Susceptibilidad de Litopenaeus schmitti y Cherax quadricarinatus al virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV)

Susceptibility of Litopenaeus schmitti and Cherax quadricarinatus to white spot syndrome virus (WSSV)

Marco Linné Unzueta-Bustamante¹*, Raquel Silveira-Cofficny², Adela A. Prieto², Gabriel Aguirre-Guzmán³, Ricardo Vázquez-Juárez⁴

¹ Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR)/ITESM Campus Guaymas Guaymas, Sonora, México. *E-mail: mlinne@cibnor.mx, mlinne@itesm.mx

² Centro de Investigaciones Pesqueras La Habana, Cuba.

⁴ Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR) La Paz, Baja California Sur, México.

Recibido en abril de 2003;
aceptado en abril de 2004.

Resumen

Se realizaron bioensayos en un sistema cerrado con condiciones controladas para determinar la susceptibilidad de Litopenaeus schmitti y Cherax quadricarinatus al virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) usando L. vannamei como especie de referencia positiva para esta infección viral. Los organismos fueron inyectados intramuscularmente (20 µL camarón^-1) con una preparación de WSSV obtenida del Laboratorio de Patología Acuícola de la Universidad de Arizona, siendo posteriormente distribuidos al azar en sus respectivos tanques. La susceptibilidad hacia WSSV fue significativamente mayor en L. vannamei que en las otras especies (P < 0.05). El análisis histológico demostró la presencia de cuerpos característicos de las infecciones con WSSV en las tres especies de crustáceos, con una distribución variable dependiendo del tejido y especie. La hibridación in situ permitió también determinar la presencia de estos signos en hemocitos y el hepatopáncreas.

Palabras claves: WSSV, Litopenaeus vannamei, Cherax quadricarinatus, susceptibilidad, hibridación in situ.

Bioassays were carried out in a closed system to evaluate the susceptibility of Litopenaeus schmitti and Cherax quadricarinatus to white spot syndrome virus (WSSV) using L. vannamei as the positive control reference species. Animals were injected intramuscularly (20 µL shrimp^-1) with a WSSV preparation obtained from the Aquaculture Pathology Laboratory of the University of Arizona. These infected organisms were reared separately in their respective experimental tank. Susceptibility to WSSV was significantly greater in L. vannamei than in the other two species (P < 0.05). The histological analysis showed characteristic inclusion bodies of WSSV in these three crustacean species, with a different distribution of infection depending on the tissue and species. In situ hybridization also showed these signs of infection in hemocytes and hepatopancreas.

Key words: WSSV, Litopenaeus vannamei, Cherax quadricarinatus, susceptibility, in situ hybridization.

Introducción

La camaronicultura es una actividad que ha tenido un gran impulso en las últimas décadas y cuyo avance se ha visto afectado debido a que sus sistemas crean un medio ambiente artificial que favorece la selección y proliferación de diversos agentes infecciosos que pueden afectar considerablemente la supervivencia y crecimiento de los organismos bajo cultivo (Jiravanichpaisal et al., 1994). Diferentes virus han sido reportados a nivel mundial como importantes agentes causantes de serias pérdidas en la producción del camarón, generando mortalidades que pueden llegar hasta de 100%. Estos virus son fácilmente trasportados de una región a otra gracias a múltiples actividades antropogénicas, incluyendo todas las relacionadas con la acuacultura (transporte de reproductores, larvas, productos congelados, equipo y material, manejo de aguas de desecho), convirtiéndose en agentes patógenos que representan un problema global de alto impacto (Durand et al., 2000).

El virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) fue inicialmente descrito en China y Japón en 1992-1993 (Inouye et al., 1994) y en EUA en 1995 (Jory, 1999), presentando una rápida dispersión en Tailandia, Vietnam, Malasia, India, Nicaragua, Guatemala y Honduras (Durand et al., 1996; Jory, 1999). Este virus es clasificado en la base de datos universal de virus (ICVTdb) como un Whispovirus de la familia Nimaviridae, baciliforme, de 70 a 150 nm por 275 a 380 nm, cuyo genoma consiste de una doble cadena de DNA (dsDNA) de 293-305 kb (Lightner, 1996; Vlak et al., 2002). Las infecciones por WSSV han sido reportadas en diversos peneidos como Penaeus monodon, Litopenaeus vannamei, L. stylirostris, Marsupenaeus japonicus y Fenneropenaeus chinensis, y crustáceos como Macrobrachium rosenbergii y Procambarus clarkii (Cai et al., 1995; Chang et al., 1998; Lightner and Redman, 1998; Lo et al., 1999; Wang et al., 1999). Los animales afectados por este virus muestran signos de enfermedad como depósitos blancos de calcio en la cutícula, coloración desde rosada a café debido a la expansión de sus cromatóforos, letargia, disminución del consumo de alimento, nado lento y permanencia en las orillas de los estanques, y entre los 3 y 10 días después de presentarse los primeros signos de enfermedad se presentan mortalidades del 100% (Lightner, 1996).

El presente estudio evaluó la susceptibilidad del camarón blanco del Atlántico, Litopenaeus schmitti, y de la langosta roja de agua dulce australiana, Cherax quadricarinatus, al WSSV empleando al camarón blanco del Pacífico L. vannamei como referencia positiva. El camarón blanco del Atlántico es un camarón comercial con hábitat en el Mar Caribe y las costas del Atlántico de Centro y Sudamérica, con una producción notable en Cuba, y cuya sensibilidad al WSSV no ha sido aún determinada. La langosta roja de agua dulce australiana ha sido introducida en América en la última década, donde ha mostrado un gran potencial para ser cultivada, siendo sin embargo un posible portador del virus.

Material y método

El inóculo de WSSV fue proporcionado por el Laboratorio de Patología Acuícola de la Universidad de Arizona (Tucson, EUA). Éste fue obtenido a partir de camarones libres de patógenos (L. vannamei) que fueron infectados con el virus, los cuales desarrollaron signos de enfermedad y en los que se detectó la presencia del virus mediante el análisis por reacción en cadena de la polimerasa (RPC o PCR) e histopatología. El pedúnculo ocular y hepatopáncreas fueron retirados de los camarones infectados y los tejidos remanentes fueron pesados. El exoesqueleto fue retirado y los tejidos infectados se homogeneizaron (4 a 5 v/w) en buffer de TN (10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl, pH 7.4) (Poulos, 2000, com. pers.) y centrifugaron a 6000 rpm por 20 min a 4°C. El sobrenadante fue retirado, filtrado (filtro de 0.2 µm de poro), y almacenado a -70°C para su posterior uso.

Organismos experimentales

Los camarones juveniles de L. vannamei (1-2 g de peso), L. schmitti (0.5-1 g de peso) y Ch. quadricarinatus (4-5 g de peso) fueron proporcionados por el Instituto Tecnológico de Estudios Superiores de Monterrey (Guaymas, Sonora, México), el Centro de Investigaciones Pesqueras de La Habana (Cuba), y el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR, La Paz, BCS, México), respectivamente. Los organismos experimentales fueron transportados al laboratorio húmedo del CIBNOR en Guaymas (Sonora, México), donde fueron aclimatados en tanques redondos de fibra de vidrio de 1500 L con suministro de aire. Los camarones y las langostas tenían suministro continuo de agua marina filtrada (filtro de 3 µm de poro) a 36‰ de salinidad y 26°C, y agua dulce a 1-2‰ de salinidad y 26°C, respectivamente. Los organismos experimentales fueron alimentados ad libitum con alimento comercial para camarón con 30% de proteína cruda (Purina Co., Sonora, México), y confirmados como libres del virus de WSSV por medio de PCR e hibridación in situ por el laboratorio de análisis integral acuícola del CIBNOR, el cual pertenece a la red nacional de laboratorios de diagnóstico y prevención de enfermedades de organismos acuáticos del Programa Nacional de Sanidad Acuícola, de México.

