Efecto de los polisacáridos de Porphyridium cruentum sobre la actividad de la línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7*
Effect of Porphyridium cruentum polysaccharides on the activity of murine macrophage cell line RAW 264.7
RT Abdala–Díaz1, M Chabrillón2, A Cabello–Pasini3, B López–Soler2, FL Figueroa1
1 Department of Ecology, Faculty of Sciences, University of Málaga, 29071 Málaga, Spain.
2 Centro Mediterráneo de Fotobiología, c/Prosper Merimeé 7, 29007 Málaga, Spain.
]]> 3 Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California, Km 107 Carretera Tijuana–Ensenada, Ensenada, 22860, Baja California, México. E–mail: acabello@uabc.edu.com
Received March 2010
Accepted August 2010
RESUMEN
Las algas rojas se han considerado como una fuente importante de polisacáridos con propiedades inmunomodulatorias potenciales. Los polisacáridos de la pared celular del alga roja Porphyridium cruentum pueden componer más de 50% de su biomasa; sin embargo, poco se sabe sobre su composición bioquímica y sus propiedades inmunomoduladoras. Consecuentemente, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de los polisacáridos de P. cruentum sobre la producción del factor de necrosis tumoral–α (TNF–α), de interleucina–6 (IL–6) y de óxido nítrico (NO). Los polisacáridos de P. cruentum se extrajeron y purificaron mediante una precipitación con bromuro de N–cetilpiridinio, y se caracterizaron por espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier. El efecto de la actividad de la línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7 fue examinada mediante una cuantificación de la producción de TNF–α, IL–6 y NO utilizando un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. Los resultados mostraron que los polisacáridos de P. cruentum indujeron la acumulación de TNF–α e IL–6. La producción de TNF–α fue significativamente más alta que la observada en el control (lipopolisacárido bacteriano, LPS) cuando la concentración de polisacáridos fue mayor a 6.25 µg mL–1. El añadir niveles de polisacáridos arriba de 25 µg mL–1 produjó niveles de IL–6 que fluctuaron entre 3.4 y 4 ng mL–1, lo cual fue similar a la producción de IL–6 inducida con 50 ng mL–1 de LPS (3.3 ± 0.3). En contraste a IL–6 y TNF–α, la producción de NO sólo fue detectada cuando las concentraciones de polisacáridos fueron mayores que 25 µg mL–1. Estos resultados indican por primera vez que los polisacáridos de P. cruentum inducen activamente la producción de citoquinas.
Palabras clave: microalga roja, Porphyridium cruentum, inmunomodulador, macrófago, espectroscopía FTIR.
ABSTRACT
]]> Red algae are considered an important source of polysaccharides with potential immunomodulatory properties. Polysaccharides from the cell wall of the red alga Porphyridium cruentum can compose more than 50% of its biomass; however, little is known regarding its biochemical composition and phage–modulatory properties. Consequently, this study aimed to evaluate the effect of P. cruentum polysaccharides on tumor necrosis factor–α (TNF–α), interleukin–6 (IL–6), and nitric oxide (NO) production. Polysaccharides from P. cruentum were extracted and purified by N–cetylpyridinium bromide precipitation and characterized by Fourier transform infrared spectroscopy. The effect on the activity of murine macrophage cell line RAW 264.7 was examined by quantification of TNF–a, IL–6, and NO production using enzyme–linked immunosorbent assays. The results showed that the polysaccharides from P. cruentum induced TNF–a and IL–6 cytokine accumulation. The production of TNF–α was significantly higher than that in the control (bacterial lipopolysaccharide, LPS) when the concentration of polysaccharides was higher than 6.25 µg mL–1. The addition of polysaccharide levels above 25 µg mL–1 produced IL–6 levels ranging from 3.4 to 4 ng mL–1, which were comparable to the production of IL–6 induced by 50 ng mL–1 of LPS (3.3 ± 0.3). In contrast to IL–6 and TNF–α, NO production was only detected when polysaccharide concentrations were higher than 25 µg mL–1. These results indicate for the first time that polysaccharides from P. cruentum are strong cytokine inducers.Key words: red microalga, Porphyridium cruentum, immunomodulator, macrophages, FTIR spectroscopy.
