Formación de esclerocios en Morchella esculenta y M. cónica, in vitro
Sclerotia formation in Morchella esculenta and M. conica in vitro
Gerardo Alvarado-Castillo1, Gerardo Mata2, Arturo Pérez-Vázquez1, Daniel Martínez-Carrera3 Martha Elena Nava-Tablada4, Felipe Gallardo-López1, Francisco Osorio-Acosta1
1Colegio de Postgraduados, Campus Veracruz, Tepetates, Veracruz, México.
]]> 2Instituto de Ecología A.C., Xalapa, Veracruz, México.3 Colegio de Postgraduados, Campus Puebla, Cholula, Puebla, México.
4 El Colegio de Veracruz, Xalapa, Veracruz, México
*Autor para correspondencia:
Gerardo Mata gerardo.mata@inecol.edu.mx
Recibido 16 de mayo 2011;
Aceptado 22 de abril 2012.
]]> Abstract
The strains IE-750 (M. esculenta) and IE-816 (M. conica) were used and cultivated in a culture media supplemented with compost. Seven stages were identified during sclerotia formation process: 1. Hyphal growth, 2. Primary mycelia growth and branching, 3. Secondary mycelia interweaving, 4. Formation of compact masses, 5. Growth of compact masses, 6. Sclerotia formation, and 7. Sclerotia growth and maturation. Chlamydospores and conidia were also observed during sclerotia formation process, suggesting Morchella displays diverse reproduction and survival strategies under different environmental conditions.
Key words: morel, chlamydospores, conidia, mycelium, strategies.
Resumen
Se identificaron las etapas y procesos de formación de esclerocios de Morchella esculenta y M. conica in vitro, cultivadas en un medio de cultivo suplementado con composta, utilizando las cepas IE-750 (M. esculenta) e IE-816 (M. conica). En la morfogénesis observada se identificaron siete etapas: 1. Crecimiento de hifas principales, 2. Crecimiento y ramificación de hifas secundarias, 3. Entrelazamiento de hifas secundarias, 4. Formación de masas compactas, 5. Crecimiento de masas compactas, 6. Formación de esclerocios y 7. Crecimiento y maduración de esclerocios. También se observó la formación de clamidosporas durante la formación de esclerocios, lo que sugiere que Morchella presenta diversas estrategias de reproducción y sobrevivencia ante diferentes condiciones ambientales.
Palabras clave: morillas, clamidosporas, conidios, micelio, estrategias.
Introducción
Las morillas (Morchella spp.) son hongos comestibles, de alto valor comercial a nivel nacional e internacional, que aún tienen dificultad para cultivarse. Estos hongos producen estructuras de resistencia conocidas como esclerocios, los cuales tienen un rol central en su ciclo de vida y en la producción de cuerpos fructíferos, siendo un punto clave para su domesticación. La función de estas estructuras es acumular reservas y sobrevivir a condiciones adversas, para posteriormente diferenciarse y fructificar cuando exista un entorno adecuado (Ower et al., 1986, 1988; Volk y Leonard, 1990). En las especies del género Morchella, los esclerocios se forman a partir del micelio originado por la germinación de una ascospora, conocido comúnmente como micelio primario, el cual presenta hifas multinucleadas y donde cada célula es una copia múltiple de un único núcleo haploide (homocariotico), que crecen repetidamente y se dispersan hasta formar una masa interconectada entre sí (Pilz et al., 2007).
]]> Los esclerocios también pueden formarse a partir de micelio secundario, producto del cruzamiento entre micelios distintos, a través de un proceso de anastomosis, es decir, el entrecruzamiento de hifas y de la unión de su contenido citoplasmático (plasmogamia), originando un micelio diploide, heterocarionte y multinucleado (Volk y Leonard, 1990; Pilz et al., 2007), el cual puede tener una gran cantidad de núcleos (40-50) (Pilz et al., 2007), que pueden llegar hasta 65 (Volk y Leonard, 1990) y cuyo promedio oscila de 10 a 15 núcleos. Esto le proporciona al micelio secundario estabilidad genética, citológica y somática (Volk y Leonard, 1989a), de tal manera que al diferenciarse y fructificar, producirá progenie meiótica recombinante (ascosporas), totalmente fértiles (Pilz et al., 2007). Ambos micelios (primario y secundario) pasarán por una serie de ramificaciones que se irán compactando hasta formar esclerocios (Volk y Leonard, 1989a; 1990; Amir et al., 1993; Buscot, 1993).En trabajos experimentales, relacionados con la producción controlada de las especies de Morchella, se ha señalado que en la formación de esclerocios son necesarias situaciones adversas (Ower, 1982; Buscot, 1993; Volk y Leonard, 1989a; 1990), como condiciones nutrimentales limitadas o una barrera física que interrumpa el crecimiento micelial (Ower et al., 1986; Amir et al., 1992; Buscot, 1993) o la suplementación de medios de cultivo y sustratos con elementos nutritivos (Volk y Leonard, 1989b; Alvarado-Castillo et al., 2008). Aunque también pueden ser inducidos mediante estrés oxidativo (Hadar et al., 1981), por medio de altas temperaturas (Georgiou et al., 2006) o daño mecánico al micelio (Carrol, 1991; Hadar et al., 1981).