Tratamiento infeccioso

Los ensayos de infección fueron realizados en el laboratorio del CIBNOR (Guaymas) en tanques de experimentación de plástico (30 L), con tapa para evitar la contaminación cruzada por aerosoles. De acuerdo con la especie empleada los tanques contenían aireación continua y agua marina filtrada (filtro de 3 µm de poro) a 36‰ de salinidad y 26°C, o agua dulce a 1-2‰ de salinidad y 26°C. Se seleccionaron 30 organismos de cada especie (tratamiento) al azar, se pesaron e inyectaron intramuscularmente en la tercer somita con una solución salina con partículas de WSSV (20 µL camarón^-1), siendo trasferidos posteriormente a las unidades experimentales (10 organismos tanque^-1). El grupo control (animales inyectados únicamente con solución salina) fue distribuido de igual forma que los organismos tratados experimentalmente. Cada tratamiento fue evaluado por triplicado y observado cada 2 h, hasta que la mortalidad llego a ser de 50% en dos de las tres unidades experimentales. Entonces los organismos sobrevivientes fueron sometidos a análisis histológico e hibridación in situ (Lightner, 1996). Ocho días después de la inyección, todos los organismos fueron sacrificados y analizados. Un tanque con organismos no inyectados de cada especie fue usado para el análisis histológico e hibridación in situ de organismos control. Los organismos fueron alimentados con alimento comercial para camarón con 30% de proteína cruda (Purina Co., Sonora, México). El alimento fue suministrado en tres raciones iguales (08:00, 15:00 y 20:00 h) que totalizaban el 6% de la biomasa total.

Histopatología e hibridación in situ

El cefalotórax de los organismos experimentales fue cortado e inyectado con solución de Davidson AFA a una dilución de 1:10 v/v. Después de 48 h de fijación, las muestras fueron almacenadas en etanol (50%) hasta su análisis histológico o de hibridación in situ (Bell y Lightner, 1988). Se realizó una evaluación previa de los efectos del WSSV en los organismos infectados por medio de análisis histológico en fresco, con una tinción rápida con hematoxilina y eosina, en muestras de branquias y de la primera somita abdominal, fuera de camarón o de langosta (Morales-Covarrubias y Chávez, 1999).

La histopatología se realizó por medio del procedimiento descrito por Lightner (1996), en el que el tejido fue seccionando (3-5 µm), montado en portaobjetos, teñido con hematoxilina de Harris y eosina (H&E) (Luna, 1968), y evaluado en un microscopio de luz. Las muestras fueron consideradas histológicamente positivas para infecciones de WSSV cuando se detectaron cuerpos de inclusión prominentes de eosinófilos hasta basófilo en núcleos hipertofiados de células epiteliales cuticulares y del tejido conectivo. También se evaluaron la presencia de lesiones en glándulas antenales, órganos linfoides, tejido hematopoiético y corazón (Lightner, 1996). Las lesiones fueron clasificadas desde G1 hasta G4 de acuerdo con lo descrito por Bell y Lightner (1987), tomando en cuenta la hipertrofia nuclear, desintegración de la membrana nuclear y otros cambio histopatológicos en órganos y tejidos.

Los tejidos controles y los provenientes de los organismos infectados fueron analizados por medio de hibridación in situ, cuyo procedimiento y visualización fue realizado de acuerdo con lo descrito por Wongteerasupaya et al. (1996) y Durand et al. (2003). Los cortes de tejidos fueron montados y procesados sobre portaobjetos para hibridación in situ (Fisher Scientific). Las pruebas especificas no radioactivas para WSSV (A6, LN4 y C42, etiquetadas con digoxigenina) fueron suministradas por D.V Lightner del Laboratorio de Patología Acuícola de la Universidad de Arizona en Tucson. Se emplearon tejidos infectados y no infectados con WSSV de L. vannamei como controles.

