Extraction and purification of B–phycoerythrin from the red microalga Rhodosorus marinus*

Extracción y purificación de B–ficoeritrina de la microalga roja Rhodosorus marinus

GA Básaca–Loya¹, MA Valdez², EA Enríquez–Guevara¹, LE Gutiérrez–Millán³, MG Burboa³*

¹ Departamento de Investigación en Polímeros y Materiales, Universidad de Sonora, Blvd. Luis Encinas y Rosales S/N, Col. Centro, A.P. 1819, Hermosillo, CP 83000, Sonora, México.

² Departamento de Física y Departamento de Investigación en Polímeros y Materiales, Universidad de Sonora, Blvd. Luis Encinas y Rosales S/N, Col. Centro, Hermosillo, CP 83000, Sonora, México.

Recibido en mayo de 2009.
Aceptado en octubre de 2009.

Abstract

A description is given of the purification of B–phycoerythrin (B–PE) from the red microalga Rhodosorus marinus. Initially, phycobiliproteins were released from the microalgal cells by manual cellular fragmentation and sonication. B–PE was extracted with ammonium sulfate precipitation, and purified by anionic and size exclusion chromatography. Its purity was tested using indexes and sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Spectroscopic characterization of B–PE was performed by UV–visible spectroscopy, fluorescence spectroscopy, and circular dichroism. Rhodosorus marinus showed three types of phycobiliproteins: phycoerythrin, phycocyanin, and allophycocyanin. The purified B–PE showed a purity ratio (A₅₄₅/A₂₈₀) of 4.8, characteristic peaks at 540 and 562 nm with a shoulder at 498 nm, fluorescence emission maximum at 578 nm, and a secondary structure almost stable with pH changes. B–PE was found to be the predominant pigment in R. marinus and this red microalga could be a viable option for the recovery of this chromoprotein.

Key words: microalgae, phycobiliproteins, phycoerythrin, pigments, Rhodosorus marinus.

Resumen

Palabras clave: microalgas, ficobiliproteínas, ficoeritrina, pigmentos, Rhodosorus marinus.

Introducción

Las ficobiliproteínas actúan como pigmentos accesorios para la fotosíntesis en algas marinas de las Rhodophyceae, Cyanophyceae, Cryptophyceae y algunas Pirrophyceae (Gantt 1975, Ma et al. 2003). Se encuentran organizadas en estructuras celulares, llamadas ficobilisomas, las cuales están unidas en conjuntos regulares a la superficie exterior de los tilacoides. Las ficobiliproteínas son solubles en agua y están compuestas de subunidades α, β y γ de las ficoeritrinas (Wang et al. 1998), cada una de las cuales consiste de una apoproteína y uno o más tipos de grupos prostéticos tetrapirrólicos de cadena abierta (cromóoros llamados bilinas) unidos mediante enlaces covalentes a los residuos específicos de cisteína de las apoproteínas (Glazer 1981). Las propiedades espectroscópicas de las biliproteínas individuales dependen principalmente de la naturaleza química de sus bilinas (MacColl y Guard–Friar 1983, Glazer 1989, Grossman 1990, Holzwarth 1991, Moerschel 1991). Las ficobiliproteínas se dividen en tres clases según sus propiedades de absorción: ficoeritrinas (λ_max ~ 540–570 nm), las cuales contienen los cromóforos ficoeritrobilina y ficourobilina; ficocianinas (λ_max ~ 610–620 nm), que contienen ya sea una mezcla de los cromóforos ficocianobilina y ficoeritrobilina o sólo ficocianobilina, según la especie de origen; y aloficocianinas (λ_max ~ 650–655 nm), con ficocianobilina como grupo prostético (Glazer 1984, Bermejo et al. 2003). Los cromóforos dan un color característico a cada ficobiliproteína: rojo a la ficoeritrina, azul brillante a la ficocianina, y verde azulado a la aloficocianina. Se ha encontrado que las principales clases de ficoeritrinas difieren en sus características de absorción: las B–ficoeritrinas muestran λ_max ~ 565 y 546 nm, con un hombro a ~499 nm; las R–ficoeritrinas λ_max ~ 568 y 499 nm, con un hombro a ~545 nm; y las C–ficoeritrinas λ_max ~ 565 nm (Hilditch et al. 1991, D'Agnolo et al. 1994, Bermejo et al. 2001).