INTRODUCCIÓN
La microalga roja Porphyridium cruentum unicelular (Porphyridiaceae) está encapsulada por una pared celular con polisacáridos sulfatados. Esta microalga ha demostrado tener múltiples aplicaciones en la industria biotecnológica, tal como la producción de ácido araquidónico, pigmentos (ficocianina, ficoeritrina) y polisacáridos extracelulares (Pulz y Gross 2004). Los polisacáridos de la pared celular de P. cruentum (peso molecular 5–7 × 106 Da) constituyen hasta el 50–70% de la materia seca del alga. La caracterización de estos polisacáridos mediante cromatografía de exclusión de tamaño y resonancia magnética nuclear (NMR) ha revelado que el grupo funcional de estos azúcares está compuesto por monosacáridos neutros. Los polisacáridos de la pared celular de P. cruentum están compuestos principalmente por xilosa (38%), glucosa (24%), galactosa (22%) y ácido glucurónico (10%); sin embargo, también pueden encontrarse la arabinosa, la ramnosa y la manosa en concentraciones menores (Geresh y Geresh 1991, Gloaguen et al. 2004, Geresh et al. 2009).
Se ha demostrado que los azúcares de la pared celular de las algas generan respuestas bioquímicas y fisiológicas en un gran número de vertebrados. Los polisacáridos de P. cruentum, por ejemplo, inhiben la replicación viral y son un potente agente hipocolesterómico en ratas y gallinas (Fábregas et al. 1999, Dvir et al. 2000, Ginzberg et al. 2000, Huheihel et al. 2002, Talyshinsky et al. 2002). Además, estos polisacáridos promueven la actividad antioxidante, lo que sugiere un mecanismo de protección celular contra especies reactivas de oxígeno (Tannin–Spitz et al. 2005). Aunado a lo anterior, la administración in vivo de polisacáridos exocelulares de P. cruentum a ratones ha resultado en un incremento de la población de macrófagos así como un incremento de la enzima ácido fosfatasa (Werner y Jolles 1996, Morris–Quevedo et al. 2000).
Se ha reportado que los polisacáridos aislados de algas tienen la capacidad de modificar la actividad de macrófagos al inducir la producción de citoquinas y óxido nítrico (NO) (Schepetkin y Quinn 2006). Los macrófagos representan una parte esencial del sistema natural de defensa antitumoral. La modulación de la función de los macrófagos puede ayudar a incrementar la fagocitosis, la actividad antimicrobial, la quimiotaxis y la presentación antígena a células T, por tanto sirve como estrategia preventiva y terapéutica contra algunas enfermedades (Desai et al. 2007). La defensa de macrófagos contra patógenos lleva en sí la secreción de citoquinas como la interleucina–6 (IL–6), el factor de necrosis tumoral–α (TNF–α) y los mediadores antiinflamatorios como el NO. La liberación de TNF–α y el factor de transformación de crecimiento (TGF–β) representan un aspecto de la acción antitumoral de los macrófagos. La función primaria del TNF–α es la regulación de los leucocitos y causa la muerte celular por inflamación y replicación viral. El TNF–α es una citoquina involucrada en la inflamación sistémica y es un miembro del grupo de citoquinas que estimulan la fase de reacción aguda. De igual manera, la IL–6 es una citoquina multifuncional que regula diversas respuestas inmunes, incluyendo la fase de reacción aguda, y funciona como mediador en la respuesta inflamatoria. Su producción es inducida por varios factores incluyendo el TNF–α, la IL–1β, así como la endotoxina bacteriana lipopolisacárido (LPS) (Martínez et al. 1998). Mientras que se ha demostrado que los azúcares de algas aumentan la síntesis de citoquinas, poco se sabe sobre las propiedades inmunomoduladoras de los polisacáridos de P. cruentum.
