Las adicciones, la genómica y la proteómica

Addictions, genomics and proteomics

Maura Epifanía Matus Ortega,¹ Juan Carlos Calva Nieves,¹ Anabel Flores Zamora,¹ Philippe Leff Gelman,^1,2 Benito Antón Palma¹

¹ Laboratorio de Neurobiología Molecular y Neuroquímica de Adicciones. Subdirección de Investigaciones Clínicas. Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz.

² Actualmente: Subdirección de Investigaciones Biomédicas. Instituto Nacional de Perinatología Isidro Espinosa de los Reyes.

Correspondencia:
Benito Antón Palma.
Laboratorio de Neurobiología Molecular y Neuroquímica de Adicciones,
Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz,
Calz. México–Xochimilco 101, San Lorenzo Huipulco, Tlalpan, 14370, México, DF.
E.mail: bapags@gmail.com

Recibido: 28 de julio de 2011.
Aceptado: 28 de noviembre de 2011.

SUMMARY

Drug addiction is a chronically relapsing disorder that has been characterized by (1) compulsion to seek and take the drug, (2) loss of control in limiting intake, and (3) emergence of a negative emotional state (e.g, dysphoria, anxiety, irritability) reflecting a motivational withdrawal syndrome when access to the drug is prevented (defined as Substance Dependence by the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders [DSM] of the American Psychiatric Association). Acute exposure to drugs of abuse initiates molecular and cellular alterations in the Central Nervous System that lead to an increased overall vulnerability to addiction with subsequent drug exposures. These drug–induced alterations employ changes in gene transcription that result in the synthesis of new proteins. Therefore, one of the important goals of addiction research is to identify the drug–induced gene expression changes in the specific brain structures related to the addictive properties of various drugs.

The molecular and genomic mechanisms by which drugs of abuse induce neuroplastic changes related to addiction remain largely unknown. Several studies have evaluated changes in gene and protein expression profiles in the brain after administration of drugs of abuse. Exposure to psychostimulants induces the activity–dependent gene expression of several transcription activators and repressors.

Genomic research strategies have recently transitioned from the search for unknown genes to the identification and evaluation of coordinated gene networks and transcriptional signatures. New opportunities arising from the analysis of these networks include identifying novel relationships between genes and signaling pathways, connecting biological processes with the regulation of gene transcription, and associating genes and gene expression with diseases. The identification of gene networks requires large gene expression data sets with multiple data points.

Functional genomics methods, studying the steady–state levels of these mRNA species, such as quantitative RT–PCR (qRT–PCR), whole–genome microarray analysis, and next generation sequencing methods, provide sensitive and high–throughput approaches to quantitatively examining mRNA (and miRNA) species present within the cells of the Nervous System.

Functional genomics studies can help to illuminate genes involved in the development of behaviors related to drug abuse and relapse liability, but cannot provide insight into post–translational modifications (e.g., phosphorylation and glycosylation of proteins after translation has occurred) or subcellular localization of the protein product. Therefore, using proteomic techniques presents the opportunity to assess the totality of gene expression, translation, modification, and localization. Unfortunately, the sensitivity of proteomic tools lags behind those of functional genomics. Moreover, examining the mRNA provides a restricted view of primarily the cell body. Indeed, from a systems biology standpoint, analysis of both mRNA and protein levels (as well as miRNA and epigenetic changes) will ultimately provide a more integrated view of the molecular underpinnings of addiction.

When applying proteomic technologies to addiction research, an understanding of the power of proteomic analysis is essential. After genetic information is transcribed into mRNA, a template is provided to the cell from which proteins will be synthesized.

Neuroproteomic studies offer great promise for increasing understanding of the biochemical basis of addiction. While proteomics is still an evolving field, proteomic approaches have proven useful for elucidating the molecular effects of several drugs of abuse. With a number of ongoing research programs in addiction proteomics and a growing number of investigators taking advantage of these tools, the addiction research field will benefit from a consideration of the capabilities and limitations of proteomic studies.

As with other biomedical research fields, drug abuse research is making use of new proteomic capabilities to examine changes in protein expression and modification on a large scale. To obtain the maximum benefit and scientific advancement from these new technologies, a clear understanding of the power and limitations of neuroproteomics is necessary. With the main limitation of neuroproteomic studies being the complexity of the proteome, approaches that focus these studies need to be employed. The salient message is that there is not a single best technical approach for all studies and that the main driver for the choice of proteomic technology and experimental design should be the advancement of the understanding and treatment of drug abuse.

