Efecto de la toxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis sobre el crecimiento de algunos hongos alergénicos aislados de pacientes con rinitis alérgica
Effect of the Cry1Ac toxin from Bacillus thuringiensis over the growth of some allergenic fungi isolated from patients whose suffer from allergic rhinitis
Alain R. Rodríguez–Orozco1,2*, Héctor Ruiz–Reyes1,2 y Salvador Sánchez–Nafarrate 1,2
1 Laboratorio de Inmunología. División de Postgrado. Facultad de Ciencias Médicas y Biológicas Dr. Ignacio Chávez. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Morelia, Michoacán, México.
2 Instituto de Investigación Científica en Temas de Familia, Alergia e Inmunología.
]]>* Autor para correspondencia:
Alain R Rodríguez–Orozco arorozco69@yahoo.com.mx.
Recibido16 de agosto 2008
Aceptado12 de junio 2009.
Abstract
Cry1Ac is a potent mucosal adjuvant. This work was undertaken to evaluate the effect of the Cry1 Ac toxin from Bacillus thuringiensis over growth up of allergenic fungi. The fungi were isolated from nasal exudates in patients with diagnostic of allergic rhinitis and positive skin prick test to allergic fungi. The fungi isolated were identified morphologic and by Biolog system and agar diffusion test was done to evaluate the effect of the Cry1 Ac toxin over the fungi growth up. The following fungal genera were identified: Absidia, Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Eupenicillium, Fusarium and Cladosporium. The highest inhibition of growth was obtained for Alternaria to a concentration 31.25μg/mL of toxin. This inhibition corresponded to 100% of the inhibition achieved with Amphotericin B. We suggest to explore the inhibitory effect of Cry1 Ac on the growth up of different genera and species of pathogenic fungi via molecular standardized assays.
Key words: Diagnostic, inhibitory effect, microbial identification.
]]>Resumen
Cry1Ac es un potente adyuvante en mucosas. Este trabajo se realizó con el objetivo de evaluar el efecto de la toxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis sobre el crecimiento de hongos alergénicos. Los hongos fueron aislados de exudados nasales de individuos con diagnóstico de rinitis alérgica y que además habían presentado prueba de hipersensibilidad cutánea inmediata positiva a hongos, mediante la prueba de Prick. Los hongos aislados se identificaron morfológicamente y por sistema Biolog, posteriormente se evalúo el efecto que tenía Cry1Ac sobre su crecimiento en ensayos de sensibilidad por difusión en agar. Se identificaron los siguientes géneros fúngicos: Absidia, Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Eupenicillium, Fusarium y Cladosporium. Se obtuvo la inhibición máxima del crecimiento de Alternaria a una concentración de 31.25μg/mL de la toxina, esta inhibición correspondió con el 100% de la inhibición alcanzada con Anfotericina B. Sugerimos investigar de una manera más profunda el efecto inhibitorio de Cry1Ac en su forma pura, sobre el crecimiento de diferentes géneros y especies de hongos mediante el uso de ensayos estandarizados a nivel molecular.
Palabras clave: diagnostico, efecto inhibitorio, identificación microbiana.
Introducción
La rinitis alérgica es producida por la inflamación de las fosas nasales, y puede ser provocada por aeroalergenos provenientes de ácaros, epitelios de animales, pólenes y hongos. Los síntomas más frecuentes son rinorrea, prurito nasal, estornudos y obstrucción nasal. La inflamación de la mucosa nasal se caracteriza por un infiltrado celular que incluye; eosinófilos, células cebadas, linfocitos T y macrófagos, estas células liberan mediadores proinflamatorios como: histamina, leucotrienos, prostaglandinas y citocinas que modulan la respuesta alérgica (Sacre–Hazouri, 2008).