Se sabe también que la liberación de NO por macrófagos está relacionada con la defensa antitumoral. Existen evidencias recientes que indican que el NO puede interactuar con aniones superóxidos, producidos y transformados por las células, y, consecuentemente, generar el inductor de apoptosis, el peroxinitrito. El NO es un radical libre endógeno que se produce a partir de L–arginina por la óxido nítrico sintasa (NOS), una familia de enzimas ubicuas (Fang et al. 2005). El óxido nitroso sincroniza una variedad de mensajes entre células, incluyendo señales de vaso–relajación, neurotransmisión y citotoxicidad. Se sabe que la actividad de NOS es inducida por la exposición de las células a citoquinas y productos bacterianos (Xie et al. 1992). En consecuencia, el objetivo de este estudio fue caracterizar los polisacáridos extraídos de P. cruentum y evaluar su efecto sobre la producción de citoquinas, tales como el TNF–α, la IL–6 y el NO, para establecer su rol potencial como inmunomoduladores.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> Extracción de polisacáridosSe cultivaron células de P. cruentum en un medio de Porphyridium (Vonshak 1988) a 25°C, con un fotoperiodo de 12:12 L:O por 7 d (tubo fluorescente). Los cultivos fueron inoculados a una densidad celular de 5 × 105 cél mL–1 y el pH del cultivo se mantuvo a 7.5. Cuando los cultivos alcanzaron la fase estacionaria se centrifugaron (10,000 × g, 10 min) y el sobrenadante se utilizó para la extracción de polisacáridos. Los polisacáridos se extrajeron mediante una precipitación selectiva con bromuro de N–cetilpiridinio (Cetavlon) 2% (w/v). El polisacárido ácido precipitado se purificó con 4 M NaCl, y posteriormente los polisacáridos se flocularon con etanol (96%), centrifugaron (10,000 × g, 10 min), dializaron contra 2 M NaCl y finalmente se liofilizaron (Lyophilizer Cryodos, Telstar).
Se prepararon soluciones stock de polisacáridos (10 mg mL–1) en dimetilsulfóxido (DMSO) y se almacenaron a –20°C. Justo antes de ser usada, la solución stock se diluyó en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). La concentración final de DMSO fue menor que 0.1% y no afectó la proliferación de células. Una solución de DMSO al 0.1% fue utilizada como control.
Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier
Se obtuvieron espectros infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) utilizando discos prensados de la mezcla de polisacáridos y KBr (1% w/w), y generando discos de 16 mm de diámetro con una presión hidrostática de 15.0 t cm2 por 2 min. Los espectros FTIR se determinaron con un espectrofotómetro infrarrojo (Thermo Nicolet Avatar 360, Thermo Electron Inc., San Jose, California, EUA) con una resolución de 4 cm–1, un detector DTGS y el programa OMNIC 7.2 (ancho de banda 50 cm–1, factor de enriquecimiento 2.6). Los espectros se obtuvieron en la región 4000–400 cm–1. El ajuste de línea base se generó utilizando el programa del espectrofotómetro (Thermo Nicolet OMNIC) para aplanar la línea base en cada espectro. El algoritmo de correlación del programa OMNIC se utilizó para comparar los espectros de las muestras contra los espectros de una biblioteca (Thermo Fisher Scientific).
Cultivo de células macrófagas
La línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7 (ATCC, USA) se cultivó rutinariamente en un medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal de bovino, 2 mM L–glutamina, 100 unidades mL–1 de penicilina sódica, 0.1mgmL–1 de estreptomicina sulfatada y 0.25 µg mL–1 de anfotericina B. Las células se cultivaron a 37°C con aire humedecido que contenía 5% CO2. Las células cultivadas se cosecharon mediante un raspado ligero. Se utilizaron las células cuando la confluencia había alcanzado un 75%.