Epigenetics is the study of heritable changes other than those in the DNA sequence and encompasses two major modifications of DNA or chromatin: DNA methylation and post–translational modification of histones. In this context, now it is known that regulation of gene expression contribute to the long–term adaptations underlying the effects of drugs of abuse. The precise molecular events that are required for modification of chromatin and that underlie gene repression or activation have not been elucidated.

Recent reports have addressed this question and demonstrated that drugs of abuse modify specific methyl–CpG–binding proteins that control histone acetylation and gene expression. Further elucidation of the wide–range of histone modifications and the ensuing consequences on gene expression will be necessarily before the potential for drug development can be realized. It is important to characterize the molecular alterations underlying chromatin remodeling and the regulation of the epigenetics events by drugs of abuse. It is clear that modification in gene expression by drugs of abuse promote cellular changes.

This review is intended to provide guidance on recent advances in the field of drug addiction. This review also presents a number of experimental design and sample approaches that have been applied to genomic, proteomic and epigenetic studies of addiction. Coupled with new technologies for data collection, analysis, and reporting, these approaches represent the future of the addiction field and hold the key to unlocking the complex of profile of drug abuse disorders.

Key words: Drug abuse, gene transcription, protein expression, epigenetics.

RESUMEN

La adicción a las drogas es una enfermedad mental que se caracteriza por ocasionar graves implicaciones sociales, económicas y de salud de los individuos que la padecen. La exposición aguda a las drogas de abuso provoca alteraciones moleculares y celulares en el Sistema Nervioso Central que ocasionan una vulnerabilidad para sufrir adicción a subsecuentes exposiciones a sustancias de abuso diferentes. Las alteraciones inducidas por las drogas producen cambios en la transcripción de genes que resultan en la síntesis de nuevas proteínas. Uno de los objetivos importantes en la investigación en el campo de las adicciones es identificar los cambios en la expresión de genes inducidos por las drogas en estructuras específicas del cerebro que están relacionadas con las propiedades adictivas de diferentes sustancias.

El campo de la genómica y la proteómica, aplicada al estudio de las adicciones, tiene como objetivo identificar a los genes y las proteínas candidatos involucrados en la regulación de los procesos adictivos. Se han logrado progresos considerables en la identificación de genes y proteínas que regulan las conductas complejas presentes en los procesos adictivos en modelos de animales y modelos de estudio en humanos con material obtenido post–mortem. Estos descubrimientos se han sumado a los esfuerzos por identificar los circuitos neurales implicados en las manifestaciones conductuales relacionadas con las adicciones. También han permitido la identificación de genes candidatos que podrán ser blancos de futuras estrategias terapéuticas desarrolladas para tratar los procesos adictivos.

Los estudios de genómica funcional han permitido identificar algunos de los genes involucrados en el desarrollo de las conductas adictivas, pero no tienen la capacidad de proporcionar información sobre las modificaciones post–traduccionales ni de la localización sub–celular de las proteínas para las que codifican los genes. Por lo tanto, la incorporación de estudios proteómicos ofrece la oportunidad de lograr evaluar, en su totalidad, la expresión, la traducción, las modificaciones y la localización de los genes y sus productos de expresión.

Los estudios recientes sobre los mecanismos moleculares que controlan los cambios inducidos por las drogas de abuso sobre la función transcipcional, la conducta y la plasticidad sináptica han identificado el importante papel que desempeña la remodelación de cromatina en la regulación y estabilidad de los programas genéticos neuronales mediados por las drogas y la subsecuente manifestación de las conductas adictivas.

Se han identificado alteraciones epigenéticas sobre el genoma, tales como metilación del DNA y modificaciones en la función de las proteínas histonas. Estos importantes mecanismos se ven afectados como una respuesta neurobiológica a la administración de sustancias de abuso.

Esta revisión pretende mostrar algunos de los avances recientes en el campo de las adicciones, presentando una breve descripción de los hallazgos que emplean aproximaciones genómicas, proteómicas y epigenéticas. Las implicaciones de estos estudios moleculares ponen de manifiesto nuevos conocimientos sobre el probable desarrollo de intervenciones terapéuticas en el futuro.

Palabras clave: Abuso de drogas, transcripción genética, expresión de proteínas, epigenética.