Los hongos como aeroalergenos
La inhalación de estructuras fúngicas (conidios, fragmentos de hifas) pueden inducir patología alérgica respiratoria, tanto de vías aéreas superiores como inferiores, en personas atópicas. Varias de las estructuras fúngicas presentes en el hábitat del paciente atópico (Martínez et al., 2002) contienen moléculas como glucoproteínas, proteínas y polisacáridos, que desencadenan reacciones de hipersensibilidad de tipo I mediada por IgE, estas pueden ser reveladas a través de las pruebas de hipersensibilidad cutánea que tradicionalmente realiza el médico alergólogo. Algunos de los géneros de mayor interés alergológico en México son: Alternaria, Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Helminthosporium, Fusarium, Mucor, Rhizopus y Absidia (Ruiz–Reyes y Rodríguez–Orozco, 2006).
Bacillus thuringiensis (Bt)
]]> Bt es una bacteria Gram positiva, aerobia estricta, durante su ciclo de vida presenta dos fases bien diferenciadas: la de crecimiento vegetativo y la de esporulación. Durante esta última la bacteria produce proteínas en forma de inclusiones cristalinas (endotoxinas Cry) con actividad insecticida, o que ha permitido su uso amplio en la agricultura (Sauka et al., 2007). La protoxina Cry1Ac se inserta en la membrana de células epiteliales del intestino medio de varios insectos, generando poros que inducen la entrada y salida de diferentes iones y cationes, esto conduce a shock osmótico y muerte del insecto (Ruiz de Escudero et al., 2006).Efecto inmunogénico y adyuvante de Cry1Ac
Inmunogenicidad es la capacidad que tienen los antígenos de interactuar con efectores de la respuesta inmunológica y desencadenar una respuesta inmunitaria, por otra parte, los coadyuvantes son sustancias que al coadministrarse con el antígeno, aumentan la magnitud de la respuesta inmunológica con respecto a la que se obtendría cuando el antígeno se administra solo. Las mucosas son un sistema difícil para la obtención de respuestas inmunogénicas y la búsqueda de adyuvantes de mucosas potentes e inocuos es una meta en el desarrollo de vacunas y en la lucha contra patógenos que invaden las mucosas (Rodríguez–Orozco, 2003). En un estudio realizado por Rojas–Hernández et al. (2004), observaron que la coadministración intranasal de la protoxina Cry1Ac con lisados de amibas incrementa la inmunidad protectora contra ratones infectados con Naegleria fowleri, aumentando los niveles de inmunoglobulina G e inmunoglobulina A (Rojas–Hernández et al., 2004). Por otra parte, se obtuvo una potente respuesta de proliferación de monocitos cuando se administró la protoxina Cry1Ac junto con un lisado de Streptococcus pyogenes que cuando solo se administró el lisado bacteriano (Rodríguez–Orozco, 2006). Este estudio mostró que la protoxina Cry1Ac potencia la respuesta celular contra patógenos de mucosa; esto resulta importante en el diseño de vacunas y el manejo de infecciones. Se ha señalado que las dosis a las que se usa Cry1Ac como pesticida en la agricultura no inducen toxicidad en modelos marinos y que su toxicidad se ejerce preferencialmente sobre insectos como coleópteros y lepidópteros (McClintock et al., 1995). Los costos de producción de Cry1Ac son relativamente bajos, y resulta atractiva la idea de disponer de un nuevo agente capaz de inhibir el crecimiento de patógenos que se asocian a reacciones de hipersensibilidad en el huésped atópico como sucede con las especies de hongos alergénicos. El presente trabajo se realizó con el objetivo de evaluar el efecto de la toxina Cry1Ac de Bt sobre el crecimiento de algunos hongos alergénicos aislados en individuos atópicos.
Materiales y métodos
Participaron 30 pacientes provenientes del Hospital Vasco de Quiroga del ISSSTE, en la Ciudad de Morelia, Michoacán, en los que se realizó diagnóstico clínico de rinitis alérgica por un médico alergólogo y que además tuvieron prueba de hipersensibilidad cutánea positiva a algún género fúngico.