Los valores medios de supervivencia de camarones y langosta fueron comparados por medio de análisis de varianza de una vía y la prueba de rangos múltiples de Duncan usando el programa computacional Statistica (1995).

Resultados

Tratamientos infecciosos

Algunos organismos de L. schmitti y C. quadricarinatus infectados con el virus, presentaron anorexia, letargia, opacidad muscular y decoloración de la cutícula 4 días después de su inyección. Se observaron mortalidades de 10% y 15%, respectivamente, a lo largo del bioensayo (fig. 1), siendo éstas significativamente inferiores a las observadas en L. vannamei (P < 0.05). Esta última especie de camarón mostró cromatóforos rojos sobre todo el cuerpo, además de signos desde moderados a severos de anorexia y letargia desde el segundo día después de la inyección, observándose flacidez en la cutícula de los organismos de L. vannamei infectados, cuatro días después de la inyección. Estos organismos mostraron una mortalidad de 20% al segundo día y de 50% al cuarto día, siendo esta mortalidad significativa (P < 0.05) con respecto a su control y las otras especies experimentales (fig. 1).

Histopatología

La histología en fresco de las muestras provenientes de camarones L. vannamei infectados mostró inclusiones características de WSSV solamente en las branquias de estos organismos (fig. 2).

La figura 3(a-c) muestra microfotografías de preparaciones histológicas H&E con inclusiones características de WSSV en tejidos de L. vannamei, L. schmitti y Ch. quadricarinatus. Los juveniles de L. vannamei fueron extremadamente susceptibles a la infección con WSSV, presentando evidencia de inclusiones típicas con grado de severidad G3-G4 en todos los organismos analizados. Las inclusiones de WSSV fueron observadas en el tejido subcuticular de la cámara gástrica y en diversos apéndices, tejido conectivo, branquias, pericardio órgano linfoide, ojo, glándula antenal y tejido hematopoiético. Ninguno de los organismos inyectados con solución salina o no inyectados, presentaron estas inclusiones.

En los juveniles de Ch. quadricarinatus se observaron lesiones producidas por WSSV con un grado de severidad G3, en las que los cuerpos de inclusión viral fueron evidentes en el tejido subcuticular, branquias, tejido conectivo y glándula antenal.

Hibridación in situ

Se observó una reacción negativa de hibridación in situ en el grupo control, mientras que en las tres especies se observó una gran reacción positiva en órganos y tejidos de organismos infectados con WSSV, siendo esta reacción observada principalmente en los núcleos de las células infectadas. La figura 3(d-f) muestra microfotografías de preparaciones de hibridación in situ con núcleos infectados por WSSV en tejidos de L. vannamei, L. schmitti y Ch. quadricarinatus. Se observó una alta incidencia de núcleos infectados en el tejido subcuticular y algunos tejidos conectivos de L. vannamei, mientras que L. schmitti mostró gran incidencia en el tejido cuticular de la cámara gástrica y en los apéndices. En el tejido subcuticular de Ch. quadricarinatus se presentaron también signos de infección. Adicionalmente, se observaron claramente signos de infección entre las células del tejido conectivo de los túbulos hepatopancreáticos de L. schmitti, pero no en el de los de L. vannamei y Ch. quadricarinatus.

Se detectó una reacción positiva a la hibridación in situ en muchos de los hemocitos y hepatopáncreas, siendo observados además diferentes niveles de intensidad de color en otros tejidos de las tres especies, producto de la reacción de hibridación. En algunos tejidos el núcleo intacto se tiñó desde azul claro a púrpura, mientras que en otros la membrana nuclear aparentemente se desintegró y la coloración azul se extendió al citoplasma siendo además claramente evidentes cambios citoplasmáticos en los diversos tejidos de L. vannamei y Ch. quadricarinatus.