Ensayo de proliferación de macrófagos
Las células RAW 264.7 (5 × 103 cél celda–1) se incubaron con diferentes concentraciones de polisacáridos (0–75 µg mL–1) por 48 h a 37°C y 5% CO2. La proliferación de macrófagos se estimó mediante el ensayo MTT (bromuro de 3–(4,5–dimetiltiazol–2–yl)–2,5–difenil tetrazolio). Después, se añadió un volumen de 10 de la solución MTT (5 mg mL–1 en solución tampón fosfato salino, PBS) a cada celda y las placas fueron incubadas a 37°C por 4 h. La sal amarilla de tetrazolium es reducida por deshidrogenasas mitocondriales en células metabólicamente activas para formar cristales púrpuras insolubles, los cuales se disuelven mediante la adición de isopropanol acidificado (100 µL de 0.04N HCl en isopropanol). La absorbancia se determinó a 550 nm utilizando un lector de microplacas (2001 Whittaker, Bioproducts) y la viabilidad relativa de las células se expresó como el porcentaje medio de células viables comparado con células no tratadas.
Determinación de citoquinas
]]> Las células RAW se cultivaron en presencia de diferentes concentraciones de polisacáridos (0–75 µg mL–1) en microplacas de 24 celdas (5 × 105 cél celda–1), en un volumen total de 1 mL. Se utilizó el LPS bacteriano (50 ng mL–1) como un control positivo para la activación de los macrófagos. El sobrenadante se recolectó después de una incubación de 48 h y se utilizó para determinar la producción de citoquinas después de la estimulación por polisacáridos. La producción de TNF–α e IL–6 se determinó mediante un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo con el protocol descrito por Martínez et al. (1998). Posteriormente, se utilizaron los anticuerpos purificados TNF–α o IL–6 monoclonales de rata antiratón (0.5 mg, BD Pharmingen) para cubrir las celdas a una concentración de 2 µg mL–1 a 4°C por 16 h. Después de lavar y bloquear con tampón fosfato salino (PBS) conteniendo 3% de albúmina de suero bovino, se añadieron los sobrenadantes de los cultivos a cada una de las celdas por 12 h a 4°C. El material no fijado se lavó y se añadieron los anticuerpos monoclonales biotinilzados antiratón de TNF–a o IL–6 (0.5 mg, BD Pharmingen) a una concentración de 2 µg mL–1 por 2 h. Los anticuerpos fijos se detectaron mediante la adición de avidina peroxidasa (Sigma) por 30 min y la adición posterior de una solución sustrato de ABTS. La absorbancia a 405 nm se monitoreó después de 10 min de la adición del sustrato. Se construyó una curva estándar usando varias diluciones de murina recombinante de TNF–a o IL–6 en PBS que contenían 10% (suero fetal de ternera) FCS. La cantidad de cada citoquina en los sobrenadantes de los cultivos se determinó por la extrapolación de las absorbancias a la curva estándar.Ensayo de producción de nitrito
La acumulación de nitrito (NO2) en las celdas tratadas con polisacáridos de Porphyridium se utilizó como un indicador de la producción de NO en el medio. El sobrenadante sin células (90 µL) fue incubado con el mismo volumen de reactivo de Griess (1% sulfanilamida, 0.1% diclorhidrato de naftilendiamina, 0.5% H3PO4) a temperatura ambiente por 5 min, y la absorbancia se determinó en un lector de microplacas (2001 Whittacker, Bioproducts) a 550 nm. La concentración de NO2 se determinó a partir de una regresión lineal usando NaNO2 para generar una curva estándar.
Análisis estadistico
Los datos se presentaron como promedios ± desviación estándar (DE) de tres experimentos (n = 3). La evaluación estadística se realizó utilizando la prueba t de Student para muestras pareadas y la significancia estadística de las diferencias se consideró en P < 0.05.
Resultados
Espectroscopía FTIR
La espectrosocopía FTIR de los polisacáridos obtenidos de los cultivos de P. cruentum reveló la presencia de varias bandas (fig. 1). La máxima absorbancia se observó en un pico ancho a aproximadamente 3384 cm–1. También se observaron bandas intensas a aproximadamente 2930, 2069, 1642, 1013–1153 y 1240 cm–1.