Entre las ficobiliproteínas, la B–ficoeritrina (B–PE) es un importante pigmento para la captación de luz por las microalgas rojas, y es la más valiosa de las tres clases de ficoeritrinas (B, R y C) debido a su gran eficiencia de fluorescencia y su intenso y particular color rosa. Por lo tanto, es ampliamente utilizada como una sonda fluorescente y reactivo analítico, además de emplearse como un tinte natural en alimentos y cosméticos (Bermejo et al. 2003), así como para desarrollar biosensores (Martek Corporation, http://www.marketbio.com) (Ayyagari et al. 1995, Haugland 1996, Bermejo et al. 2002, Benavides y Rito–Palomares 2004). También se ha mostrado que las ficobiliproteínas poseen un valor terapeútico debido a sus actividad inmunomoduladora y anticarcinogénica (Iijima y Shimamatsu 1982).

A la fecha, se han propuesto métodos muy diferentes para la purificación de las ficobiliproteínas de microalgas. Generalmente se obtienen ficobiliproteínas puras de extractos crudos de algas mediante una combinación de diversos métodos cromatográficos y la precipitación con sulfato de amonio (Gray y Gantt 1975, Grabowski y Gantt 1978, Duerring et al. 1991, Ficner et al. 1992, Bermejo et al. 1997, Tchernov et al. 1999). La mayoría de los métodos propuestos consta de dos pasos: primero se extraen las ficobiliproteínas de la biomasa y después se purifica el extracto obtenido. El estudio original realizado por Glazer y Hixson (1975) sobre la purificación de la B–PE consistió en un esquema de tres pasos cromatográficos, el cual ya ha sido simplificado a dos pasos (Yu et al. 1981, Schoelember et al. 1983, Bermejo et al. 2003, Rossano et al. 2003). En el presente trabajo se utilizaron diferentes métodos para la extracción de proteínas, y posteriormente cromatografía de exclusión por tamaño e intercambio aniónico para su purificación.

Porphyridium cruentum es una microalga roja que ha sido bien estudiada y utilizada para la obtención de B–PE (Schoelember et al. 1983; Hilditch et al. 1991; D'Agnolo et al. 1994; Bermejo et al. 2001, 2002, 2003; Ma et al. 2003; Rossano et al. 2003; Benavides y Rito–Palomares 2004). En este estudio se describe la B–PE de Rhodosorus marinus, un alga que muestra potencial para la producción biotecnológica de esta proteína. Es una especie cosmopolita, y de gran interés ya que el valor industrial y comercial de este producto es considerable; no obstante, hasta ahora, no se cuenta con ningún informe científico sobre la B–PE de R. marinus.

Materiales y métodos

En este trabajo se utilizó la microalga roja R. marinus proporcionada por UTEX (1723). Las microalgas fueron cultivadas por lotes (tubos de ensayo de 10 mL, frascos Erlenmeyer de 250 mL y garrafones de 18 L) durante 25 días, bajo las siguientes condiciones: medio de cultivo Ersdchreiber (Rosowski y Parker 1971), burbujeo continuo de aire hasta el nivel de 12 L, 25°C, iluminación lateral con lámparas fluorescentes (blanco frío) a una densidad del flujo de fotones de 215 µE m^–2 s^–1 medida en la superficie de los frascos de 250 mL, y un ciclo circadiano de 12 h de luz y 12 h de oscuridad. Las microalgas fueron decantadas y cosechadas mediante centrifugación a 3000 rpm por 5 min (Marathon 8K Fisher Scientific). Ver el trabajo de Básaca–Loya et al. (2008).

Preparación y fraccionación del extracto crudo

Las células algales (4 g de biomasa seca) se enjuagaron con amortiguador de fosfato de sodio 0.01 M que contenía NaCl 0.1 M (pH 7.0) (Rossano et al. 2003) y se resuspendieron en el amortiguador de fosfato de sodio/NaCl 0.01 M (pH 7.0). La suspensión fue congelada a –20°C, descongelada y sonicada durante 30 min, realizándose la fragmentación celular de forma manual en una olla de cerámica. La eliminación de restos celulares se logró mediante centrifugación a 5000 rpm a 4°C por 10 min. El sobrenadante se consideró el extracto crudo y el precipitado se descartó. El extracto crudo obtenido se saturó con sulfato de amonio al 40%, se agitó durante 3.5 h y se dejó reposar a 4°C hasta su precipitación; posteriormente se centrifugó a 3000 rpm por 10 min. Se descartó el precipitado. El sobrenadante se saturó con sulfato de amonio al 60% (Bermejo et al. 2002), se agitó durante 15 h, se dejó reposar a 4°C hasta su precipitación, y luego se centrifugó a 3000 rpm por 10 min. El precipitado se resuspendió en amortiguador de fosfato de sodio/NaCl 0.01 M (pH 7.0).

