente. Las variables longitud de brotes, número de hojas, y número y longitud de las raíces, mostraron diferencias significativas en las concentraciones de 20 y 30 g L-1 de manitol (Cuadro 1) (Figura 1a). Un comportamiento similar fue observado en los tratamientos con PEG. Sin embargo, los porcentajes de supervivencia obtenidos con este osmorregulador no fueron más altos que con manitol, pues fueron de 83, 70 y 43 % para los tratamientos de 10, 20 y 30 g L-1, respectivamente. El tratamiento con 30 g L-1 de PEG inhibió la altura (Figura 1b) y supervivencia de las plantas.
En relación con los efectos de manitol sobre la conservación in vitro de germoplasma, Sarkar y Naik (1998) en papa ( Solanum tuberosum) reportaron que 20 y 40 g L-1 de este compuesto no afectaron la supervivencia del germoplasma in vitro. En este mismo cultivo, Fortes y Scherwinski-Pereira (2001) mencionan que el manitol puede llegar a causar una reducción del crecimiento y menor número de brotes por explante. Por su parte, Skalova et al. (2012) durante la conservación in vitro de yacón (Smallanthus sonchifolius), encontraron que las concentraciones más adecuadas para la conservación in vitro de esta especie fueron de 10 y 20 g L-1.
]]> Al respecto, se ha indicado que concentraciones elevadas de manitol pueden ser tóxicas para algunas especies vegetales y pueden llegar a ocasionar la muerte de la planta. Sin embargo, la concentración letal parece estar en función de cada especie (Loureiro da Silva y Scherwinski-Pereira, 2001). Recientemente, al comparar el efecto de osmorreguladores e inhibidores del crecimiento en regaliz (Glycyrrhiza glabra), Srivastava et al. (2013) reportaron que fue necesario aplicar 20 g L-1 de manitol para disminuir el crecimiento in vitro, y que la combinación de 0.1, 0.5 y 1 g L-1 de ABA, ancimidol (ANC) y PEG, respectivamente, disminuyó también el crecimiento en esta especie.Al evaluar el efecto de los inhibidores del crecimiento PAC y ABA, se pudo observar que en todos los tratamientos con PAC se logró 100 % de supervivencia de los brotes. Sin embargo, se detectaron diferencias significativas entre la longitud de los brotes, el número de hojas y la longitud de las raíces, a partir de los tratamientos que contenían 2 mg L_1 de ABA y PAC. La inhibición del crecimiento de los brotes en los tratamientos con PAC trajo consigo un efecto negativo en el fenotipo de las plántulas, denotado por anormalidades en la parte apical y radical que presentaron engrosamiento en ambas estructuras. Cabe resaltar que los tratamientos con este inhibidor afectaron el crecimiento apical y promovieron el alargamiento de raíces in vitro (Cuadro 1) (Figura 1c).
El uso de PAC ha sido reportado en el CTV para inducir procesos de morfogénesis in vitro. Al respecto, Lorenzo et al. (1998) establecieron un protocolo para la formación de brotes de caña de azúcar (Saccharum spp.) y observaron que la adición de 1 mg L_1 de PAC redujo la longitud de brotes y promovió la tasa de multiplicación in vitro. En gladiola [Gladiolus spp.), Nagaraju et al. (2002) lograron aumentar la formación de cormos en presencia de 10 mg L_1 de PAC. De igual forma, Chen et al. (2005) en lilis (Hemerocallis spp.), aumentaron la eficiencia de regeneración in vitro al adicionar 2.5 mg L_1 de PAC.
Por otro lado, se ha reportado que las plantas provenientes de sistemas de regeneración in vitro en el cual se emplean tratamientos con este compuesto presentan ventajas adaptativas a condiciones desfavorables de temperaturas extremas, sequía, salinidad y ataque por patógeno (Jaleel et al., 2007). Aunque en ninguno de los tratamientos de PAC aplicados en el presente estudio se produjo la muerte de los brotes de vainilla, la presencia de fenotipos anormales durante el desarrollo de las plantas in vitro sugiere que este compuesto no debe ser empleado para la conservación in vitro de germoplasma de V. planifolia, al menos a las dosis evaluadas.
Se constató que los tratamientos que contenían 1, 2 y 3 mg L_1 de ABA mostraron los mayores porcentajes de supervivencia de los brotes (100, 90 y 90 %, respectivamente). Las variables longitud de brotes, número de hojas, y número y longitud de las raíces mostraron diferencias significativas entre los tratamientos. No se apreciaron diferencias en los porcentajes de supervivencia de los brotes cuando se emplearon concentraciones de 2 y 3 mg L_1 de ABA. Sin embargo, los brotes del tratamiento con 3 mg L_1 de este inhibidor afectaron significativamente el crecimiento de las plantas, dados los menores valores que presentaron las variables longitud de las plantas, número de hojas y longitud de la raíz (Cuadro 1) (Figura 1d).