Pruebas de hipersensibilidad cutánea
Para la realización de las pruebas cutáneas se utilizaron extractos alergénicos en concentración 1:20 p/v (Allerstand, México D.F.) de los siguientes hongos: Alternaria sp., Aspergillus sp., Candida sp., Helminthosporium sp., Cladosporium sp., Mucor sp., Penicillium sp., Eupenicilium sp., Absidia sp. y Rhizopus sp. Para la aplicación de los alergenos se utilizaron lancetas Duotip–Test estériles Lincoln diagnostic, Inc. Decatur, Illinois 62525 EUA), introducidas por rotación a 360° para la penetración del alergeno a la piel de la cara flexora del antebrazo. Se usaron como control positivo fosfato de histamina [1 mg/mL] y como control negativo solución amortiguadora de fosfatos. Las reacciones se interpretaron según sugerencias del proveedor.
Aislamiento e identificación de hongos
Los exudados nasales practicados en los pacientes fueron colectados con un hisopo estéril y transportados en un tubo con medio de Stuart, (Bioxon, EUA) para su posterior procesamiento.
]]> Elaboración del medio de cultivo BUGTMSe disolvieron 57 g de BUGTM (BIOLOG) Agar en 1000 mL de agua destilada, se calentó la mezcla a ebullición con agitación constante hasta la disolución, se dejó reposar a 25°C y se ajustó el pH a 7.2 con NaOH 1N o HCl 1N (Olsen,1996). Se añadió maltosa (Sigma) al 2% con agitación constante, hasta su disolución, y se esterilizó con calor húmedo a 15 lb/pulgada durante 15 min.
Procesamiento de los aislamientos fúngicos
Los exudados fueron sembrados por estría masiva con un hisopo estéril en medios de cultivo sólido agar con dextrosa y papa (ADP) Bioxon, EUA. Las cajas se incubaron a 37°C y 26°C y fueron observadas cada 24 horas para detectar el eventual crecimiento de las colonias, durante no menos de 3 semanas. Las muestras con desarrollo se resembraron e incubaron en las condiciones descritas, para obtener un cultivo puro de cada uno de los hongos. El proceso de resiembra se repitió al menos dos veces y posteriormente los hongos aislados se tipificaron por sus características macroscópicas (aspecto de las colonias, tamaño, forma, color en la superficie o en el reverso, aspecto, textura, coloración, consistencia, rapidez de crecimiento y difusión del pigmento) y micromorfológicas. Para esto último se realizaron preparaciones por disociación montadas en azul de lactofenol, valorando el grosor, presencia o ausencia de septos, números de núcleos, forma y tamaño de esporas, talo y presencia del aparato conidiógeno del micelio. Se evaluó el índice de crecimiento micelial por medición diaria de los diámetros de los micelios por tres semanas (Barnett y Hunter, 1998).
Identificación de los hongos por sistema BIOLOG
Obtención del pre – inóculo: Una vez obtenidas las cepas de hongos en forma pura en ADP, las células fúngicas aisladas se resembraron en el medio BUGTM (BIOLOG) agar, adicionado con maltosa al 2%, para hongos filamentosos. Se incubaron a 37 °C durante 5 a 10 días, hasta obtener un crecimiento abundante, se evitó la incubación excesiva y la entrada en la fase estacionaria de los hongos filamentosos, con pérdida de viabilidad y actividad metabólica.
Preparación de la suspensión
Una vez desarrollado el hongo filamentoso, se removió el micelio de la superficie de la placa de agar con una varilla de vidrio estéril y se colocó dentro de un tubo de vidrio seco. Se maceró el hongo hasta pulverizarlo en partículas pequeñas y se agregaron 3 mL del fluido FF suministrado por el proveedor (FF INOCULATING FLUID, BIOLOG, Hayward, CA 94545, EUA).
Inoculación e incubación de los hongos filamentosos en las microplacas para BIOLOG
Se colocó la suspensión de hongos filamentosos sobre el reservorio multicanal estéril y se incubó a 26 °C, realizando la lectura tras 24, 48, 72 y 96 horas de incubación.