DISECCIÓN GÉNICA DE LAS CONDUCTAS COMPLEJAS

El campo de la genómica y la proteómica, aplicada al estudio de los trastornos psiquiátricos, tiene como objetivo identificar a los genes y proteínas candidato involucrados en la regulación de los procesos de reforzamiento, motivación y funciones cognitivas de algunas conductas humanas. Se han identificado genes y sus respectivas proteínas involucradas en estas conductas. Se ha estudiado, por ejemplo, el papel de los receptores específicos de los neurotransmisores (como dopamina, glutamato y serotonina), las proteínas que participan en el señalamiento intracelular (proteínas cinasas y arrestinas) y los factores de transcripción (como las proteínas CREB y cFosB).^1–3

En la presente revisión analizamos ejemplos representativos de algunos estudios actuales en este campo, detallando los resultados obtenidos por diferentes grupos de investigación y las implicaciones funcionales de los hallazgos.

Lehrmann et al.⁴ llevaron a cabo un análisis de microarreglos para analizar la expresión génica en el aPFC de tejidos post–mortem de 42 sujetos con historial de abuso a cocaína, marihuana y/o feniciclidina, comparándolos con 30 casos control, para identificar modificaciones transcripcionales. En el estudio se seleccionaron 39 transcritos de genes cuyo cambio fue altamente significativo. Para su análisis se dividieron de acuerdo a su función y localización celulares (cuadro 1).

Por su lado, el grupo de Black⁵ evalúa el efecto de la administración crónica de cocaína en un modelo de roedores adolescentes, para identificar los efectos causados por las sustancias de abuso al ser ingeridas a edades tempranas y su relación con la plasticidad neural. Estos autores identificaron grupos de genes que clasificaron sobre la base de sus funciones celulares. De los 56 genes cuya expresión disminuyó significativamente, se identificaron 34 transcritos cuya función es conocida: 10 factores de transcripción y proteínas que codifican para receptores nucleares; tres trascritos que codifican para proteínas relacionas a las funciones del citoesqueleto, del resto de los trascritos, 22 codifican para proteínas cuya función no se conoce. Se identificaron 145 transcritos de genes cuya expresión aumentó significativamente. De éstos, 92 pudieron clasificarse en grupos cuya función es conocida, 16 codifican para proteínas implicadas en funciones de la matriz extracelular y células de adhesión; tres de los trascritos codifican para proteínas que se relacionan con la actividad motora de los microfilamentos. El resto de los transcritos codifican para proteínas cuya función es aún desconocida (53 trascritos) (cuadro 2).

Hemby⁶ publicó un revisión detallada sobre los estudios desarrollados por varios grupos de investigación para evaluar los efectos de la administración de cocaína sobre la expresión coordinada de genes de las regiones cerebrales involucradas en las vías mesocorticolímbicas, incluyendo al núcleo accumbens (NAc), la corteza prefrontal, el hipocampo, el hipotálamo lateral y el área tegmental ventral (VTA), en modelos de roedores.

Los estudios mostraron que la administración de cocaína induce cambios en la expresión de genes y proteínas involucradas en los procesos de neuroplasticidad, específicamente en áreas como la corteza y el hipocampo, así como en los relacionados con procesos conductuales en los que participan el VTA, el NAc y las proteínas involucradas en la función regulatoria de células progenitoras de proliferación en el giro dentado.

Los transcritos regulados hacia la alta incluyen a los genes tempranos, los que codifican para proteínas efectoras y de andamio, receptores, proteínas transductoras de señales, proteínas asociadas a los ritmos circadianos, proteínas transcripcionales y traduccionales, señales de transducción de enzimas metabólicas y proteínas de citoesqueleto; mientras que los genes de proteínas regulados hacia la baja comprenden primordialmente transcritos relacionados con la función mitocondrial junto con transcritos que codifican para proteínas transductoras de señales. Asimismo, la administración de cocaína induce cambios en la expresión de genes de proteínas involucradas en la potenciación a largo plazo, expresadas en el hipocampo.

NEUROPROTEÓMICA

Con el advenimiento de las estrategias de separación y análisis de proteínas, basados en espectrometría de masas de alto rendimiento, es posible abarcar proteomas completos lo que permite delinear una multitud de efectos neuro–biológicos producidos por la administración de drogas de abuso. Existen estudios recientes en los que se emplearon modelos animales y muestras de tejidos humanos obtenidos post–mortem, con tecnologías emergentes para el análisis de expresión de proteínas que evalúan los cambios producidos en regiones definidas del cerebro como resultado de la ingesta crónica de cocaína.⁶

EL ESTUDIO PROTEÓMICO

En un experimento proteómico se deben considerar y optimizar múltiples variables en cada uno de los pasos experimentales: la elección del modelo conductual, la obtención y preparación de la muestra, la recopilación e interpretación de los datos obtenidos con el objetivo de establecer cuáles son más significativos y confiables.⁷ En la figura 1 se describe cada uno de los principales pasos y las variables importantes.

