Técnicas moleculares clásicas para la diferenciación de formas especiales de Fusarium oxysporum

Classical molecular techniques for differentiation of special forms of Fusarium oxysporium

Iobana Alanis-Martínez¹, Carmen Medina-Mendoza², Nahum Marbán-Mendoza¹ y Ernestina Valadez-Moctezuma²*

¹ Departamento de Parasitología Agrícola.

*Autor para correspondencia
Ernestina Valadez-Moctezuma evaladez@correo.chapingo.mx

Recibido: 27/02/ 2014.
Aceptado: 28/10/2015.

Resumen

La caracterización y diferenciación de formas especiales de Fusarium oxysporum mediante análisis de polimorfismos genéticos es más apropiado que solo considerar caracteres morfológicos o fisiológicos. Actualmente se han desarrollado técnicas moleculares sofisticadas para estimar variación genética, diferenciar o identificar microorganismos, tales como las basadas en secuenciación de segunda generación, pero éstas aún tienen altos costos y no son accesibles para muchos laboratorios que requieren diagnosticar o diferenciar a un determinado fitopatógeno. En este trabajo se compararon tres técnicas moleculares clásicas: RAPD, MP-PCR y RAMPnr con la finalidad de diferenciar aislamientos de F. oxysporum f. sp. ciceris, F. oxysporum f. sp. lycopersici, F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici y F. oxysporum f. sp coffeae. Estas técnicas detectaron polimorfismos entre las formas especiales de Fusarium e incluso entre los genotipos de F. o. f. sp. lycopersici. Los agrupamientos representados en los dendrogramas, indican que F. oxysporum es muy diverso y que las formas especiales analizadas son genéticamente diferentes. Estas técnicas proporcionan un procedimiento simple, rápido y de bajo costo para la caracterización y posterior identificación rutinaria de patógenos.

Abstract

The characterization and differentiation of special forms of Fusarium oxysporum by analysis of DNA polymorphisms are more appropriate than just considering morphological or physiological characteristics. Currently, they have developed sophisticated molecular techniques to estimate genetic variation, differentiate or identify microorganisms, such as those based on second-generation sequencing, but they still have high costs and are not accessible to many laboratories that require diagnose or differentiate a particular plant pathogen. In this paper, three classical molecular techniques were compared: RAPD, MP-PCR and RAMPnr in order to differentiate isolates of F. oxysporum f. sp. ciceris, F. oxysporum f. sp. lycopersici, F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and F. oxysporum f. sp coffeae. These techniques detected polymorphisms between the special forms of Fusarium and even between genotypes of F. o f. sp. lycopersici. The groups represented in dendrograms indicate that F. oxysporum is very diverse and that special forms analyzed are genetically different. These techniques provide a simple, fast and inexpensive routine procedure for the characterization and subsequent pathogen's identification.

Keywords: MP-PCR, RAMPnr, RAPD, pathogen, polymorphism.

Introducción

Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr es un complejo de especies económicamente importante, porque causa daños a una amplia variedad de cultivos agrícolas (Baayen et al., 2000). Se han descrito más de 150 formas especiales que se caracterizan por presentar propiedades fisiológicas que le otorgan la especialización patogénica a determinadas especies, géneros o grupos de plantas (Arbeláez, 2000; Baayen et al., 2000); por lo que se ha asumido que están altamente relacionadas y presentan morfología similar aún cuando pertenecen a diferentes grupos biológicos (Kistler, 1997).