Cromatografía

El sulfato de amonio restante se eliminó mediante cromatografía en una columna Sephadex G–25 (Sigma) preequilibrada con amortiguador de fosfato 0.01 M (pH 7.0) que contenía NaCl 0.1 M. La elución fue monitoreada a 280 nm y recolectada en fracciones de 4 mL. Las fracciones proteicas se juntaron y se introdujeron en una columna de intercambio aniónico HiPrep 16/10 Q XL (0.75 x 10 cm) (Amersham BioSciences), equilibrada previamente con amortiguador de fosfato 0.01 M (pH 7.0) con NaCl 0.1 M.

Después de enjuagar con 40 mL de amortiguador de fosfato de sodio/NaCl 0.01 M (pH 7.0), la columna se enjuagó con amortiguador de fosfato 0.01 mM que contenía NaCl 0.5 M y 0.1 M. Esta elución fue recolectada en fracciones de 4 mL y analizada. Las fracciones se juntaron y luego se separaron en un sistema (Agilent 1100) de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC por sus siglas en inglés) con una columna Zorbax GF–250 (Agilent, 0.94 x 25 cm, 4 µm), equilibrada previamente con amortiguador de fosfato 0.01 M (pH 7.0) con NaCl 0.1 M. La columna se enjuagó con amortiguador de fosfato de sodio/NaCl 0.01 M (pH 7.0) y la elución se recolectó en fracciones de 1 mL.

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS–PAGEpor sus siglas en inglés)

La electroforesis vertical se realizó en un aparato Mini–protean III (Bio–Rad), usando un sistema de amortiguador discontinuo (Laemmli 1970), el cual consiste en un gel de poliacrilamida al 16.5% (p/v) de 1.0 mm de grosor que contiene SDS al 0.1% (p/v), con un gel concentrador de poliacrilamida al 4%. Las muestras fueron previamente incubadas con SDS al 2% (p/v), glicerol al 10% (v/v), β–mercaptoetanol al 4.5% (v/v), azul de bromofenol al 0.025% (p/v) y amortiguador Tris–HCl 60 mM (pH 6.8) durante 5 min a 95°C. Los geles se incubaron a temperatura ambiente y se visualizaron mediante tinción con azul brillante de Coomassie R–250 al 0.1% (p/v), metanol al 40% (v/v) y ácido acético al 7% (v/v) por 30 min; se destiñeron en ácido acético diluido. Se emplearon las siguientes proteínas como marcadores de peso molecular: fosforilasa b (94 000), albúmina (67 000), ovalbúmina (43 000), anhidrasa carbónica (30 000), inhibidor de tripsina (20 100) y α–lactalbúmina (14 400).

Mediciones espectroscópicas

Los espectros de dicroísmo cicular se registraron con un espectropolarímetro Jasco (modelo J–810, Tokio, Japón), usando células de cuarzo con una trayectoria óptica de 1 mm para las mediciones en la región del UV lejano (180–260 nm). La concentración de proteína en las fracciones obtenidas mediante cromatografía de intercambio aniónico fue de 0.2 mg mL^–1. Se usó un amortiguador de fosfato de sodio 10 mM (pH 2 y pH 7) y el pH se ajustó con ácido clorhídrico diluido. La estructura secundaria se analizó utilizando la paquetería DICHROWEB (http://www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/home.html) y la información molecular en relación a la B–PE se obtuvo de Bermejo et al. (2001). Todos los espectros se registraron a temperatura ambiente.

Procedimientos analíticos

La concentración de proteína en las muestras se estimó por el método de Bradford (1976). La pureza de B–PE fue determinada como la relación entre las absorbancias a 545 y 280 nm (i.e., pureza de B–PE = A₅₄₅/A₂₈₀) (Bermejo et al. 2001), ya que el espectro de absorción de esta proteína presenta un pico a 545 nm.