]]> Identificación de los resultados obtenidos con el BIOLOGLas reacciones positivas para hongos se pusieron de manifiesto por una reacción de turbidez. Los aislados procedentes de exudados nasales fueron recuperados e inoculados en solución salina fisiológica 0.85%, una vez observado el crecimiento de células fúngicas a las 48 horas, fueron sembrados masivamente en medios de cultivo ADP (Bioxon, EUA) a 28°C, durante 5 días. Posteriormente se identificó la morfología de las cepas fúngicas por microcultivo en portaobjetos y tinción con azul de lactofenol. La biotipificación de los aislados fúngicos se complementó en equipo BIOLOG como ha sido propuesto por Praphailong et al. (1997). Se seleccionaron solo los géneros que presentaron prueba cutánea positiva en los pacientes estudiados para evaluar el efecto, que sobre el crecimiento de estos hongos tenían sobrenadantes de cultivo de células mononucleadas estimuladas con Cry1Ac y Cry1Ac per se.
Obtención de Cry1Ac
La toxina Cry1Ac recombinante, fue donada por el Dr. Benito Pereyra de la Universidad Autónoma de Nuevo León, México. Ésta se clonó en una cepa transformada de E. coli (DH5α) y su expresión fue inducida con isopropil β–D tiogalactopiranósido (IPTG, EUA) (Vázquez Padrón et al., 2000). La realización de electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS–PAGE) permitió corroborar el peso molecular de la toxina y su pureza del 99.6%.
Obtención de sobrenadantes de células mononucleadas (CMN) estimuladas con Cry1Ac
Las CMN se obtuvieron de sangre periférica de voluntarios sanos y fueron separadas en gradiente de separación Ficoll–paque d= 1.077 (Sarstedt, Inc, Newton, NC 28658, EUA). La viabilidad celular se determinó por exclusión con azul de tripano y se aceptó como suficiente cuando fue mayor al 95%. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano a 2x105 células / pozo en medio RPMI–1640 completo y suero fetal bovino inactivado 10%, se trataron con concentraciones variables de Cry1Ac (500 (μg/mL, 250 125 (μg/inL, 62.5 (μg/mL, 31.25 (μg/mL, 15.62 (μg/mL, 7.81 (μg/mL). Las placas se incubaron 72 horas a 37 °C, en una incubadora (CO2 Incubator – SHEL LAB, EUA) con atmósfera húmeda de CO2 al 5%. El control negativo consistió en células no tratadas con Cry1Ac. El sobrenadante de los cultivos fue almacenado a –20 °C para su uso posterior.
Valoración del efecto de Cry1Ac en forma pura
Se valoró el efecto de la toxina Cry1Ac en forma pura a concentraciones de 500 (μg/mL, 250 (μg/mL, 125 (μg/mL, 62.5 (μg/mL, 31.25 (μg/mL, 15.62 μg/mL y 7.81 (μg/mL, sobre las cepas de cada uno de los hongos aislados e identificados a nivel de género.
Efecto de Cry1Ac sobre el crecimiento en agar de hongos alergénicos
Estas pruebas se realizaron por el método de difusión en agar, con un inóculo de (5 x 102 – 2.5 x 103 UFC/mL) suspendido en RPMI 1640, e incubación de 24–48 h a una temperatura de 35 °C (Cantón–Lacasa et al., 2001). La técnica Kirby Bauer fue utilizada para la evaluación de los halos de inhibición, Se impregnaron discos de papel filtro con 25 μL de: 1) Anfotericina B 50 μg/mL (control positivo: sensible), 2) Fluticasona 2 mg/mL (control negativo: resistente), 3) Sobrenadantes de cultivo de células mononucleadas activadas con diferentes concentraciones de toxina CrylAc y 4) concentraciones variables de toxina CrylAc en forma pura (500 (μg/mL, 250 (μg/mL, 125 (μg/mL, 62.5 (μg/mL, 31.25 (μg/mL, 15.62 (μg/mL, 7.81 (μg/mL), se dejaron difundir en el agar donde crecieron los hongos.
]]> La inhibición del crecimiento del hongo se estimó como diámetro del halo de inhibición y se expresó en mm. Se calculó el porciento de inhibición del crecimiento de cada hongo obtenido con Cry1Ac respecto al alcanzado con Anfotericina B (antifúngico al que estos hongos fueron sensibles), según la fórmula:Se utilizaron como cepas control: Alternaria alternata ATCC 44501, Aspergillus niger ATCC 16404, Eupenicillium pinetorum ATCC 14770, Absidia glauca ATCC 22752 y Cladosporium cladosporioides ATCC 38495.