Los marcadores moleculares han sido eficientes en el estudio de la diversidad genética de fitopatógenos (Baysal, 2013) y en la identificación de formas especiales (Baysal, 2009). Algunas técnicas utilizadas para determinar la diversidad genética del género Fusarium son RAPD (Random Amplified Polymorphyc DNA), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Bentley, 1998), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats) y actualmente la secuenciación de porciones o genes completos (Wulff et al., 2010; Geiser et al., 2004; Kristensen et al., 2005). La técnica RAPD ha sido empleada para el estudio de formas especiales, razas y aislamientos con diferentes patotipos de Fusarium oxysporum (Kelly et al., 1998, Luna et al., 2004), ya que reduce el tiempo necesario para la caracterización y proveé información genética. La tecnica MP-PCR (Microsatellite Primed-PCR) y RAMPnr (non radioactive Random Amplified Microsatellite Polymorphism) fueron utilizadas por Valadez et al. (2005) como una opción para la detección de perfiles de ADN más abundantes e informativos, ofreciendo mayor estabilidad y cantidad de huellas. Actualmente existen técnicas sofisticadas basadas en secuenciación de segunda generación para el estudio de la diversidad genética de Fusarium y de otros organismos, pero éstas aún tienen altos costos. Es por ello que este trabajo tuvo como objetivo utilizar técnicas moleculares clásicas para diferenciar de forma rápida cuatro formas especiales de Fusarium oxysporum: f. sp. ciceris, f. sp. radicis-lycopersici, f. sp. lycopersici y f. sp. coffeae, los cuales pertenecen a un género de hongos fitopatógenos que morfológicamente no es posible distinguir. El conocimiento de las diferencias entre este tipo de patógenos es importante para su adecuado control, además de que estas técnicas consumen poco tiempo, proporcionan resultados confiables y son de bajo costo.

Aislamientos

Se emplearon cuatro aislamientos por duplicado de formas especiales de Fusarium oxysporum: dos cepas (f. sp. lycopersici y f. sp. radicis-lycopersici.) procedentes de la colección de hongos fitopatógenos del Colegio de Postgraduados (Montecillos), Estado de México. La f. sp. ciceris se aisló de plantas de garbanzo con síntomas de marchitez de la zona del Bajío y la f. sp. coffeae se aisló de plantas de café con corchosis en la raíz, procedentes del estado de Veracruz. Los hongos se cultivaron en medio PDA (150g de papa, 10g de dextrosa, 18g de agar y 4 gotas de ácido láctico (25%, MERCK); se desarrollaron cultivos monósporicos, los cuales fueron cultivados en medio líquido Czapeck-Dox (30g de sacarosa, 2g NaNO₃, 0.1g K₂HPO₄, 0.5g MgS0₄ 7H₂O, 0.5g KCL, 0.01g FeSO₄ 7H₂O) para extracción de ADN.

Extracción de ADN

Se utilizó el método reportado por Kelly et al. (1994). La calidad de la molécula se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa 0.8% y se cuantificó mediante espectrofotometría. Por cada forma especial se emplearon dos genotipos procedentes del mismo aislamiento, pero de conidio diferente: Fusarium oxysporum f. sp. coffeae A, coffeae B, ciceris A, ciceris B, radicislyco A, radicis-lyco B, lycopersici A, lycopersici B y una planta de garbanzo como grupo comparativo.

RAPD

Para el análisis de huellas aleatorias de ADN, se seleccionaron siete iniciadores de la serie C (05, 08, 09, 14, 16, 18 y 19) de la Casa comercial Carl Roth GMBH. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25 μL con 80 ng de DNA, 20 pmoles de iniciador, amortiguador de reacción 1X, 200 μM de dNTPs, 1.5 mM de MgCl₂ y 2U Taq ADN polimerasa. La amplificación se llevó a cabo con las siguientes condiciones: 94 °C, 1min, 38 ciclos [94 °C, 30 s; 35 °C, 30 s; 72 °C , 1.5 min] y 72 °C, 2.5 min de extensión final en un termociclador Perkin Elmer 480.

Para esta técnica se emplearon cinco iniciadores complementarios a microsatélite: [GGAT]₄, [GACA]₄, [GATA]₄, [CT]₈ y [CA]₈ de Gibco-BRL. La mezcla de reacción de 25 μL contenía 50 ng de ADN; 20 pg del iniciador, amortiguador de reacción 1X, 200 μM dNTPs, 3 mM MgCl y 1.5 U Taq ADN polimerasa. Las condiciones de termociclaje fueron las siguientes: 93 °C, 1 min; 40 ciclos [93 °C, 2 s; 40 °C, 1 min para [GATA]₄ y 48 °C 1 min para [GGAT]₄, [GACA]₄, [CT]₈ y [CA]₈); 72 °C, 20 s] y 72 °C por 6 min de extensión final.

