Efecto del estrés osmótico in vitro en el crecimiento, patogenicidad y producción de osmolitos en Macrophomina phaseolina

Osmotic stress effect on in vitro growth, pathogenicity and osmolyte production in Macrophomina phaseolina

Niria Tijerina-Ramírez¹, Krystal Lira-Méndez², Víctor Ricardo Moreno-Medina², Juan Manuel González-Prieto², Netzahualcoyotl Mayek-Pérez^2*

¹ Centro de Bachillerato Tecnológico Industrial y de Servicios #7, Primero de Mayo y Naranjos s/n, Col Petrolera, Reynosa, Tamaulipas, 88680, México.

^*Autor para correspondencia:
Netzahualcoyotl Mayek-Pérez nmayek@ipn.mx

Recibido 17 de mayo 2013;
Aceptado 2 de mayo 2014.

Resumen

El hongo Macrophomina phaseolina causa la pudrición carbonosa en frijol (Phaseolus vulgaris) y, aunque tolera el estrés osmótico, se desconocen los mecanismos que determinan dicha tolerancia. En este trabajo se determinó in vitro el crecimiento de seis aislamientos de M. phaseolina en condiciones de NaCl variable (PDA con 0, 500 y 1000 mM); la patogenicidad en cuatro variedades de frijol (Azufrado Tapatío, BAT 477, Pinto UI-114, SEQ12) y las concentraciones de glicerol, arabitol, D-fructosa y D-glucosa en los aislamientos cultivados con 0, 250 y 500 mM de NaCl. El NaCl (500 mM) redujo el crecimiento de M. phaseolina más de 50%. Los aislamientos de Río Bravo, Tamaulipas fueron los más agresivos. La concentración de arabitol se redujo hasta 90% al incrementarse el NaCl y la del resto (glicerol, D-fructosa, D-glucosa) se incrementó. El crecimiento de M. phaseolina se asoció negativamente con la presencia de osmolitos en ausencia de NaCl pero positivamente con la concentración de D-glucosa en 500 mM de NaCl. La patogenicidad se asoció negativamente con la producción de osmolitos. El estrés osmótico indujo la síntesis de novo de osmolitos en M. phaseolina pero redujo su agresividad en frijol.

Abstract

The fungus Macrophomina phaseolina causes charcoal rot in common bean (Phaseolus vulgaris) and although it tolerates osmotic stress the mechanisms of tolerance remain unknown. In this work under in vitro conditions it was determined the growth of six M. phaseolina isolates under variable NaCl (PDA with 0, 500 and 1000 mM); pathogenicity in four bean cultivare (Azufrado Tapatío, BAT 477, Pinto UI-114, SEQ12) growing; and the concentrations of glycerol, arabitol, D-fructose and D-glucose concentrations of each fungal isolate growing under 0,250, and 500 mM NaCl. NaCl (500mM) reduced M. phaseolina growth up 50%. Isolates from Rio Bravo, Tamaulipas were the most aggressive. The growth of M. phaseolina was negatively associated with osmolyte concentrations under no-NaCl conditions but positively with D-glucose concentration under 500 mM NaCl. Pathogenicity was negatively associated with osmolyte production. Osmotic stress induced de novo synthesis of osmolytes in M. phaseolina but reduced its aggressiveness in beans.

Keywords: Phaseolus vulgaris, HPLC analysis, arabitol, fructose, glycerol, glucose, charcoal rot.

Introducción

Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid., agente causal de la pudrición carbonosa, es un hongo patógeno no específico que ataca más de 500 especies de plantas (Hernández-Delgado et al., 2011). En México, esta enfermedad se presenta en varios cultivos de interés económico como maíz (Zea mays L.), frijol (Phaseolus vulgaris L.), sorgo (Sorghum bicolor [L.] Moench) y soya [Glycine max (L.) Merr.] (Mayek-Pérez et al., 2001). La pudrición carbonosa tiene alta prevalência en el norte de México donde frecuentemente se encuentran las condiciones de sequía y altas temperaturas favorables para el desarrollo y la infección del hongo (Abawi y Pastor-Corrales, 1990).