PERFIL PROTÉOMICO

Los diferentes grupos de investigación han utilizado una amplia variedad de técnicas proteómicas para analizar el proteoma de la sinapsis y estudiar los efectos de las drogas de abuso en el Sistema Nervioso. Estas metodologías se describen detalladamente en la revisión de Abul–Husn y Devi⁸ (cuadro 3).

EL PROTEOMA DE LA SINAPSIS

NEUROPROTEÓMICA Y DROGAS DE ABUSO

En el campo de las drogas de abuso las aproximaciones proteómicas son útiles para generar una visión objetiva y global de los cambios inducidos sobre un proteoma específico tras su administración. Adicionalmente es posible comparar y caracterizar el efecto de las drogas para comprender mejor sus mecanismos de acción.

Ante la hipótesis de que la administración de las drogas de abuso produzca cambios persistentes y significativos en la sinapsis, efectos que persisten a largo plazo, varios grupos de investigación han estudiado el papel de las proteínas sinápticas en los procesos adictivos por medio de metodologías proteómicas subcelulares.

Prokai et al.⁹ reportaron que entre las proteínas postsinápticas cuya expresión se modificó, se identificaron a algunas relacionadas con la adhesión celular, el tráfico vesicular sináptico y la endocitosis. Los autores del estudio proponen que estos hallazgos implican cambios en la estructura sináptica inducidos por la morfina, así como alteraciones en la liberación de neurotransmisores y/o en el tráfico de receptores.

En un estudio diferente, Li et al.¹⁰ analizaron la modificación de la expresión de proteínas, a partir de regiones cerebrales completas, tras la administración crónica de morfina. Los resultados del estudio mostraron la modificación de la expresión de sólo tres proteínas sinápticas (sinapsina, Lin–7 y sinucleína–beta). El hecho de identificar pocas proteínas sinápticas permite suponer que se pierden las proteínas expresadas en baja abundancia al emplear regiones cerebrales completas.¹⁰ En un estudio similar,^11,12 sobre el efecto de la administración de morfina y butorfanol (una mezcla de agonista–antagonista opioide) en roedores, se identificaron cambios significativos en la expresión de proteínas del citoesqueleto (isoformas de tubulina y actina), lo que permite sugerir alteraciones en la morfología neuronal y/o en el transporte axonal. Adicionalmente se modificó la expresión de algunas proteínas de la fosforilación de tirosina, incluidas las proteínas Gi y Go. Este resultado permite proponer que existen cambios en la modulación de la transducción de señales de los receptores opioides durante la dependencia a drogas de abuso.

IMPLICACIONES FUNCIONALES

Los hallazgos descritos brevemente en esta revisión coinciden en sus resultados. Se identificaron modificaciones en la expresión de transcritos que codifican para proteínas relacionadas con el señalamiento de calcio. Estos resultados confirman observaciones previas de un decremento de los trascritos de proteínas involucradas con el señalamiento de calcio, vía cAMP, y en la expresión del transcrito de adenilato ciclasa I en las cortezas motora y frontal de pacientes alcohólicos.^13,14

El incremento en la expresión de la mayoría de los trascritos que codifican para proteínas relacionadas con el metabolismo de lípidos y colesterol, permite suponer cambios en el funcionamiento neuronal, en la plasticidad y en la mielinización del SNC debidos a la administración de drogas de abuso.^15–17

Las modificaciones en la expresión de transcritos que codifican para proteínas relacionadas con el tráfico intracelular y los organelos celulares, aparato de Golgi y retículo endoplásmico, permiten proponer efectos en el desarrollo de conos de crecimiento neuronal, posicionamiento axonal y modulación de las dendritas de la corteza apical, crecimiento y maduración de espinas dendríticas, que en última instancia implican consecuencias en la transmisión sináptica del cerebro adulto. La disminución en la expresión de transcritos relacionados con el tráfico sináptico vesicular, la endocitosis independiente de clatrina y el transporte de endosomas tardíos hacia los lisosomas, implica un efecto de las drogas de abuso sobre las vías secretorias de las neuronas y el transporte de moléculas hacia las dendritas.