Resultados

Se obtuvieron 145 mL de extracto crudo de los cultivos microalgales. El análisis mostró que el contenido de proteína fue 1.6372 mg mL^–1. En la figura 1 se muestra el espectro de absorción del extracto crudo. En tal espectro, tres picos correspondieron a los máximos de B–PE (562 y 540 nm, con un hombro a 498 nm), un pico correspondió al máximo de R–ficocianina (620 nm) y otro correspondió a la aloficocianina (650 nm). Esto indica que los contenidos de R–ficocianina y aloficocianina son componentes menores del total de ficobilinas en estas células, siendo B–PE el pigmento predominante.

El precipitado obtenido después de la saturación con sulfato de amonio al 60% fue resuspendido en 30 mL de amortiguador de fosfato de sodio 0.01 M. La concentración de proteínas entonces fue 2.445 mg mL^–1. Esta solución se desalinizó en una columna Sephadex G–25 (Sigma) y las fracciones obtenidas se introdujeron en una columna Sepharose Q. En algunos ensayos se utilizaron diferentes amortiguadores para la elución en la cromatografía aniónica: un gradiente discontinuo con fosfato de sodio 0.01 M/NaCl 0.1 M (pH 7) y fosfato de sodio 0.05 M/NaCl 0.1 M no produjo resultados satisfactorios. Se obtuvieron mejores resultados usando un gradiente discontinuo con diferentes concentraciones de NaCl en fosfato de sodio 0.01 M (pH 7.0): la elución de NaCl 0.1, 0.25 y 0.5 M y la mayor parte de B–PE y R–ficocianina en las ficobiliproteínas se obtuvo con fosfato de sodio 0.01 M/NaCl 0.1 M (fig. 2). Por lo tanto, los resultados mostraron que la fuerza iónica fue suficiente para la separación de la ficoeritrina. La absorbancia a 280 nm (la mayoría de las proteínas aborben a 280 nm) disminuyó notablemente en relación con el extracto crudo, lo que indica una purificación considerable de la ficobilina en comparación con otras proteínas celulares, mientras que los máximos de B–PE (540 y 562 nm) fueron los componentes principales. También se observó que la elución con fosfato 0.01 M/NaCl 0.5 M en la cromatografía de intercambio aniónico produjo B–PE; sin embargo, se obtuvieron bajas concentraciones de proteínas con menor pureza.

Las fracciones conjuntas obtenidas mediante elución con fosfato 0.01 M/NaCl 0.1 M por cromatografía aniónica se introdujo en una columna para cromatografía de exclusión por tamaño. Los resultados obtenidos por HPLC mostraron una proteína con una pureza de 4.8 (A₅₄₅/A₂₈₀), adecuada para los pasos de purificación (fig. 3). La razón de la absorción a 545 nm entre la absorción a 498 nm (A₅₄₅/A₄₉₈) fue 2.5; este valor es aceptable para la identificación del pigmento de ficoeritrina. Se obtuvieron alrededor de 1.292 mg de B–PE de 4 g de R. marinus liofilizada, con la pureza ya mencionada.

El criterio utilizado con mayor frecuencia para determinar la pureza de la solución de biliproteínas es la razón de absorción A_{max visible}/A₂₈₀; no obstante, se debería de confirmar la pureza con otros métodos experimentales. Se realizaron análisis espectroscópicos de las fracciones de la cromatografía de exclusión por tamaño. También se midieron espectros de emisión de fluorescencia de la B–PE purificada que mostraron un máximo a 578 nm (fig. 4).

Mediante la SDS–PAGE las subunidades de B–PE mostraron dos bandas (fig. 5) que contenían cantidades similares de proteína. Al comparar con estándares, las masas moleculares fueron 27 000 y 26 800, correspondiendo a las subunidades α y β de B–PE.