Los hongos muestran diversas respuestas metabólicas, patrones de crecimiento y estrategias reproductivas en respuesta a las condiciones hídricas variables. La disminución del potencial osmótico reduce el crecimiento al incrementar la tasa de respiración, y la energía se utiliza para mantener la turgencia celular (Subbarao et al., 1993). El potencial hídrico (Ψ) expresa y mide el estado de energía libre del agua. El Ψ se expresa en función de sus componentes, los potenciales osmótico, de turgencia, matricial y gravitacional. El potencial osmótico (Ψο) representa la disminución de la capacidad de desplazamiento del agua y de la presencia de solutos, a medida que la concentración del soluto (número de partículas soluto por unidad volumen de la solución) aumenta, y tiene valores negativos. El Ψ y el Ψο son iguales a cero en el agua pura (Davis et al, 2000).

El Ψο es un parámetro importante en la ecología y el crecimiento de los hongos fitopatógenos (Davis et al., 2000). La reducción del potencial osmótico reduce el crecimiento y el desarrollo de hongos fitopatógenos como M. phaseolina debido al efecto observado in vitro de solutos como NaCl, KCl y sacarosa (Olaya y Abawi, 1996; Cervantes-García et al., 2003). También, el estrés osmótico provoca la acumulación de osmolitos como azúcares y polioles en F. graminearum (Ramírez et al., 2004). Concentraciones de 1000 mM de NaCl reducen significativamente la patogenicidad de M. phaseolina en frijol in vitro, así como su crecimiento (Cervantes-García et al., 2003). Los objetivos de este trabajo fueron determinar el efecto del potencial osmótico variable in vitro en el crecimiento y la patogenicidad de M. phaseolina en cuatro variedades de frijol, así como identificar los osmolitos sintetizados en presencia del NaCl.

Materiales y métodos

Aislamientos

Se colectaron plantas de frijol, maíz, sorgo y soya, con síntomas de pudrición carbonosa en localidades de los estados de Sinaloa, Veracruz y Tamaulipas. Las plantas se lavaron con agua corriente durante 2 min y los tallos se seccionaron en segmentos de aproximadamente 1 cm de longitud. Dichos tejidos se desinfestaron con NaOCl 2 % por 2 min y se enjuagaron con agua destilada estéril; el exceso de agua se retiró con papel secante estéril. Los tejidos con síntomas de la enfermedad se sembraron en medio sintético Papa-Dextrosa-Agar (PDA; MCD Lab®; Tlalnepantla, México) acidificado con 4-6 gotas de ácido láctico por litro de medio y se incubaron por 4 d a 30 °C. Porciones del crecimiento de colonias con crecimiento típico de M. phaseolina se resembraron en PDA y luego, crecimiento joven de colonias se sembró en medio Agar-Agua. Los aislamientos puros se obtuvieron al volver a crecer aislamientos a partir de punta de hifa de cada uno de los seis aislamientos de M. phaseolina (Tabla 1).

Efecto del potencial osmótico en el crecimiento in vitro de M. phaseolina

La influencia del potencial osmótico variable en el crecimiento micelial de los seis aislamientos de M. phaseolina se evaluó en medio PDA ajustado a 0,500 o 1000 mM de NaCl. Discos con micelio (0.6 mm de diámetro) de 4 d, de los diferentes aislamientos desarrollados en PDA, se colocaron en el centro de cajas Petri de 10 cm de diámetro con medio PDA ajustado a diferentes concentraciones de NaCl (Cervantes-García et al., 2003). Las cajas se colocaron en una incubadora (Fisher Scientific®, modelo 525D) por 96 h a 30 ± 1 °C en oscuridad, distribuidas en un diseño experimental completamente al azar con cuatro unidades experimentales (repeticiones). Cada unidad constó de una caja Petri equivalente a un tratamiento (combinación de un aislamiento x concentración de NaCl) en la cual se registró el diámetro de la colonia (DC, mm) cada 24 h para calcular la tasa relativa de crecimiento de la colonia (TRCC, mm d ^-1) (Mayek-Pérez et al, 1997).