RAMPnr

Esta técnica consiste en la combinación de dos tipos de iniciadores en cada reacción, uno para microsatélites y otro aleatorio, ambos sin marcaje (Valadez et al., 2005). Se utilizaron seis pares de iniciadores: [GACA]₄+C05; [GACA]₄+C19; [GATA]₄+C05; [GATA]₄+C19; [CT]₈+C05 y (CT)₈+C19. El volumen final de reacción también fue de 25 μL y contenía 80 ng de ADN, 10 pg de cada iniciador, amortiguador de reacción 1X, 200 μM dNTPs, 3 mM MgCl₂ y 1.5 U Taq ADN polimerasa. Los productos de amplificación para las tres técnicas utilizadas se separaron en geles de agarosa Ultra PureTM de GIBCO BRL 1.2, 1.4 y 2 % respectivamente, se tiñeron con bromuro de etidio 10 min y se documentaron con la cámara Kodak Digital Science 1D 2.0.

Análisis estadístico

Las huellas de ADN obtenidas se codificaron en una matriz binaria, a partir de la cual se construyó una matriz de similitud con el programa NTSyS pc.2.0 y el coeficiente de similitud Dice. Para el análisis de conglomerados se utilizó el método del promedio aritmético de pares no ponderados (UPGMA). Se obtuvieron los valores de correlación cofenética y por último se utilizó el programa WinBoot para obtener los valores del Boos-traping con 5000 replicaciones. En el análisis se incluyó al garbanzo con el fin de contrastar los agrupamientos.

Resultados

Las formas especiales de F. oxysporum cultivadas en medio PDA desarrollaron abundante micelio de distintas tonalidades que van desde violeta tenue hasta rojo intenso, lo cual ha sido reportado previamente por Seifert (2001). La forma especial lycopersici presentó micelio escaso a diferencia de las formas especiales restantes.

Análisis molecular

RAPD

El ADN obtenido con la técnica empleada fue de buena calidad y de cantidad adecuada para el análisis molecular propuesto. Las huellas genómicas obtenidas con los distintos iniciadores RAPDs presentaron polimorfismos entre las formas especiales y entre los genotipos de la f. sp. lycopersici (Figura 1). En el dendograma se conformaron seis grupos con un coeficiente de similitud de 0.7 (Figura 5). La técnica considera idénticos a los genotipos de la f. sp. coffeae con una confiabilidad del 100% al igual que a la f. sp. ciceris. Para en el caso de la f. sp. radicis-lycopersici, los dos aislamientos no se mantienen juntos como se esperaba; lo que sugiere contaminación en los aislamientos iniciales. El genotipo lycopersici A se relaciona con los genotipos de la f. sp. radicis-lycopersici a una distancia aproximadamente de 0.57 y confiabilidad del 99.9%. El genotipo lycopersici B se mantiene fuera del agrupamiento, relacionándose con las otras formas especiales a una distancia de 0.05 y una confiabilidad del 98.4%, lo que indica que este genotipo presenta un nivel de asociación muy bajo. El garbanzo se mantiene fuera del agrupamiento de Fusarium. El valor del coeficiente de correlación cofenética fue de r = 0.98, lo que indica muy buen ajuste.

MP-PCR

RAMPnr

Con esta técnica las huellas de ADN obtenidas fueron más abundantes y definidas con respecto a las dos técnicas anteriormente descritas. También detectaron polimorfismos entre las cuatro formas especiales y entre los genotipos de f. sp. lycopersici con los seis pares de iniciadores utilizados (Figuras 3 y 4). El dendograma se construyó con 150 datos, identificando a seis grupos con un coeficiente de 0.99 (Figura 7). Esta técnica consideró a los genotipos coffeae A-coffeae B, así como a ciceris A-ciceris B como idénticos con una confiabilidad del 100%. A los dos genotipos de la f. sp. radicis-lycopersici los relaciona a una distancia de 0.99 y confiabilidad del 100% y a su vez se relacionan con el genotipo lycopersici A a una distancia 0.66 con una confiabilidad del 82.4%. El genotipo lycopersici B se relaciona con el resto de los genotipos a una distancia de 0.08 con una confiabilidad de 97.2% lo que indica, una menor relación con el resto de las formas especiales (Figura 9). El garbanzo se mantiene fuera del agrupamiento. El valor de correlación cofenética fue de r=0.99198 que representa un buen ajuste.

