Evaluación de Extractos de Plantas Nativas Yucatecas Contra Alternaria chrysanthemi y Espectro de Actividad Antifúngica de Acalypha gaumeri

Evaluation of Native Yucatecan Plant Extracts Against Alternaria chrysanthemi and Antifungal Activity Spectrum of Acalypha gaumeri

Arely A. Vargas Díaz¹, Marcela Gamboa Angulo¹, Irma L. Medina Baizabal¹, Daisy Pérez Brito¹, Jairo Cristóbal Alejo², Esaú Ruiz Sánchez²

¹ Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Calle 43 No. 130, Chuburná, Mérida, Yucatán, CP 97200, México. Correspondencia: mrnarcela@cicy.rnx

Recibido: Mayo 19, 2014
Aceptado: Agosto 14, 2014

Resumen

Un total de 24 extractos (acuosos y etanólicos) de nueve especies de plantas se evaluaron contra Alternaria chrysanthemi, el agente causal del tizón foliar en crisantemo. La mayor actividad antifúngica se detectó con los extractos etanólico y acuoso de la raíz de Acalypha gaumeri (inhibición del crecimiento, IC=75 y 69%, respectivamente), y los acuosos del tallo y hoja de Bonellia flammea (IC= 63 y 50%, respectivamente). Estos extractos activos subsecuentemente se evaluaron en el bioensayo de dilución en agar, donde el extracto etanólico (EE) de la raíz de A. gaumeri causó una alta inhibición del crecimiento micelial y esporulación, con una Concentración Inhibitoria media (CI₅₀) de 0.53 mg/mL contra la IC de A. chrysanthemi. Este extracto se particionó y la mayor actividad se observó en la fracción de mediana polaridad (ACR-1E) con una CI₅₀=0.13 mg/mL. Esta fracción completamente inhibe la infección causada por A. chrysanthemi en las hojas de crisantemo a una concentración de 85μg/cm². También el EE de A. gaumeri inhibe el crecimiento de las cepas fúngicas Alternaria sp. (ITC02), Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporioides, Corynespora cassiicola, Curvularia sp. (ITC10), y Helminthosporium sp. (ITC04). El EE de la raíz de A. gaumeri puede ser un fungicida botánico potencial para el control de fitopatógenos.

Palabras clave adicionales: Acalypha gaumeri, Alternaria chrysanthemi, ensayos antifúngicos, ensayo en microdilución, fungicidas naturales, extractos de plantas.

Abstract

Additional keywords: Acalypha gaumeri, Alternaria chrysanthemi, antifungal assays, microdilution assay, natural fungicides, plant extracts.

El hongo Alternaria chrysanthemi es reconocido como el agente causal del tizón foliar por Alternaria, la cual es una enfermedad muy importante del crisantemo (Dendranthema grandiflorum (Ramat)). Esta planta es una especie ornamental valiosa que se utiliza en todo el mundo como flor de corte, en jardín y macetas (Anderson, 2007; Deng et al., 2012). Alternaria chrysanthemi se presenta principalmente en condiciones de altas temperaturas y lluvias continuas; los síntomas de la enfermedad aparecen en el follaje afectando la calidad y vida útil de las flores (Deng et al., 2012; Xu et al., 2010). La principal estrategia de control para A. chrysanthemi es el uso de fungicidas sintéticos o semisintéticos, tales como la azoxistrobina, benomilo, captan, carbendazim, clorotalonil y folpet (Villanueva-Couoh et al., 2005; Xu et al., 2010), con sus conocidos impactos negativos sobre la salud humana y el medio ambiente. En este sentido, los productos naturales derivados de plantas actualmente están siendo evaluados como nuevas alternativas ecológicas para el manejo de los hongos patógenos de plantas (Dayan et al., 2009).