La cantidad de micelio producido por los aislamientos de M. phaseolina se evaluó en medio de cultivo caldo de papa dextrosa (PDB, DIFCO®; Detroit, EUA) ajustado a 0, 500 o 1000 mM de NaCl (Cervantes-Garcia et al, 2003). De cada aislamiento, tres discos (0.6 mm de diámetro) con micelio de 4 d de desarrollo en PDA se colocaron en un tubo de plástico (50 mL capacidad) con 20 mL de PDB a diferente concentración de NaCl. Los tratamientos (aislamiento χ concentración) se aleatorizaron en un diseño experimental completamente al azar con cinco repeticiones; la unidad experimental fue un tubo de plástico. El tiempo de incubación fue de 11 d a 30 °C con agitación constante a 250 rpm en incubadora MaxQ 4000® (Bernstead/Lab-Line). La biomasa fúngica se obtuvo al pasar el cultivo por papel filtro # 1 (Whatman®) acoplado a embudos de plástico estériles por 30 min; el papel y el micelio se recuperaron y secaron a 45 °C en horno de secado modelo FX5® (Shel-Lab) por 3 d para determinar su peso seco en balanza analítica modelo Voyager® (Ohaus).

Patogenicidad de M. phaseolina en frijol

La patogenicidad de los seis aislamientos de M. phaseolina se evaluó en cuatro variedades de frijol: dos clasificadas como resistentes al hongo (BAT 477, SEQ 12) y dos como susceptibles (Azufrado Tapatío, Pinto UI-114). Las semillas de cada variedad se desinfestaron en una solución al 2% de NaOCl por 2 min, se enjuagaron con dos cambios de agua desionizada estéril, se secaron con papel secante estéril y se depositaron en cajas Petri con medio PDA y micelio de M. phaseolina con 15 d de desarrollo. Las cajas se incubaron por 5 d a 30 ± 1 °C en incubadora Fisher Scientific® modelo 525D. Los tratamientos (combinación de un aislamiento χ una variedad) se aleatorizaron con base en un diseño experimental completamente al azar con dos repeticiones y la unidad experimental de 20 semillas de cada variedad. La patogenicidad se evaluó en el quinto día en incubación con base en la escala descrita por Manici et al. (1995) y que incluye seis valores: 0 = semilla sana; 1 = decoloración de la semilla, 2 = tegumentos invadidos por micelio y microesclerocios, 3= tegumentos libres del hongo pero cotiledones infectados, 4 = tegumentos y cotiledones infectados, 5 = semilla completamente infectada, no germina y muerta.

Identificación de osmolitos sintetizados

Cada aislamiento de M. phaseolina se cultivó por 11 d en medio PDB con 0,250 o 500 mM de NaCl a 30 °C en agitación a 200 rpm. El micelio se filtró como ya se indicó antes y se lavó con agua desionizada. Luego, se pesaron 50 mg de micelio de cada aislamiento, por separado se depositaron en tubos con matriz tipo I ('perlas' de zirconio amarillas de 2 mm de diámetro y esferas de cerámica negras de 4 mm, MP Biomedicals®) para lisis de 2 mL a los que se agregó 1 mL de agua desionizada. La mezcla se sometió a lisis por 2 min en un homogenizador modelo FastPrep-24 (MP Biomedicals®) y luego se colocó en baño 'María' para hervir durante 5.5 min; las muestras se enfriaron a temperatura ambiente (25-30 °C), se añadieron 650 μL, de acetonitrilo:agua (40:60) (grado cromatografía de líquidos de alta presión -HPLC-, Fermont®). Las muestras se mezclaron y centrifugaron a 13000 rpm en centrífuga refrigerada (Eppendorf® modelo 5417R) por 15 min. Finalmente el sobrenadante se filtró en papel estéril (Whatman® de 0.2 μm). Del filtrado se tomó 1 mL que se colocó en un vial de 2 mL del automuestreador de un equipo HPLC modelo 1100 de Hewlett-Packard/Agilent Technologies®. Se utilizaron para el análisis dos tipos de columnas, la Zorbax Carbohydrate de Agilent® y la Biorad® Aminex modelo HPX-87H. En ambos casos se analizaron las muestras a 190 nm de longitud de onda a una temperatura de 30 °C. Para la columna Zorbax se utilizó una fase móvil de acetonitrilo:agua 80:20 y un flujo de 1 mL min^-1; mientras que para la columna Aminex se utilizó una fase móvil de ácido sulfúrico 5 mM y un flujo de 0.5 mL min^-1. La identificación de osmolitos presentes se llevó a cabo mediante el uso del estuche comercial 'Sugar Alcohol' de Sigma® y la comparación de los tiempos de retención de los estándares y las muestras separadas. Las cantidades de cada osmolito identificado se estimaron a través del cálculo del área del pico problema multiplicado por el factor de respuesta del estándar respectivo.