Los resultados del ensayo MTT indicaron que los polisacáridos obtenidos de P. cruentum no son tóxicos cuando los macrófagos están en contacto con ellos.
Producción de citoquina y NO
La síntesis y acumulación de citoquinas se incrementó como una respuesta al incremento de los niveles de polisacáridos de Porphyridium (figs. 2, 3). Se observó un incremento lineal de cinco veces más de TNF–α a medida que la concentración de polisacáridos incrementó de 0 a 75 ug mL–1 (fig. 2). La producción de TNF–α fue significativamente más alta que la del control cuando la concentración de polisacáridos fue mayor que 6.25 |ig mL–1. De manera similar a la tendencia del TNF–α, los niveles de IL–6 se incrementaron linealmente de 0 a ~3.5 ng mL–1 cuando la concentración de polisacáridos se incrementó de 0 a 25 µg mL–1; sin embargo, los niveles de IL se saturaron cuando la concentración de polisacáridos se incrementó a niveles mayores que 25 µg mL–1 (fig. 3). El tratamiento de células RAW con LPS (50 ng mL–1) causó un incremento significativo en la producción de TNF–α alcanzando valores de 23.6 ± 3.8 ng mL–1. En contraste, la concentración de NO se incrementó significativamente (75%, P < 0.05) cuando las células RAW se incubaron con niveles de polisacáridos mayores que 50 µg mL–1 (fig. 4); sin embargo, cuando se añadió el LPS, el nivel de NO alcanzó 16.3 µM.
DISCUSIÓN
La espectroscopía FTIR reveló la presencia de grupos OH, C–H, C–O y S = O en los polisacáridos solubles de P. cruentum. El pico ancho e intenso a aproximadamente 3384 cm–1 es indicativo de grupos hidroxilo, mientras que el pequeño pico a los 2930 cm–1 es más característico de enlaces C–H en polisacáridos de algas rojas (Pereira et al. 2009). El pico a 2069 cm–1 también indica la presencia de enlaces C–H alifáticos en los polisacáridos de P. cruentum. El pico a 1642 cm–1 y los picos cerca de 1013–1153 cm–1 sugieren la presencia de grupos C–O. Por otro lado, el pico de alta intensidad a los 1240 cm–1 puede ser atribuido a la vibración de los grupos de ésteres sulfatados (S = O ), los cuales están asociados con la distribución espacial de los grupos sulfatados. La comparación de este espectro con los datos de la biblioteca de Thermo Fisher Scientific indicó que el polisacárido de P. cruentum tiene una similitud de 61.6% con el de β–Escin, un polisacárido que se encuentra en semillas de Aesculus hippocastanum. Este polisacárido es un compuesto terpeno glicosídico derivado de la aglicona protoescigenina o el barringtogenol C. Existe evidencia clínica exitosa de este terpeno en insuficiencia crónica venosa, hemorroides y edema postoperativo (Fu et al. 2005). La similitud entre el polisacárido de P. cruentum y β–Escin sugiere que podrían tener modos de acción similares. Además, los polisacáridos de P. cruentum analizados en este estudio presentaron picos similares a los observados por Geresh et al. (2009). Los resultados del presente trabajo demuestran que el polisacárido de P. cruentum tiene características aniónicas (cargada negativamente) debido a la presencia de ácido D–glucorónico (GlcA) y de grupos de sulfatos semiésteres. Además, el polisacárido está constituido por carbohidrato en un 67%, ceniza 10%, ácido urónico 9% y 10% semiéster sulfato.
