Phenotypic characterization of culturable marine luminous bacteria isolated from coastal waters of the southern Adriatic Sea (Otranto, Italy)

F Bagordo¹, F Serio¹, F Lugoli¹, T Grassi¹, A Idolo¹, G Gabutti², A De Donno¹*

¹ Department of Biological and Environmental Science and Technology (Di.STe.B.A.), University of the Salento, via Prov. le Lecce-Monteroni, 73100 Lecce, Italy. * Corresponding author. E-mail: antonella.dedonno@unisalento.it

² S.C. Igiene e Sanitá Pubblica, ASL4 Chiavarese, Regione Liguria, Italy.

RESUMEN

Con el fin de determinar la abundancia y composición de especies de bacterias luminosas en aguas costeras del sur del mar Adriático (Otranto, Italia), se recolectaron muestras en tres sitios con diferente grado de contaminación antropogénica. Se aislaron 116 cepas de bacterias luminosas marinas y se sometieron a 36 pruebas bioquímicas para su caracterización fenotípica. El análisis numérico de los datos mostró cinco grupos con > 86% de similitud, los cuales fueron identificados como Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Vibrio splendidus biovar I y Shewanella hanedai. La abundancia relativa de cada especie muestra que las bacterias luminosas cultivables en las aguas analizadas consisten principalmente de V. harveyi (69.0%), V. fischeri (13.8%) y P. leiognathi (12.1%). Además, la actividad humana parece afectar la abundancia total de bacterias luminosas pero no la selección de especies individuales, ya que las frecuencias de las bacterias fueron similares en todos los sitios estudiados.

Palabras clave: bacterias luminosas, agua marina, caracterización fenotípica, aguas costeras, bacterias heterótrofas.

ABSTRACT

To determine the abundance and species composition of luminous bacteria in the coastal waters of the southern Adriatic Sea (Otranto, Italy), samples were collected from three sites affected by different degrees of anthropogenic pollution. A total of 116 strains of marine luminous bacteria were isolated and subjected to phenotypic characterization, which included 36 biochemical tests. Numerical analysis of the data revealed five clusters with > 86% similarity, which were readily identified as Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Vibrio splendidus biovar I, and Shewanella hanedai. The relative abundance of each species shows that culturable luminous bacteria in the monitored waters are composed mainly of V. harveyi (69.0%), followed by V. fischeri (13.8%) and P. leiognathi (12.1%). In addition, human activity appears to affect the total abundance of luminous bacteria but not the selection of individual species, since the frequencies of the bacteria were similar at all examined sites.

Introducción

Las bacterias luminescentes (BL) se agrupan como una unidad funcional con base en su capacidad de emitir luz visible. Estas bacterias se encuentran ocasionalmente en agua dulce, agua salobre y suelos, pero son ubicuas en el ambiente marino, donde ocupan una gran variedad de nichos (Nealson y Hastings 1979).

Las BL marinas han sido aisladas de agua de mar como células de vida libre o adheridas al sedimento y detrito (Reichelt y Baumann 1973, Ramesh et al. 1990), y se distribuyen ampliamente en ambientes costeros someros y aguas pelágicas profundas. Frecuentemente se asocian con organismos marinos vivos y no vivos, y colonizan animales marinos como saprófitos, comensales y parásitos (Ramesh et al. 1990, Abraham y Palaniappan 2004, Liu et al. 2004, Dunlap y Kita-Tsukamoto 2006, Stabili et al. 2008, Nyholm et al. 2009). Se han identificado algunas especies bioluminescentes como simbiontes de especies específicos de peces marinos y calamares, en donde se concentran en órganos altamente especializados que emiten luz (Nealson y Hastings 1992, Dunlap y Kita-Tsukamoto 2006, Abraham y Palaniappan 2004, Liu et al. 2004, Stabili et al. 2008, Nyholm et al. 2009). La emisión de luz es sensible a varios compuestos tóxicos, por lo que se utilizan algunas especies luminosas en pruebas ecotoxicológicas para evaluar la calidad de ambientes acuáticos (Narracci et al. 2008).