Se reportaron modificaciones en la expresión de las proteínas relacionadas con la actividad motora de los microfilamentos del citoesqueleto y en las proteínas constituyentes de los microtúbulos de actina y miosina concernidas en el transporte de moléculas en los axones, lo que pone de manifiesto la complejidad de los efectos causados por las drogas de abuso sobre las funciones del citoesqueleto. Esto sugiere un potente efecto sobre la remodelación de la sinapsis.

Adicionalmente, se describieron un incremento en la expresión de transcritos que codifican para proteínas involucradas en la adhesión celular y la actividad motora de los microfilamentos, y una disminución en los transcritos que codifican para proteínas que se unen a la actina. Se propone que el incremento en la expresión de moléculas de adhesión impide la plasticidad sináptica por medio de la formación de nuevas sinapsis, menos adaptables, lo que impide la formación apropiada y el reforzamiento de conexiones específicas de aprendizaje.

De manera complementaria, los estudios proteómicos descritos permiten confirmar que la administración crónica de drogas de abuso altera de manera significativa los niveles y los estados de fosforilación de las proteínas sinápticas incluyendo las de proteínas que participan en la señalización, el tráfico vesicular, las endocíticas, el citoesqueleto y la adhesión celular, coincidiendo con los resultados de los estudios genéticos. La administración de cocaína mostró un efecto sobre la expresión de los genes tempranos en el sistema mesocorticolímbico, apoyando la hipótesis de la generación de una forma diferente de plasticidad neuroconductual que promueve la consolidación del proceso adictivo. Se ha propuesto que la administración rápida de las drogas origina neuroadaptaciones que promueven su búsqueda compulsiva y aumentan la vulnerabilidad a la adquisición, conductas ambas características del estado adictivo.¹⁵

El estudio de Black et al.⁵ mostró una alta población de genes cuya función es aún desconocida; además, se modificó la expresión en muchos de los genes de manera transitoria, contrastando con los efectos fisiológicos permanentes. Estas importantes modificaciones fisiológicas podrían ser irreversibles.

IMPLICACIONES EPIGENÉTICAS

La mayor parte de la investigación en el terreno de las adicciones se ha centrado en el estudio de las cascadas intracelulares de transducción de señales y de factores de transcripción que se unen a elementos promotores (secuencias) de genes específicos, pero los mecanismos moleculares que controlan la expresión o la represión de los genes, conocidos como mecanismos epigenéticos, aún no han sido estudiados o valorados suficientemente. La epigenética se define como el estudio de los cambios heredados diferentes a los que ocurren en la secuencia del DNA y abarcan dos modificaciones principales del DNA o la cromatina: la metilación del DNA, la modificación covalente de citocinas, y las modificaciones post–transduccionales de las histonas, incluyendo la metilación, acetilación, fosforilación y sumoilación.¹⁸

Por otra parte, Newton y Duman²⁰ y Cassel et al.²¹ publicaron de manera separada los efectos causados por drogas psicotrópicas en el proceso de la remodelación de la cromatina y en la función de proteínas específicas que participan en la metilación de islas CpG, evento que controla la acetilación de histonas y, en última instancia, la expresión genética. Los resultados de Cassel et. al.²¹ mostraron la inducción de la expresión de proteínas de unión a las islas CpG metiladas, MeCP2 y MBD1, en el estriado y con menos intensidad en la corteza frontal y el giro dentado del hipocampo, lo que sugiere una represión de la expresión genética en dichas estructuras causada por la administración de cocaína. Complementando estos resultados, los ensayos de modificación de histonas demostraron una disminución en la acetilación de la histona H3, lo que indica un estado menos relajado de la hebra del DNA, situación que impide la transcripción genética. Adicionalmente se incrementó de manera significativa la expresión del mRNA de la proteína desacetilada de histonas HDAC2, indicando que la regulación de la desacetilación de histonas ocurre por medio de un incremento en la expresión de esta familia de proteínas, lo que promueve la expresión genética al impedir el enrollamiento del DNA.

Los resultados de los estudios permiten concluir que la función de las histonas y el evento de remodelación de la cromatina se ven modificados por la administración de drogas de abuso. Esto proporciona un punto de partida para futuras investigaciones que permitan establecer las consecuencias funcionales de las modificaciones de la cromatina en respuesta a la administración de drogas de abuso, que en última instancia permita explicar las modificaciones en la expresión genética.