Para participar en el estudio todos los pacientes firmaron una hoja de consentimiento informado y el protocolo fue aprobado por el comité de ética de la División de Postgrado de la Facultad de Ciencias Medicas y Biológicas "Dr. Ignacio Chávez" de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.
Resultados
Luego de analizar morfológicamente las colonias y someter las muestras a análisis en equipo Biolog se identificaron los siguientes géneros: Absidia, Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Eupenicillium, Fusarium y Cladosporium.
Ninguno de los sobrenadantes de cultivo de células mononucleadas estimulados con concentraciones variables de Cry1Ac inhibió el crecimiento de las cepas fúngicas evaluadas en los pacientes atópicos, sin embargo, la toxina Cry1Ac pura a una concentración de 31.25 (μg/mL, inhibió el crecimiento de A lternaria en igual magnitud que 5 0 μg/mL de Anfotericina B. Absidia y Eupenicillium fueron también inhibidos por Cry1Ac en igual magnitud que con 50 μg/mL de Anfotericina B; con una dosis de 500 (μg/mL de la toxina (Tabla 1). Se tomó como referencia Anfotericina B porque fue el antifúngico con el que se obtuvo la inhibición mayor del crecimiento de hongos alergénicos en experimentos previos realizados en nuestro laboratorio.
Discusión
Se conoce que las enfermedades alérgicas respiratorias como la rinitis alérgica pueden ser inducidas por inhalación de moléculas presentes en estructuras fúngicas. Como los hongos alergénicos son patógenos que entran al organismo a través de la mucosa nasal, resulta atractivo inhibir su adhesión, replicación y colonización en las mucosas (Ruiz–Reyes y Rodríguez–Orozco, 2006). En este trabajo, se estudió la capacidad de la toxina Cry1Ac de Bt para inhibir el crecimiento de hongos alergénicos aislados a partir de exudados nasales de pacientes con rinitis alérgica y que están sensibilizados con hongos alergénicos.
]]> En estudios recientes se ha demostrado que fagocitos profesionales, en particular, los monocitos y neutrófilos son un blanco celular importante para explicar el impacto de Cry1Ac sobre el sistema inmune humano. En el año 2005 observamos que Cry1Ac ejercía una potente activación de monocitos y neutrófilos y que se alcanzaba un máximo en los estallidos respiratorios de estas células cuando eran tratadas con 3.9 μg/mL y 7.8 μg/mL de Cry1Ac respectivamente y este efecto es importante para explicar la actividad fagocítica inducida por la toxina (Rodríguez–Orozco et al., 2005). Al enfrentar los aislados fúngicos provenientes de individuos atópicos a sobrenadantes de cultivo de células mononucleadas tratados con Cry1Ac no se redujo el crecimiento de estos hongos, lo que nos indica que la activación de la fagocitosis en monocitos no parece ser un mecanismo importante en la inhibición del crecimiento de los hongos aislados a diferencia de lo observado con bacterias (Rodríguez–Orozco et al., 2007). Sin embargo, la toxina Cry1Ac en su forma pura indujo inhibición del crecimiento en forma similar a la alcanzada con Anfotericina B en tres géneros fúngicos. Para obtener un efecto inhibitorio del crecimiento fúngico de los géneros Eupenicillium y Absidia se requirieron concentraciones de Cry1Ac 16 veces mayores que las requeridas para causar una inhibición similar a la obtenida en Alternaria. Llama la atención que el efecto más potente se ha relacionado sobre la reducción del crecimiento fúngico se haya logrado en el género Alternaria el cual puede asociarse a rinitis alérgica persistente y asma de difícil control en nuestro medio y suele ser este el principal género al que se dirige la inmunoterapia desensibilizante alergenoespecífica, de tal suerte contar con un preparado capaz de inhibir su crecimiento puede ofrecer nuevas alternativas a la terapia convencional de la enfermedad alérgica en individuos sensibilizados con ese género de hongos.Con respecto al posible mecanismo por el cual la toxina Cry1Ac inhibe el crecimiento de hongos alergénicos podríamos descartar que sea debido al incremento de especies reactivas del oxígeno (explosión oxidativa) por parte de monocitos (Rodríguez–Orozco et al., 2005) debido a que los sobrenadantes de cultivo de células mononucleadas estimuladas con concentraciones variables de Cry1Ac no inhibieron el crecimiento de los hongos en agar. El efecto inhibitorio de Cry1Ac fue además selectivo sobre algunos hongos alergénicos, lo que depende de la interacción de la toxina con receptores en hongos aún no caracterizados. Sería conveniente estudiar la interacción de Cry1Ac con receptores en la superficie de algunos hongos, estudiar las vías de transducción de señales inhibitorias sobre el crecimiento de estos hongos y caracterizar el efecto de Cry1Ac sobre metabolitos importantes en el ciclo de vida de varios hongos patógenos, no sólo de aquellos en los que constatamos la inhibición del crecimiento en este estudio.