Este estudio demuestra que los polisacáridos solubles de P. cruentum estimularon la producción de ambos TNF–α e IL–6 en macrófagos de la línea celular RAW 264.7. Se ha reportado que los extractos de otras especies de algas incrementan la fagocidad y la actividad de secreción de los macrófagos (Schepetkin y Quinn 2006). Entre éstas, Porphyra yezoensis indujo la producción de nitrito y TNF–α in vitro e in vivo por macrófagos mourinos (Yoshizawa et al. 1993). De manera similar, Yim et al. (1993) demostraron que el exopolisacárido p–KG03 que contiene altos niveles de sulfato, producido por la microalga Gyrodinium impudicum cepa KG03, incrementó la producción de citoquinas macrófagas, tales como IL–1 P y IL–6, así como TNF–α. En este estudio se ha demostrado que los polisacáridos de P. cruentum también inducen la liberación de citoquinas de una manera comparable en amplitud con la observada en el inductor de citoquinas LPS. Otros estudios también han demostrado que los polisacáridos de P. cruentum exhiben efectos antioxidantes y antiinflamatorios, además de una actividad antiproliferativa en varios linajes de células cancerígenas humanas (Bergé et al. 2002).
Los resultados del presente trabajo indican que el efecto de los polisacáridos solubles de P. cruentum sobre los macrófagos RAW puede deberse a las diferentes fracciones presentes en el extracto como fue revelado por la espectroscopía FTIR; sin embargo, se necesitan otros estudios para probar esta hipótesis.
Se ha informado que los polisacáridos ácidos del alga verde Ulva rigida inducen más de dos veces la expresión de las siguientes quimioquinas: quimioquina (motivo C) ligando 1, quimioquina (motivo C–X–C) ligando 12, quimioquina (motivo C–C) ligando 22 y quimioquina (motivo C–X–C) ligando 14 (CXCL14) (Leiro et al. 2007). Adicionalmente, se ha demostrado que los polisacáridos de U. rigida incrementan la expresión de la señal del transductor IL–6 e IL–12 receptor beta 1. Más aún, se ha demostrado que la incubación de macrófagos RAW con polisacáridos de U. rigida también inducen un incremento en la producción de nitrito; sin embargo, este efecto decreció considerablemente después de una desulfitación de los polisacáridos, lo que sugiere que el grupo sulfato es importante en la activación de macrófagos. Por otro lado, existen reportes sobre los constituyentes del alga roja Gracillaria verrucosa que indican que son inhibidores de la producción de mediadores proinflamatorios (NO, IL–6 y TNF–a) (Dang et al. 2008).
Las preparaciones de polisacáridos de alto peso molecular, aislados de microalgas de grado alimenticio, han sido descritas como potentes activadoras de macrófagos/ monocitos humanos (i.e., "Immulina" de Spirulina platensis, "Immunon" de Aphanizomenon flos–aquae e "Immurella" de Chlorella pyrenoidosa; Pugh et al. 2001). Cada uno de estos polisacáridos incrementa sustancialmente los niveles del mRNA de IL–1 P y TNF–a y son entre cien y mil veces más activos para la activación in vitro de monocitos que las preparaciones de polisacáridos que son utilizados clínicamente en la actualidad para la inmunoterapia de cáncer. Según los resultados del presente trabajo, el incremento en las concentraciones de TNF–a, IL–6 y NO cuando las células RAW se incubaron con polisacáridos de P. cruentum sugiere que estos azúcares también podrían ser activadores de macrófagos.
Aunque hay una falta de conocimiento sobre los mecanismos moleculares involucrados en la activación de los macrófagos por medio de los polisacáridos de algas, se sugiere que la función inmune podría ser similar a la observada para estructuras de polisacáridos derivadas de plantas y hongos (Schepetkin y Quinn 2006). Más aún, su efecto sobre la inmunomodulación de macrófagos podría ser considerado para desarrollar productos farmacéuticos que se puedan aplicar cuando se requiera una activación de macrófagos.
AGRADECIMIENTOS
]]> Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Industria, Turismo y Comercio (BIODERMALG PROFIT–010000–2006–122) y el Ministerio de Educación y Ciencia (BIFARO–AGL2005–02655) de España. Se agradece a RM Sánchez (Thermo Electron Fisher), MA Vargas y L Alemany su asistencia técnica en los análisis de espectroscopía FTIR y a N Varela su apoyo técnico.
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