En agua marina no contaminada, la concentración de BL de vida libre es baja (0.01-40 cél mL^-1) (Dunlap y Kita-Tsukamoto 2006); sin embargo, varios estudios han sugerido que la razón entre BL y bacterias heterótrofas totales (conteo en placa) podría ser un indicador útil de la calidad de agua costera, debido a su sensibilidad a impactos antropogénicos en ecosistemas estuarinos (Ramaiah y Chandramohan 1993, Bacci et al. 1994, Sbrilli et al. 1997, Nocciolini et al. 2000, Perego et al. 2002).

La actual taxonomía de BL marinas cultivables incluye al menos nueve especies: dos se asignan al género Photobacterium (P. leiognathi, P. phosphoreum), cinco al género Vibrio (V. harveyi, V. fischeri, V. logei, V. orientalis y V. splendidus biovar I), y dos al género Shewanella (S. hanedai y S. woodyi) (Frischer et al. 2005, Chiu et al. 2007).

Aunque varios estudios han descrito la distribución y abundancia de especies luminosas en ecosistemas marinos (Ramaiah y Chandramohan 1993, Bacci et al. 1994, Sbrilli et al. 1997, Nocciolini et al. 2000, Perego et al. 2002), aún no se entienden bien muchos aspectos relacionados con las BL marinas, incluyendo la composición de especies, dinámica de poblaciones, funciones ecológicas y relaciones de nicho.

El presente trabajo describe la abundancia así como la composición de especies de las BL marinas en tres sitios localizados en la costa del sur del mar Adriático (Otranto, Italia). Se describen el aislamiento y la caracterización bioquímica de cepas bacterianas luminosas.

Se seleccionaron tres sitios de muestreo en una zona costera del sur del mar Adriático (fig. 1): el sitio 1, en la rada portuaria de Otranto, es impactado por las actividades navieras y protuarias, así como por la urbanización alrededor de la bahía; el sitio 2, a unos 20 m de la línea de costa, es impactado por la urbanización; y el sitio 3, a unos 1000 m mar adentro, no parece estar impactado. Se realizaron dos muestreos, el 14 y 24 de septiembre de 2007.

Las muestras se tomaron entre 09:00 y 11:00 en condiciones de cielo despejado y aguas tranquilas. En cada sitio se recolectaron dos muestras de agua de unos 20 cm por debajo de la superficie en botellas (tipo Abba) esterilizadas. Las propiedades físicas (temperatura, salinidad y pH) fueron medidas in situ con un medidor WTW Multiline P4. Las muestras se transportaron al laboratorio y se precesaron dentro de 1 h de su recolección mediante la filtración de tres volúmenes de 100, 10 y 1 mL a través de membranas de ésteres mixtos de celulosa de 0.45 |im de tamaño de poro (Millipore). Las membranas se colocaron sobre agar (Seawater Complete, SWC) (Lee et al. 2001). Los cultivos se incubaron a 20 °C en la oscuridad durante 36-48 h. Las bacterias heterótrofas cultivables, etiquetadas como concentración bacteriana aparente (CBA) expresada en unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC mL^-1), se determinaron mediante la enumeración del total de colonias a la luz del día. Las placas también se observaron en la oscuridad para enumerar las colonias luminiscentes, las cuales se expresaron como el porcentaje de bacterias heterótrofas totales (CBA), considerada la fracción luminiscente (FL).

Las colonias luminiscentes que aparecieron en las placas fueron marcadas en el cuarto oscuro y retiradas sucesivamente y purificadas mediante rayados sucesivos en las placas de SWC.

Se examinaron 36 características fenotípicas de todas las cepas mediante pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas. Se registraron las siguientes pruebas para todas las cepas: tinción de Gram; movilidad; catalasa; oxidasa (tiras de oxidasa, Oxoid); luminiscencia sobre agar de SWC; crecimiento después de 7 días a 4 °C y después de 2 días a 10, 15, 25, 30, 35 y 40 °C en caldo de soja tríptico (TSB) suplementado con 2% de NaCl; y tolerancia a la sal en caldo de NaCl al 0%, 1%, 3%, 6%, 8% y 10% (Pedersen et al. 1998).