Discusión

Se han desarrollado varios métodos para detectar organismos y tejidos infectados por WSSV. En el presente estudio se observaron signos de infección por WSSV en diversos tejidos de L. vannamei (4 días después de inyectados), L. schmitti y C. quadricarinatus (8 días después de inyectados) por medio de histopatología e hibridación in situ. Chang et al. (1996) obtuvieron resultados similares, encontrando que el epitelio cuticular de L. monodon fue uno de los principales tejidos afectados por las infecciones de WSSV. También otros tejidos como el conectivo, nervioso, muscular, linfoide, hematopoiético, gástrico, branquias, apéndices y glándula antenal han sido reportados como blancos del virus WSSV (Chang et al., 1996; Lightner 1996; Yoganandhan et al., 2003). En la presente investigación sólo se detectaron signos de infección por WSSV en hemocitos y hepatopáncreas por medio de hibridación in situ, lo que sugiere fuertemente que el método de evaluación de los signos de infección debe ser tomado en cuenta dependiendo del tejido analizado. Esto concuerda con lo observado por Chang et al. (1996), Durand et al. (1996), Nadela et al. (1997) y Yoganandhan et al. (2003), quienes encontraron diferentes evidencias de infecciones con WSSV dependiendo del método usado. Ellos observaron que la histopatología permite detectar los signos de infección en los tejidos antes mencionados, pero que la hemolinfa, hepatopáncreas y hemocitos solamente evidenciaron estos signos por medio de hibridación in situ, RPC o Western blot.

El uso de la técnica de tinción rápida con hematoxilina y eosina (Morales-Covarrubias y Chávez-Sánchez, 1999) 2 días después de la inyección con WSSV, reveló la presencia de inclusiones típicas de WSSV solamente en las branquias de L. vannemei (fig. 2). Estos resultados sugieren que esta técnica puede ser usada como una herramienta presuntiva en el campo, para infecciones con WSSV en granjas y laboratorios, con la ventaja de no tener que sacrificar a los organismos.

La mortalidad de 50% observada en L. vannamei en la presente investigación es similar a la reportada por Wang et al. (1999) para esta misma especie cuando fue infectada con diferentes aislados geográficos de WSSV. En contraste, los organismos juveniles de L. schmitti y C. quadricarinatus mostraron una tolerancia significativa (P < 0.05) a las infecciones de WSSV, con un 90% y 85% de supervivencia respectivamente. Sin embargo observaron claros síntomas de letargia, anorexia y cambios en la coloración del músculo abdominal en ambas especies. Éste es el primer reporte que evidencia el grado de susceptibilidad que posee L. schmitti hacia WSSV. Sin embargo, la resistencia de L. schmitti y Ch. quadricarinatus puede cambiar dependiendo de varios factores (estrés, estado nutricional, etc.). Por ejemplo, Wang et al. (1999) reportaron que la mortalidad en Farfantepenaeus duorarum llegó a ser de 100% al usar un inóculo proveniente de Fenneropenaeus chinensis, pero sólo de 50% al usar un inóculo proveniente de Orconectes punctimanus, 18 días después de la infección.

Agradecimientos

Este trabajo fue llevado a cabo gracias al apoyo del CIBNOR. Los autores expresan su agradecimiento al personal del CIBNOR, P. Hinojosa-Baltazar y G. Gallegos-Simental del Laboratorio de Biología Molecular y Marco A. Porchas-Cornejo, por su ayuda en los análisis. El aislado original de WSSV fue proporcionado por el D.V. Lightner y B. Poulos del Laboratorio de Patología Acuícola de la Universidad de Arizona. Agradecemos a Luis R. Martínez-Córdova de la Universidad de Sonora (Hermosillo, México) por su ayuda en el suministro de los camarones L. vannamei, y a Marcial L. Lizárraga del CICESE por su apoyo a lo largo del presente trabajo. Apreciamos la ayuda de la Dirección General de Acuacultura de SEMARNAP, México.

Referencias

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