Discusión

Con las técnicas moleculares utilizadas y comparadas RAPD, MP-PCR y RAMPnr, se observaron diferencias claras en los patrones de bandas de las cuatro formas especiales: F. oxysporum f. sp. coffeae, F. oxysporum f. sp. ciceris, F. oxysporum f. sp. lycopersici y F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, lo cual indica que existen diferencias genéticas. Estos resultados concuerdan con lo reportado por Vakalounakis y Fragkiadakis (1999) quienes establecieron diferencias genéticas por medio de RAPD entre las formas especiales: cucumerinum y radicis-cucumerinum.

Al comparar los agrupamientos de las tres técnicas, los resultados se muestran similares, pero los genotipos lycopersici se mantienen separados entre si, lo que sugiere que existe variabilidad genética entre la misma forma especial, o que posiblemente está contaminada desde su aislamiento original, que es lo más probable. También se observa la separación entre el genotipo lycopersici B y los dos genotipos de radicis-lycopersici, lo cual puede deberse a variación molecular a nivel de ADN entre estas formas especiales (Kistler et al. 1987, Kuninaga y Yokosawa 1989). Los polimorfismos detectados en este tipo de hongos indican que existen fuentes de variabilidad genética entre sí, debido a que tienen un origen polifilético (O'Donell, et al., 1998; Baayen et al., 2000). Por otro lado, el genotipo lycopersici A se agrupa con los dos genotipos de radicis-lycopersici, lo que sugiere que existen similitudes genéticas entre estas dos formas especiales, tal como lo han reportado Van Putten et al. (2003).

Los análisis con marcadores moleculares permiten identificar diferencias a nivel de ADN y en este estudio las tres técnicas lo evidenciaron sobre las cuatro formas especiales utilizadas. RAPD detectó polimorfismos entre los genotipos: coffeae, ciceris, radicis-lycopersici y lycopersici, e incluso variación entre los genotipos lycopersici; esta técnica ha sido ampliamente usada para estimación de la diversidad genética de especies y razas de Fusarium (Chandra et al., 2008). Por otra parte Paavanen et al. (1999) detectaron alta variabilidad genética en aislamientos de F. oxysporum con RAPD, además de que la resolución fue mejor comparada con isoenzimas; por otro lado, Manulis et al. (1994) indicaron que RAPD es un procedimiento simple, rápido y reproducible comparado con otras técnicas. MP-PCR también detectó polimorfismos entre las cuatro forma especiales, sin embargo, éstos no fueron lo suficientemente claros en este estudio debido a que hay presencia de barridos originados por una gran cantidad de fragmentos amplificados por la secuencia de los iniciadores utilizados, característica propia de la técnica que indica la gran cantidad de amplicones; pero que debido a su cercanía en pesos moleculares, no se aprecian en esta clase de geles. Barve et al. (2001) identificaron diferencias con este tipo de marcadores en cuatro razas de F. oxysporum f. sp. ciceris y Bogale et al. (2005) mostraron que los polimorfismos detectados son suficientes para el estudio de la diversidad genética en aislamientos de F. oxysporum.

La técnica RAMPnr detectó alta variabilidad genética a través de perfiles abundantes y mayor número de polimorfismos claramente nítidos. Según Barve et al. (2001) señalan que los marcadores basados en microsatélites son los mejores para el estudio de F. oxysporum, debido a que son marcadores versátiles particularmente útiles para el análisis de poblaciones. Por otro lado, Hancock y Simon (2005) mencionan que este tipo de marcadores son capaces de diferenciar especies altamente relacionadas y de acuerdo a Esselman et al. (1999) también detectan mayor cantidad de polimorfismos, por lo que se han utilizado ampliamente para el análisis de poblaciones de hongos (Chandra et al. 2008). El análisis filogenético hace posible la identificación de formas especiales y razas de patógenos, este tipo de comparaciones es necesario para la identificación de estos organismos, en donde las medidas de control pueden resultar poco efectivas si no se identifica correctamente al organismo causal, sobre todo cuando no existe diferencia a nivel morfológico. Las tres técnicas utilizadas fueron capaces de diferenciar de manera rápida e inequívoca a cada forma especial de Fusarium oxysporum, además de proporcionar datos con los cuales es posible diferenciar organismos de una misma especie tan compleja como es el caso de F. oxysporum.

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