Algunos de los receptores que reconoce Cry1Ac pueden estar distribuidos en varios microoganismos, por ejemplo se conoce que la toxina Cry1Ac reconoce específicamente al carbohidrato N–acetilgalactosamina (GalNAc) presente en el receptor N–aminopeptidasa (APN receptor) que se encuentra en larvas de insectos (Maduca sexta) y se ha propuesto que las toxinas Cry1A interaccionan secuencialmente con un receptor a cadherina, que lleva a la formación de una estructura oligomérica del pre–poro que se une a glicosilfosfatidil–inositol anclada al receptor N–aminopeptidasa y que los residuos de triptófano son esenciales para la unión de Cry1Ac a la membrana (Gómez et al., 2006). También se ha sugerido que múltiples toxinas Cry pueden tener el mismo blanco molecular en insectos (Sauka et al., 2007). En estudios relacionados con la bioquímica de las toxinas Cry, se ha referido que la toxina se une con alta afinidad a glicoproteínas de entre 63 y 220 kDa, se cree que la interacción inicial sea entre la toxina y el carbohidrato del receptor, mientras que la unión irreversible esté asociada con una interacción proteína–proteína (Garczinski et al., 1991). Sugerimos buscar si estas u otras proteínas filogenéticamente cercanas pueden explicar los blancos de interacción de Cry1Ac sobre la superficie de hongos patógenos. Por otro lado, sugerimos estudiar si la toxina Cry1Ac puede inhibir la captación de nutrientes por el hongo, a través de la modulación de vías metabólicas importantes para el desarrollo fúngico.
Sabemos que las pruebas de susceptibilidad in vitro de los hongos están influenciadas por el criterio para el punto de corte de la concentración inhibitoria mínima; para superar esta limitación nos hemos propuesto evaluar en un panel más extenso de hongos filamentosos el efecto de la toxina sobre el crecimiento de estos hongos según los lineamientos M38–P.
En este trabajo decidimos evaluar el efecto que sobre el crecimiento de los hongos tenían las mismas concentraciones de Cry1Ac que indujeron un aumento en la actividad oxidativa y la fagocitosis en monocitos (Rodríguez–Orozco et al., 2005; 2007); por ser las monocinas y otros productos derivados de monocitos parte importante de los sobrenadantes de cultivo de células mononucleadas estimuladas con Cry1Ac y en los que previamente comprobamos efectos inhibidores del crecimiento bacteriano (Rodríguez–Orozco, 2006; Rodríguez–Orozco et al., 2007).
El efecto de inhibición de crecimiento de algunos géneros de hongos alergénicos inducido por Cry1Ac está relacionado con la acción directa sobre estos géneros fúngicos y no es mediado por la producción de moléculas provenientes de la interacción de la toxina con células mononucleadas al menos "in vitro".
Finalmente proponemos investigar de una manera más profunda el efecto inhibitorio de Cry1Ac en forma pura, sobre el crecimiento de especies de hongos patógenos mediante el uso de ensayos estandarizados a nivel molecular.
Agradecimientos
Agradecemos la colaboración del Dr. Benito Pereyra de la Universidad Autónoma de Nuevo León, México, por haber donado la toxina Cry1Ac.
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