La formación de esclerocios se inicia con cambios metabólicos en el micelio, provocados por la translocación de compuestos de carbono a partir de una fuente de nutrientes, y probablemente efectuada por una hifa conductora especializada. Además el proceso involucra factores endógenos y exógenos tales como el mantenimiento de un balance fisiológico interno y condiciones ambientales que promueven la iniciación de estas estructuras (Willetts y Bullock, 1992).
Los esclerocios tienen la capacidad de permanecer latentes (Willetts y Bullock, 1992), funcionar como almacén de nutrientes (Amir et al., 1992) y en condiciones adecuadas diferenciarse para producir un cuerpo fructífero (Volk y Leonard, 1990; Güller et al., 2005; Pilz et al., 2007) participando en la propagación de Morchella. Aunque la biología de los esclerocios no ha sido explicada completamente (Güller et al., 2005), se han descrito de manera general tres patrones de formación: 1) Disperso, originado a partir de hifas esparcidas pero interconectadas entre sí (Willetts y Bullock, 1992), 2) Terminal, que se da por la ramificación repetida y alargamiento de las hifas principales (Volk y Leonard, 1990) y 3) Lateral, que se origina a partir de ramificaciones accesorias que se conectan entre sí (Amir et al., 1993).
La formación de esclerocios es fundamental, pues diversos estudios han demostrado que tienen un papel determinante en la obtención de fructificaciones de Morchella, tanto en condiciones naturales como controladas (Ower et al., 1986; Masaphy, 2005; Pilz et al., 2007), por lo que su producción en forma abundante y sistemática es la primera de dos condiciones para su domesticación (Stott y Mohammed, 2004), de ahí la importancia de conocer los aspectos que determinen la formación, crecimiento y maduración de los esclerocios (Amir et al.,1992), así como clarificar su papel en el ciclo de vida de Morchella (Correa de Restrepo y Peñuela, 2002), por lo que los objetivos de este estudio fueron obtener esclerocios mediante cultivo in vitro e identificar las diferentes etapas y estructuras durante su formación.
Materiales y métodos
Material biológico
Se estudiaron dos cepas: IE-750 [Morchella esculenta (L. Fr.) Pers.] proveniente de Estados Unidos, adquirida de la empresa Fungi Perfecti e IE-816 [Morchella conica Pers. Ex Fr.], colectada en el Estado de México en un bosque de pino (LN 19° 18' 08.73", LW 100° 01' 46.30"), aislada a partir de una porción del estípite del hongo. Ambas se conservan en el Cepario de Hongos del Instituto de Ecología, A.C., en medio de cultivo con extracto de malta y agar.
]]> Medio de cultivo
El medio de cultivo se elaboró utilizando modificaciones al proceso propuesto por Mata y Rodríguez-Estrada (2005), utilizando 20 g de malta, 20 g de agar y 800 mL de extracto de compost, utilizado para el cultivo de champiñón (Agaricus bisporus), aforados a un litro de agua destilada. El extracto se obtuvo colocando 1.2 k de compost en cuatro litros de agua destilada, hirviendo la mezcla durante 15 minutos a fuego lento y filtrándola posteriormente para obtener el extracto.
Se vertieron 20 mL del medio de cultivo en cajas Petri de 10 cm de diámetro. Se inoculó el centro de cada caja con un implante de 0.5 cm2 de cada cepa y se colocaron cuatro cubreobjetos, esterilizados a fuego directo y distribuidos de manera uniforme, con la finalidad de obtener crecimiento sobre ellos. Se incubó en condiciones de obscuridad a 26 oC durante 3, 6, 9 y 12 días, realizando cinco repeticiones para cada día. Se removieron los cubreobjetos después de los periodos mencionados, examinándolos directamente en un microscopio óptico 1000X modelo K7 (ZeizzR) para observar el desarrollo micelial y la formación de esclerocios.