La reducción de nitratos, el metabolismo óxido-fermentativo (O/F) de la glucosa, la hidrólisis de ONPG (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido), la lisina (LDC) y ornitina descarboxilasa (ODC), la arginina dihidrolasa (ADH), la producción de H₂S a partir de tiosulfato, la producción de indol, la hidrólisis de urea, la reacción de Voges-Proskauer (VP), la hidrólisis de esculina y gelatina, y el uso de citrato se examinaron usando tiras de API 20 E y API 20 NE (Biomerieux) (Cavallo et al. 2009). La hidrólisis de quitina y alginato se determinó según lo descrito por Ortigosa et al. (1994). La producción de amilasa y lipasa se realizó siguiendo el método propuesto por Bairagi et al. (2002).

Los datos cuantitativos se elaboraron estadísticamente con el programa Statgraphic Plus. Los valores de temperatura, salinidad, pH, CBA y FL (%) en cada sitio se presentan como la media ± desviación estándar. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la prueba post hoc de Bonferroni. Las diferencias se consideraron significativas y la hipótesis nula fue rechazada cuando P ≤ 0.01.

Los resultados de la caracterización fenotípica se clasificaron como 1 y 0 para resultados positivos y negativos, resectivamente, y 9 para datos no comparables. La matriz de datos, excluyendo los parámetros para los cuales no se registraron variaciones, se analizó con NTSYSpc 2.0. Las similitudes se calcularon usando el coeficiente de apareamiento simple (S_SM). La agrupación se logró mediante el método de agrupamiento por promedio aritmético de los grupos de pares no ponderados (UPGMA). La correlación entre los valores respectivos en la matriz de similitud y el dendrograma correspondiente (correlación cofenética) se calculó para cada coeficiente con el coeficiente de correlación cofenética (r).

Resultados

Los resultados de las detecciones físicas se presentan en la tabla 1. No se encontraron diferencias significativas (ANOVA de una vía) a un nivel de confianza de 99.0% entre los tres sitios.

Las mediciones de las bacterias heterótrofas totales (CBA) y el componente de luminosidad relativa (FL) se muestran en la tabla 2. Los conteos de CBA en las localidades de muestreo variaron de 30.50 UFC mL^-1 (sitio 3) a 91.75 UFC mL^-1 (sitio 1) y los valores de FL de 5.44% (sitio 1) a 13.44% (sitio 3). El ANOVA de una vía mostró diferencias estadísticamente significativas al nivel de confianza de 99.0% entre los sitios 1 y 3 para los conteos de CBA así como los valores de FL.

El dendrograma simplificado, obtenido mediante S_M y UPGMA, de las características fenotípicas de las BL se muestra en la figura 2. Para identificar las cepas silvestres, también se incorporaron en la matriz de datos las características fenotípicas descritas anteriormente para bacterias luminosas. Algunas características que diferencian los grupos fenotípicos se presentan en la tabla 3.

Se suprimieron diez pruebas de la matriz de datos ya que proporcionaron respuestas ya sea positivas (i.e., prueba de Kovacs para citocromo oxidasa, catalasa, O/F, movilidad) o negativas (i.e., Gram, producción de H₂S) para todas las cepas examinadas. La matriz de datos final incorporó información de 116 cepas y 25 parámetros. El coeficiente de correlación cofenética (r) fue 0.95. Se definieron cinco grupos con valores de S_SM >86%. Las bacterias del grupo I (S_SM 86.7%) incluyeron 14 cepas catalasa negativa. Las características de estos aislamientos son similares a los descritos previamente para P. leiognathi ATCC 25521 (Nogi et al. 1998, Caccamo et al. 1999, López-Caballero et al. 2002). Las bacterias del grupo II (S_SM 89.0%) incluyeron 16 cepas con un pigmento amarillo que presentan patrones bioquímicos idénticos a los de V. fischeri ATCC 7744 (Lunder et al. 2000). Las bacterias del grupo III (S_SM 90.1%) incluyeron 80 cepas, cuyas características coinciden con las de V. harveyi ATCC 14126 (Yang et al. 1983, Farto et al. 1999). Las bacterias del grupo IV (S_SM 96.0%) incluyeron dos cepas con características similares a las de V. splendidus biovar I ATCC 33125; los rasgos de este grupo concuerdan con la descripción de Farto et al. (1999) excepto para crecimiento a 35 °C, el cual es positivo para las cepas aisladas. Las bacterias del grupo V (S_SM 88.0%) incluyeron cuatro cepas que muestran patrones bioquímicos idénticos a los descritos para S. hanedai ATCC 33224 (Makemson et al. 1997, Venkateswaran et al. 1999, Satomi et al. 2003).