EL FUTURO DE LA PSICOGENÓMICA Y LA PSICOPROTEÓMICA

Para relacionar a los genes con una conducta compleja se requiere de estudios que confirmen las manifestaciones conductuales en modelos animales adecuados, que puedan extrapolarse a las enfermedades en los humanos.

Existen muchas pruebas para evaluar conductas en roedores, por ejemplo las mediciones de la función cognitiva, el miedo y la recompensa. En el campo de las adicciones es posible medir en los modelos animales el reforzamiento y el síndrome de abstinencia.^22,23

En la mayoría de los estudios reportados se han utilizado modelos de roedores para simular los procesos adictivos a la cocaína en el humano. Sin embargo, evidencias crecientes indican la necesidad de refinar los modelos en roedores y primates no humanos para recapitular de mejor manera la adicción en el humano y relacionarla con diversas neuropatologías.

Se espera que en un futuro un paciente con una anormalidad conductual pueda tener acceso a una batería de pruebas que incluyan estudios genéticos y análisis de imagenología cerebral, que permitan definir la patología que sufre y se pueda entonces elegir el tratamiento más efectivo. Así, será posible identificar y educar a los individuos que sean particularmente vulnerables a una droga de abuso específica, y quienes, ante una breve exposición a la misma, corren un gran riesgo de adquirir la adicción. Así se podrán seleccionar programas óptimos en el tratamiento de individuos adictos.

Se ha establecido que las drogas de abuso provocan una modificación de la arquitectura neuronal mediante la alteración de la longitud de las dendritas, y que modifican la fisiología neuronal en general en las áreas cerebrales relacionadas con los procesos de adquisición y consolidación de la adicción.

Una de las áreas que se distingue sobre las otras regiones es la corteza prefrontal, debido a su altamente compleja conectividad sináptica y arborización dendrítica.^22,23 Por esta razón las modificaciones de la expresión genética, de manera específica sobre procesos importantes como el señalamiento intracelular mediado por calmodulina, el metabolismo del colesterol y el funcionamiento del aparato de Golgi y el retículo endoplásmico, reflejan los cambios en la función neuronal y la plasticidad sináptica inducidos por la administración de drogas de abuso. Por otro lado, los estudios epigenéticos iniciales llevados a cabo para conocer las implicaciones a nivel de regulación de la expresión genética, han mostrado que las drogas de abuso ejercen sus efectos porque producen modificaciones en la remodelación de la cromatina.²⁰ En este sentido, es de esperarse un importante desarrollo del conocimiento en esta disciplina que será de utilidad para comprender los mecanismos de los procesos de adquisición y las recaídas.

Existe una gran diversidad de resultados en los estudios proteómicos llevados a cabo para caracterizar la expresión de proteínas involucradas en los procesos adictivos a las drogas de abuso. A la fecha existen relativamente pocos estudios publicados en los que se combinan estudios de autoadministración con aproximaciones proteómicas. Una probable explicación es que los investigadores en las áreas de farmacología conductual y biología molecular han estado trabajando distanciados unos de otros. Otras causas de la diversidad en los resultados son: el uso inapropiado de modelos experimentales, la dependencia de sistemas no neuronales o tejidos neuronales involucrados en el reforzamiento de los efectos de la droga y la falta de substratos neurales definidos a nivel celular o bioquímico.

Los otros factores a considerar y que dificultan la comparación entre los diferentes estudios son la selección de la región cerebral, la fracción subcelular y/o el subgrupo de proteínas a analizar. Otro factor relevante es la selección de las técnicas proteómicas empleadas. Por ejemplo, el uso de dos técnicas de separación usadas para analizar la misma muestra de proteínas produce resultados drásticamente diferentes, esto se debe a que los métodos empleados pueden ser más o menos adecuados para cada subgrupo específico de proteínas (proteínas solubles y de membrana). Generalmente, las técnicas proteómicas se ejecutan de manera diferente en cada laboratorio de investigación.

Adicionalmente existen múltiples factores experimentales que deben considerarse: el tipo de droga de abuso, las vías y las velocidades de administración, la edad de los individuos, el grupo étnico al que pertenecen y en donde es importante la identificación de fenotipos.

La selección cuidadosa de estos factores y su estudio detallado en los procesos adictivos, aunado a la combinación de modelos conductuales adecuados de reforzamiento de drogas, específicamente los sistemas neurobiológicos, en conjunto con las técnicas moleculares, ampliará nuestro conocimiento sobre el desarrollo de pruebas diagnósticas objetivas lo que llevará a mejorar los tratamientos e implementar medidas preventivas y curas efectivas.

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