Tinción
Una vez que crecieron las estructuras sobre los cubreobjetos (micelio y esclerocios según la etapa de crecimiento), se realizaron tinciones con azul de lactofenol, dada la capacidad de este colorante para teñir materiales aniónicos, entre los cuales se encuentra el núcleo y otras estructuras internas (Correa de Restrepo y Peñuela, 2002).
Resultados
No se encontraron diferencias morfológicas entre las especies estudiadas (M. esculenta y M. conica). Las etapas identificadas en la formación de esclerocios de Morchella (Tabla 1) iniciaron con el crecimiento y proliferación de hifas principales (Figura 1a), la cuales produjeron hifas secundarias que se ramificaron (Figura 1b), se entrelazaron entre sí (Figura 1c) e integraron masas hifales, que a su vez formaron estructuras compactas (Figura 1d), mismas que continuaron su crecimiento (Figura 1e). La masa formada incrementó su tamaño hasta dar lugar a los primeros esclerocios (Figura 1f) que maduraron y aumentaron su tamaño, integrando células de su periferia hacia el centro (Figura 2a). Obteniendo durante este periodo su pigmentación característica de color ocre. En este estudio se encontró que el patrón de formación de los esclerocios corresponde a un tipo terminal.
Las primeras tres etapas se refieren principalmente a la colonización del medio de cultivo, en las cuales las hifas crecen, ramifican y entrelazan entre sí, (Figura 2b), estas hifas son multinucleadas (15 núcleos en promedio) (Figura 1c), lo que sugiere la condición heterocarionte de las cepas estudiadas (Volk y Leonard, 1990, Pilz et al., 2007), aspecto importante para que los esclerocios tengan potencial para fructificar (Pilz et al., 2007).
]]> A partir de la etapa cuatro, se observó la formación de estructuras especializadas que se identificaron como clamidosporas (Figura 1f y 2c), que se desarrollaron en las extremidades del micelio, como agregados de hifas vegetativas. Las clamidosporas presentan paredes celulares gruesas y han sido descritas como estructuras de resistencia asexual.
Discusión
Se encontró cierta similitud en las etapas de formación de esclerocios descritas por Amir et al. (1993), quienes mencionan cinco etapas principales: 1. Crecimiento de hifas (en la cual este trabajo coincide plenamente); 2. Formación inicial (que en este estudio abarcaría las etapas de crecimiento, ramificación y entrelazamiento de hifas secundarias); 3. Desarrollo de esclerocios (que en este caso comprende las etapas de formación, crecimiento de masas compactas y formación de esclerocios); 4. Maduración de esclerocios (coincidente con las observaciones de este estudio) y 5. Formación de esclerocios secundarios (lo cual no fue observado en este trabajo, ya que en la formación de esclerocios, no existen otras estructuras adyacentes), así mismo, el tiempo de aparición de estas estructuras (12-14 días) fue similar.
Lo anterior coincide con lo descrito por Smits y Noguera (1988), que señalan que la formación de esclerocios en algunas especies de hongos puede seguir diferentes rutas de desarrollo, pero comúnmente involucran el engrosamiento, ramificación y septación de hifas principales que dan lugar a los esclerocios, sin embargo, uno de los aspectos importantes no considerados por Amir et al. (1993), es la ramificación y entrelazamiento de hifas, etapa que fue descrita por Volk y Leonard (1989b, 1990) y Güler y Arkan (2000), en la que manifiestan que la formación de esclerocios inicia de la repetida ramificación y plasmogamia de hifas que dan origen al micelio secundario, característica necesaria para que, según Pilz et al. (2007), los esclerocios tengan el potencial para fructificar.
Esto tiene relación con el origen del esclerocio (ya sea a partir de micelio primario o secundario), pues existe la duda de que un micelio primario pueda producir esclerocios que logren diferenciarse en un cuerpo fructífero, ya que al ser una estructura haploide, produciría estructuras estériles que no podrían fructificar (Pilz et al. 2007). Con los resultados obtenidos en este trabajo no es posible afirmar o negar esta hipótesis puesto que no se usaron cultivos monospóricos y no se han reportado trabajos utilizando este tipo de cultivos. Sin embargo, (Ower et al., 1986, 1988), sugieren que el micelio de Morchella puede presentar procesos autógamos y heterógamos (Ower et al., 1986, 1988), que pueden derivar en la fructificación del hongo.