Al evaluar el efecto de diferentes concentraciones de ABA sobre la conservación in vitro de mangostán (Garcinia mangostana), Keatmetha et al. (2006) mostraron que 1 mg L-1 de este inhibidor mantenía un efecto inhibitorio del crecimiento sin afectación de la supervivencia ni el número de brotes por explante. Barrueto y Carvalho (2008), al evaluar el efecto de ABA sobre la conservación in vitro de la yuca (Manihot esculenta Grantz), observaron que el número y la longitud de los brotes se reducían a concentraciones de 5 y 8 mg L_1. Se ha indicado que el ABA actúa endógenamente como un inhibidor del crecimiento en diversos procesos celulares de las plantas, debido a su efecto fisiológico en el cierre de estomas y en la regulación endógena de la síntesis de auxinas, citocininas y giberelinas (Swamy y Smith, 2005).
Una aplicación relativamente reciente de ABA es su efecto para retardar el crecimiento vegetal en los sistemas de conservación in vitro (Pence et al. 2002). Según Loureiro da Silva y Scherwinski-Pereira (2011), las altas concentraciones de ABA (3 mg L_1) pueden llegar a afectar la supervivencia, longitud de brotes y numero de brotes por explante, en especies como Piper aduncum y Piper hispidinervum. Estos autores encontraron que una concentración de 2 mg L_1 de ABA mantuvo 100 % de supervivencia, lo que sugiere que esta concentración es adecuada para la inducción de la dormancia in vitro de estas especies.
En este estudio se obtuvo 90 % de supervivencia en presencia de 3 mg L_1 de ABA a los 180 d de incubación, y mostraron 95 % de supervivencia durante la etapa de aclimatación bajo invernadero. Las vitroplántulas aclimatadas tuvieron un aspecto vigoroso (Figura 2a). Cuando éstas alcanzaron 50 cm de longitud fueron transferidas a campo bajo malla sombra (Figura 2b).
En V. planifolia se han establecido diversos protocolos de conservación in vitro. Divakaran et al. (2006) lograron conservar brotes in vitro con medio de cultivo MS suplementado con 15 g L1 de sacarosa y manitol. En ese estudio se obtuvo una longitud promedio de 8.2 cm para cada brote y 90 % de supervivencia a los 12 meses de cultivo. Los resultados obtenidos permitieron alcanzar un mismo porcentaje de supervivencia, y se logró además reducir la longitud promedio de los brotes a sólo 1.3 cm a los 6 meses de cultivo. González-Arnao et al. (2009) desarrollaron un sistema de crioconservación de ápices de vainilla; sin embargo, en dicho estudio apenas lograron obtener 30 % de supervivencia y 10 % de regeneración a planta, lo cual muestra que aún se requieren trabajos encaminados a la optimización de este sistema para que resulte efectivo para la conservación a largo plazo de estos recursos genéticos.
Un aspecto importante que se debe tener en cuenta cuando se establece un protocolo de conservación in vitro por lento crecimiento, es mantener durante este proceso un tamaño reducido de las plántulas sin que se afecte su viabilidad y sobrevivencia, para así reducir el número de subcultivos y costos de mantenimiento del germoplasma conservado. El método de conservación por lento crecimiento del germoplasma in vitro conlleva un trabajo laborioso, debido al alto número de subcultivos que deben efectuarse así como los altos costos de electricidad que implica cuando se utilizan cámaras frigoríficas para reducir la temperatura. La crioconservación requiere además un suministro constante de nitrógeno líquido cuyo uso en laboratorios comerciales no resulta rentable.
]]> Por ello, el presente protocolo que sólo contempla la aplicación de 3 mg L-1 de ABA al medio MS puede resultar un método más eficiente de conservación por lento crecimiento de germoplasma de V. planifolia, ya que con poco espacio, pocos subcultivos y con mínimas cantidades de labores de mantenimiento se podría mantener, bajo condiciones estériles en un ambiente controlado (libres de enfermedades y de fluctuaciones climáticas), el germoplasma de vainilla colectado, lo cual contribuiría a facilitar los trabajos de micropropagación e intercambio de germoplasma de este valioso cultivo.
CONCLUSIONES
Se estableció un método para la conservación in vitro de V. planifolia basado en la adición de ABA (3 mg L-1). Este compuesto permite mantener un banco de germoplasma in vitro con 90 % de viabilidad con subcultivos cada 180 d. Las plántulas conservadas in vitro pueden ser transferidas a medio de multiplicación para obtener una fuente de material vegetal requerido para su micropropagación, intercambio de germoplasma o programas de mejoramiento genético.
AGRADECIMIENTOS
Al Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) por el financiamiento otorgado al proyecto: "Bases Biotecnológicas para el Mejoramiento Genético de Vanilla planifolia", que integra el cuerpo académico UV-CA-234, dentro de la Red: "Conservación, Manejo y Mejoramiento Genético de Plantas".
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