Se realizó un análisis de dicroísmo circular para fraccionar con B–PE y obtener información estructural a pH 7 y pH 2. Es bien conocido (Berova et al. 1981) que las estructuras de hélice a muestran una banda positiva intensa alrededor de 192 nm y dos bandas negativas alrededor de 208 y 222 nm. En la figura 6 se observa el comportamiento de la proteína a pH 7 y pH 2 en el intervalo de 180 a 260 nm. La curva muestra una banda positiva intensa alrededor de 195 nm, la cual disminuyó cuando la proteína se encontraba en condiciones ácidas. Las bandas negativas a 210 y 222 nm se observan en la fracción a pH 7, pero la intensidad disminuyó a pH 2. En la tabla 1 se muestran los resultados del análisis con DICHROWEB, en donde se usó el programa CDSSTR para determinar la curva que mejor se ajusta a los datos.

Discusión

Rhodosorus marinus presentó tres tipos de ficobiliproteínas: ficoeritrina, ficocianina y aloficocianina. Para la microalga roja Porphyridium cruentum, Bermejo et al. (2002) encontraron que el contenido de aloficocianina era insignificante o inexistente en comparación con la R–ficocianina y la B–PE.

En el presente trabajo se obtuvo la elución de la mayor parte de B–PE con fosfato de sodio 0.01 M/NaCl 0.1 M. Rossano et al. (2003) utilizaron la misma fuerza iónica para la elución de R–ficoeritrina con un amortiguador que contenía fosfato de sodio 0.05 M/NaCl 0.1 M (pH 7.0) en una columna de hidroxiapatita y fosfato de sodio 0.01 M/NaCl 0.1 M (pH 7.0) en una columna de filtración sobre gel Superdex 75. En nuestros ensayos fue necesario usar comatografía de exclusión por tamaño después de la cromatografía de intercambio aniónico para obtener B–PE altamente purificada.

La B–PE purificada de R. marinus mostró dos máximos, a 540 y 562 nm, con un hombro pequeño a 498 nm. Se sabe que existen dos tipos de ficoeritrina en P. crenum: una es B–PE, que tiene un hombro de absorción a 498 nm, y la otra es b–ficoeritina, que no lo tiene. Creemos que nuestras preparaciones podrían tener una mezcla de ambos pigmentos ya que el hombro es pequeño. Además, sólo hay un pico de emisión a 578 nm pero es igual en ambos pigmentos. El espectro de emisión de fluorescencia del máximo de la B–PE purificada es 578 nm. Este resultado concuerda con lo publicado para el espectro de fluorescencia de las ficoeritrinas (Bermejo et al. 2002).

En este estudio se obtuvo B–PE con un índice de pureza de 4.8 (A₅₄₅/A₂₈₀), que excede la purificación estándar de ficobili–proteínes de otras fuentes (Siegelman y Kycia 1978). La razón A₅₄₅/A₄₉₈ fue 2.5, un valor aceptable para identificar el pigmento de ficoeritrina como proveniente de B–PE típica (Gantt y Lipschultz 1974).

Los resultados de SDS–PAGE mostraron dos bandas cercanas intensas a 26.8 y 27.7 kDa, cuando se esperaban 17 y 18 kDa, respectivamente, para las subunidades a y P encontradas en las principales ficobiliproteínas de cianobacterias y algas rojas (ficoeritrina, ficocianina y aloficocianina; Swanson y Glazer 1990). Tanto la R–ficoeritrina como la B–PE tienen una composición (aP)6y (Redlinger y Gantt 1981). Además, en la SDS–PAGE de P. cruentum, la B–PE muestra la presencia de al menos tres subunidades y que difieren ligeramente en peso molecular. Pensamos que esto le pudiese estar pasando a R. marinus ya que los resultados de SDS–PAGE muestran bandas difusas en la región de γ.

El análisis de dicroísmo circular mostró una intensa banda positiva alrededor de los 195 nm que decreció cuando la proteína se encontraba en condiciones ácidas. Esto podría indicar que también hay sábanas P presentes en la estructura. Las bandas negativas a 210 y 222 nm se encuentran en la fracción a pH 7, pero la intensidad de las bandas decreció a pH 2 debido a la pérdida de la estructura secundaria. Bermejo et al. (2001) observaron este fenómeno en la B–PE de P. cruentum, pero no estimaron su contenido de sábanas α y β.

La estructura secundaria de la B–PE de R. marinus no parece ser muy diferente a pH 2 al compararla con la estructura a pH 7 (ver tabla 1).

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el CONACYT (México) (convenio SEP–2004–C01–46749 y convenio 83191). La primera autora recibió una beca del CONACYT.

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Notas

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Traducido al español por Christine Harris