Estos procesos en los basidiomicetes se denominan: 1) homotalismo, comportamiento sexual que permite obtener cuerpos fructíferos a partir de la germinación de una sola espora; y 2) heterotalismo, condición en donde la formación de cuerpos fructíferos requiere del cruzamiento de dos micelios compatibles (Miles y Chang, 1997; Kües y Liu, 2000). La condición multinuclear observada en ambas cepas de Morchella (Volk y Leonard, 1990; Pilz et al., 2007), puede dar lugar a estructuras genéticas estables (Volk y Leonard, 1989b), lo cual le conferiría al micelio la capacidad de adaptación a un amplio rango de condiciones ecológicas y ambientales (Volk y Leonard ,1989b; Buscot, 1992; Pilz et al., 2007).
Durante la formación de masas compactas (etapa 4) se observó la generación de estructuras que fueron identificadas como clamidosporas, estas estructuras también fueron identificadas por Ower (1982) y Ower et al. (1986; 1988) y fueron descritas como una clase de conidios. Éstas se desarrollaron a partir de hifas independientes. Las clamidosporas según Amir et al. (1993) y Pilz et al. (2007) son asexuales y son el resultado de la modificación de hifas simples, y representan un medio de propagación clonal y desempeñan un papel importante en el almacenamiento de energía (Lin y Heitman, 2005), que podría ser necesaria en la esporulación sexual bajo condiciones ambientales adversas. De igual forma, Pilz et al. (2007), describieron que Morchella produce estas estructuras con el objetivo de producir esporas para su dispersión, como una estrategia de sobrevivencia.
La producción de clamidosporas es una estrategia similar a la utilizada por otros hongos que producen "mildius polvosos". En Morchella, a esta etapa se le ha dado el nombre de Costantinella cristata Matr., la cual se observó que coincide con lo señalado por Pilz et al. (2007), pues las hifas formaron estructuras a manera de conidios en forma individual (aunque también pueden ser agrupados). Esta es una característica de la reproducción asexual de Morchella, que ha sido reportada comúnmente en su cultivo artificial, ya que en condiciones naturales es poco probable que ocurra (Stamets, 2000). Por tanto es posible especular, con base en la literatura, que el micelio haya producido tanto esclerocios como clamidosporas como un mecanismo de sobrevivencia.
En la etapa de formación de esclerocios, se observaron estructuras uniformemente reticuladas sin presentar zonas de tejidos diferenciables, como se señala para Sclerotinia spp. y Sclerotium rolfsii Sacc. (Hadar et al., 1981), ni estructuras con alguna complejidad morfológica (Smits y Noguera, 1988). Los esclerocios en su etapa madura revelaron una serie de células isodiamétricas compactas con paredes gruesas (Figura 2a), que indican que estos ya son capaces de tolerar condiciones adversas como baja temperatura o desecación (Amir et al., 1993, 1994), lo que permite ser una estructura de resistencia capaz de fructificar cuando se presenten las condiciones adecuadas.
]]> En general, el desarrollo de los esclerocios, coincide con las etapas descritas en trabajos previos, sin embargo, se encontró que la formación de estas estructuras se origina por procesos reiterativos de crecimiento y entrelazamiento de las hifas principales. Se identificó la formación de clamidosporas, las cuales dan lugar y forman parte de los esclerocios, lo cual no había sido previamente reportado y sugiere que estos hongos tienen más de una estrategia de dispersión y sobrevivencia. Aunque el esclerocio ha sido considerado una estructura de resistencia, en este trabajo fue obtenido bajo condiciones apropiadas, ya que las cepas no se sometieron a estrés, lo que sugiere que la formación de dichas estructuras, no sólo es causada por condiciones adversas y que podría tener otro tipo de función como el almacenamiento de nutrientes.Aunque aún existen dudas sobre el ciclo de vida de Morchella, este estudio permitió un mayor acercamiento y entendimiento de la formación de los esclerocios, por lo que se espera que la información generada sea de utilidad para la manipulación del hongo bajo condiciones controladas. En este sentido es necesario continuar con investigaciones que permitan esclarecer las dudas en la morfogénesis de los esclerocios y su papel en el ciclo de vida de las especies de Morchella, ya que para entender la dinámica de reproducción de estos hongos es necesario entender sus adaptaciones, ciclo de vida, modos de nutrición y estrategias reproductivas.
Agradecimientos
Se agradece al Colegio de Postgraduados Campus Veracruz, a la Red de Manejo Biotecnológico de Recursos del INECOL y al CONACYT, por la implementación y financiamiento de esta investigación. Alvarado-Castillo agradece la beca otorgada por CONACYT para la realización de estudios doctorales.
Literatura citada
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