El análisis de frecuencia de aislamiento de bacterias luminosas (tabla 4) mostró que la distribución de especies luminosas fue similar en todos los sitios de muestreo (P > 0.01). Las bacterias del grupo III fueron las que se aislaron con mayor frecuencia, entre 68.4% (sitios 2 y 3) y 70% (sitio 1).

Discusión

En el presente estudio se caracterizaron las bacterias heterótrofas viables así como la abundancia de las BL mediante variaciones espaciales, que pueden estar relacionadas con actividades humanas como el manejo de aguas residuales de las zonas urbanas y activadades portuarias. Varios autores (Ramaiah y Chandramohan 1993, Bacci et al. 1994, Sbrilli y Cruscanti 1999, Nocciolini et al. 2000, Perego et al. 2002, De Donno et al. 2008, Wang et al. 2009) han sugerido que la abundancia de bacterias heterótrofas marinas y la FL relativa pueden utilizarse como indicadores de la calidad del agua en cuanto al ingreso de contaminantes en ambientes marinos. Los conteos bacterianos elevados indican un aumento en la tasa de respiración asociado con contaminación orgánica, mientras que un componente luminoso reducido o ausente puede indicar la presencia, en concentraciones efectivas, de sustancias tóxicas (Sbrilli et al. 1997).

De Donno et al. (2008) describieron la distribución de contaminantes de actividades portuarias y urbanas en la bahía de Otranto. Ellos encontraron que la contaminación de origen fecal y la concentración de sustancias tóxicas eran altas en la rada portuaria pero disminuían mar adentro.

Los resultados de nuestro estudio sugieren que en el sitio localizado mar adentro la comunidad bacteriana probablemente se encuentra en un estado de relativa estabilidad debido al nivel muy bajo o ausencia de materia orgánica y sustancias tóxicas. En estas condiciones, se observa una concentración mínima de bacterias viables y una abundante FL. En contraste, el mayor número de bacterias heterótrofas totales y una menor FL en las muestras de agua recolectadas en el puerto (sitio 1) reflejan niveles más altos de compuestos orgánicos y/o toxinas que resultan de las actividades portuarias.

El impacto humano que se observa en los tres sitios puede afectar la luminosidad bacteriana in vivo. De hecho, como lo documentaron Dunlap y Kita-Tsukamoto (2006), la actividad del sistema de bioluminiscencia es parte de la respuesta celular a estrés asociado con una limitación de nutrientes y una decreciente tasa de crecimiento.

En este estudio se encontró que las BL cultivables en las aguas costeras someras del sur del mar Adriático durante la temporada relativamente cálida están dominadas por V. harveyi, seguidas por V. fischeri y P. leiognathi. Esta distribución es similar a la encontrada en otros estudios basados en la caracterización fenotípica de BL marinas en aguas marinas templadas.

Más del 90% de las BL aisladas de muestras recolectadas en el mar de los Sargazos fueron V. harveyi y V. fischeri, y el resto fueron P. leiognathi y P. phosphoreum (Orndorff y Colwell 1980). Asimismo, V. harveyi y V. fischeri constituyeron 99% de las BL aisladas de aguas superficiales de la costa de California, la primera predominando (60-70%) en el verano pero siendo totalmente reemplazada por la segunda en el invierno (Ruby y Nealson 1978).

La baja abundancia de S. hanedai y V. splendidus y la ausencia de V. logei, P. phosphoreum, V. orientalis y S. woodyi en el presente estudio podrían explicarse por la naturaleza psicrofílica de estas especies, las cuales tienen un crecimiento óptimo a temperaturas inferiores a 18 °C y consecuentemente viven mejor en aguas frías (Nishiguchi 2000, Kato y Nogi 2001, Maeda et al. 2003). La frecuencia de especies luminosas fue similar en los tres sitios (tabla 4). Por lo tanto, se supone que las actividades humanas en el área de estudio tienen un efecto en la abundancia relativa de las BL pero no en la selección de especies individuales.

En resumen, este estudio confirma que las bacterias luminosas distribuidas en las aguas costeras templadas están compuestas principalmente por V. harveyi, V. fischeri y P. leiognathi, la primera siendo la especie predominante. Es posible aislar unas cuantas otras especies pero con menor frecuencia.

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Traducido al español por Christine Harris.