Análisis de datos

Resultados

El potencial osmótico en el crecimiento in vitro de M. phaseolina

El efecto del potencial osmótico en el crecimiento del micelio fue negativo, inhibiendo el crecimiento a 1000 mM de NaCl. Con 500 mM NaCl se redujo 10 % el crecimiento respecto al testigo sin NaCl (Figuras 1 y 2). No se encontró diferencia significativa entre aislamientos en cuanto a los valores de las TRCC in vitro dentro de cada nivel de NaCl (datos no mostrados).

Los aislamientos HMP 1, HMP 5, HMP 24 (provenientes de frijol) y HMP 4 (de maíz), mostraron un incremento significativo (p<0.05) en la masa micelial del 50% con 1000 mM NaCl; mientras que los aislamientos de sorgo y soya (HMP 46 y HMP 49) sólo tuvieron un incremento de 25 % en comparación con el testigo.

Patogenicidad de M. phaseolina en semillas de frijol

Las variedades Pinto UI-114 y Azufrado Tapatío mostraron los menores daños (p<0.05) por M. phaseolina, con excepción del aislamiento proveniente de soya; mientras que Β AT477 y SEQ12 mostraron los mayores daños por el hongo. Los aislamientos de maíz y sorgo mostraron mayor agresividad; por el contrario, los aislados de frijol y soya fueron los menos agresivos. Adicionalmente, se determinó que los aislados menos patogénicos (p<0.05), HMP23 y HMP5, aislamientos de frijol, pertenecen a zonas tropicales del país; en contraparte, los aislamientos más agresivos (HMP 4 y HMP 46) fueron obtenidos de la zona semiárida del noreste de México (Figura 3).

Identificación de osmolitos sintetizados

La producción de glicerol, D-fructosa y D-glucosa aumentó proporcionalmente con la concentración de NaCl, con excepción de HMP 46, mientras que el arabitol disminuyó al incrementarse el NaCl (Tabla 2). No se encontró relación entre la producción de osmolitos con el origen del aislamiento. El mayor crecimiento de M. phaseolina se asoció negativamente con la síntesis de osmolitos en ausencia de NaCl, pero positivamente con la concentración de glucosa 500 mM. Por el contrario, la patogenicidad del hongo se asoció negativamente con la producción de osmolitos (Tabla 3).

Discusión

La presencia del NaCl reduce el crecimiento in vitro de M. phaseolina (Cervantes-García et al., 2003; Goudarzi et al., 2008; Zhang et al., 2011) pues con 500 mM se redujo significativamente el crecimiento en comparación con el testigo, y con 1000 mM el crecimiento disminuyó. Lo anterior sugiere que el hongo es incapaz de mantener una presión de turgencia positiva en el micelio para contrarrestar el efecto del NaCl. La reducción del potencial hídrico se debe a un aumento en la concentración de los solutos, que limita la disponibilidad de agua libre para el crecimiento (Harris, 1981). La magnitud del efecto depende tanto de la especie de hongo como de la molécula del soluto y la temperatura de incubación, como ya se ha consignado en los casos de M. phaseolina (Olaya y Abawi, 1996; Cervantes-García et al., 2003) y F. graminearum; en éste último caso, debido a la disponibilidad limitada de agua, el hongo utiliza mayor cantidad de energía para equilibrar el potencial hídrico del citoplasma respecto al ambiente exterior, alterando la fisiología del organismo que se refleja en la disminución del metabolismo y del crecimiento (Ramírez et al., 2004).

Todos los aislamientos de M. phaseolina aumentaron significativamente la producción de micelio en presencia de NaCl, principalmente aquellos provenientes de frijol y maíz. Esto indica que el efecto mayor del NaCl sobre el crecimiento del hongo ocurre probablemente en los ápices de las hifas, lo que ocasiona la disminución del crecimiento lineal pero incrementando la ramificación de las hifas (Mihail et al, 1994; Mayek-Pérez et al, 1997; Goudarzi et al, 2008; Zhang et al, 2011). Esto también explica el aumento en la producción de micelio en presencia del soluto en comparación con el testigo. También, cuando M. phaseolina crece en medio sólido hipertónico, decrece el crecimiento radial de la colonia pero se incrementa el desarrollo de micelio aéreo (Griffith y Boddy, 1991; Cervantes-García et al, 2003; Goudarzi et al, 2008; Zhang et al, 2011) e, incluso, la producción de esporas como estrategia de sobrevivencia y de adaptación a condiciones desecantes. La síntesis de solutos en respuesta al estrés osmótico es una estrategia de osmoregulación de los hongos para modificar la concentración de solutos en la célula, mantener la turgencia celular, sostener la actividad enzimática y, por tanto, el crecimiento (Jennings y Burke, 1990).

Los aislamientos de M. phaseolina que mostraron mayor agresividad (HMP 4 y HMP 46) provienen de zonas áridas del norte de Tamaulipas, mientras que los aislamientos de frijol de zonas tropicales o templadas fueron menos agresivos a semillas de frijol. Esta relación entre origen y patogenicidad en frijol no concuerda con la descrita por Mayek-Pérez et al. (2001), quienes observaron mayor agresividad en aislamientos provenientes de zonas con clima húmedo y que se explicaba en virtud de la necesidad del hongo de 'mejorar' sus capacidades parasíticas en ambiente favorables al crecimiento y el desarrollo del hospedante (Hernández-Delgado et al., 2011). Bajo condiciones de sequía el hongo afecta significativamente al hospedante en virtud de que dicho factor ambiental lo predispone a la infección y daños por pudrición carbonosa (Mayek-Pérez et al, 2002; Goudarzi et al, 2011).

Los hongos pueden sintetizar solutos (osmolitos activos) en respuesta al estrés osmótico para mantener la turgencia celular y mantener el metabolismo enzimático; entre estos compuestos destacan aquéllos con naturaleza poli-alcohólica derivados de azúcares, denominados poliloles. Compuestos como las poliaminas, compuestos nitrogenados que participan en la regulación genética, se comportan como osmolitos dadas sus altas concentraciones en el citoplasma (Roa-Cordero y Rosas-Quijano, 2013). En este trabajo se determinó que un poliol (glicerol) incrementó su concentración en el micelio de M. phaseolina en respuesta al estrés osmótico, como se reportó en F. graminearum (Ramírez et al, 2004). Por el contrario, el hospedante cuenta también con una serie de genes de defensa que activan la síntesis de compuestos anti-microbianos una vez que la interacción ocurre (Rodríguez-López et al., 2011 ; Atkinson y Urwin 2012; Sharma et al, 2014). El glicerol es el osmolito compatible de mayor producción en los hongos dado que es una molécula pequeña de tres átomos de carbono que representa una estrategia de ahorro de energía para el mantenimiento de la presión osmótica y la turgencia, pues genera aproximadamente la misma presión osmótica y la turgencia que otros polioles con mayor peso molecular como el arabitol (Davis et al, 2000). En el presente trabajo, la síntesis de arabitol disminuyó drásticamente con 250 mM de NaCl. Aun en presencia de NaCl no existe relación entre el origen de los aislamientos con la producción de osmolitos.

La patogenicidad de M. phaseolina se asoció negativa y significativamente con la producción de osmolitos en presencia de NaCl. El hongo sintetiza una serie de compuestos que le permiten adaptarse a diversos ambientes y hospedantes y ahora que se ha publicado la secuencia genómica de M. phaseolina (Islam et al, 2012), se amplía el horizonte de posibilidades en cuanto al estudio del hongo y su interacción con sus hospedantes desde diversos contextos: fitopatológico, genético, bioquímico y molecular.

Conclusiones

El estrés osmótico reduce el crecimiento in vitro de M. phaseolina pero incrementa la producción de osmolitos (glucosa, fructosa, glucosa). El estrés osmótico induce la síntesis de novo de osmolitos en M. phaseolina, pero reduce su agresividad en frijol. No hubo asociación entre la producción de osmolitos con el origen, pero sí entre patogenicidad y origen, pues los aislamientos más agresivos son originarios de regiones áridas de México.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Instituto Politécnico Nacional (proyecto multidisciplinario 2011 clave 1350), el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (proyectos clave 48457-Z y 176282). N. Mayek-Pérez y J.M. González-Prieto son becarios EDI-IPN, COFAA-IPN y del S.N.I.

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