En la última década, los estudios sobre productos botánicos para el control de hongos fitopatógenos se han incrementado notablemente (Dellavalle et al., 2011; Gahukar 2012; Talibi et al., 2012). Un gran número de familias de plantas han sido ampliamente estudiados por sus propiedades antifúngicas, tales como Acanthaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Lamiaceae y Meliaceae (Gahukar 2012; Ravikumar y Garampalli 2013; Zaker, 2013). Los extractos de diversas plantas han sido evaluados in vitro en el género Alternaria; en particular, los extractos alcohólicos y acuosos se han probado en Alternaria alternata (Carvalho et al., 2011), Alternaria solani (Yanar et al., 2011; Ravikumar y Garampalli, 2013), y Alternaria sesami (Zaker, 2013), donde los extractos de varias especies de plantas se han encontrado prometedores. Además, para el tratamiento de las especies de Alternaria, algunos productos botánicos ya están disponibles en el mercado, tales como extractos de Reynoutria sachalinensis (Regalia^TM) y extractos acuosos de Macleaya cordata (Qwel®), los cuales contienen una mezcla de cloruro de sanguinarina y cloruro de queleritrina y se han utilizado con éxito en el campo (Copping y Duke, 2007; Newman and Roll, 1999).

La bio-prospección de productos naturales para el manejo hongos fitopatógenos de importancia económica, llevadas a cabo por nuestro grupo de investigación ha dado lugar a la evaluación de plantas nativas de la Península de Yucatán como fuente de nuevos biopesticidas. En un trabajo anterior, encontramos nueve especies de plantas (Acalypha gaumeri, Ambrosia hispida, Bonellia flammea, Calea urticifolia, Croton chichenensis, Furcraea cahum, Randia obcordata, Trichilia minutiflora y Vitex gaumeri) con potencial para inhibir el crecimiento in vitro de Alternaria tagetica (Gamboa-Angulo et al., 2008). El objetivo del presente trabajo fue la evaluación in vitro de 24 extractos de plantas yucatecas nativas contra A. chrysanthemi, con la finalidad de encontrar alternativas ecológicas para el control del tizón foliar causado por Alternaria en el crisantemo, y además explorar el espectro de actividad antifúngica del extracto vegetal más activo con otras cepas de hongos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación de los extractos. Todo el material vegetal se obtuvo de varias localidades de la península de Yucatán, México; las plantas se secaron bajo luz artificial (50- 60 °C, 3 d). Una muestra de cada especie se mantuvo en el herbario de la Unidad de Recursos Naturales del Centro de Investigación Científica de Yucatán (Cuadro 1).

Extractos etanólicos (EE): El material vegetal seco (40 g) se maceró con etanol (600 mL) tres veces a temperatura ambiente durante 24 h cada uno. Para obtener los extractos crudos orgánicos se filtró el disolvente, se concentró a vacío y se eliminó en un rotavapor a 40 °C (Cristobal-Alejo et al., 2006).

Partición del extracto etanólico. El extracto etanólico (482 mg) de la raíz de A. gaumeri se resuspendió en agua-metanol (2:1) y se particionó con disolventes en polaridad ascendente (hexano y acetato de etilo, 3 ^x, 2: 1, 1: 1, 1:1 cada uno). Los disolventes se eliminaron a presión reducida para obtener fracciones de polaridad baja (ACR-1A, 21%), media (ACR-1B, 5%) y alta (ACR-1C, residuo acuoso). Adicionalmente, se evaluaron dos precipitados (ACR-1D, el 14%; ACR-1E, 0.7%).

El extracto activo y las fracciones ACR-1E de la raíz de A. gaumeri se analizaron por cromatografía de capa fina (TLC) sobre placas de gel de sílice 60F, se detectaron con luz UV y se rociaron con ácido fosfomolíbdico como agente revelador, seguido de calentamiento.

Cepas fúngicas. Los hongos fueron aislados de plantas del campo utilizando como medio de crecimiento papa dextrosa agar (PDA). La identificación de los hongos fue realizada por sus características morfológicas utilizando claves taxonómicas (Barnett y Hunter, 1972). Los hongos y sus hospederos fueron los siguientes: Alternaria chrysanthemi E. G. Simmons & Crosier (CICY004) de Dendranthema grandiflorum Ramat; Alternaria sp. (ITC02) de Heliconia sp.; Colletotrichum capsici (CC2) y Colletotrichum gloeosporioides Penz. & Sacc. (CG4) de Carica papaya L.; Corynespora cassiicola Berk. & M. A. Curtis (ITC03) de Capsicum anuum L.; Curvularia sp. (ITC10) de Zea mayz L. y Helminthosporium sp. (ITC04) de Veitchia merrilii Becc. Todos los hongos se mantuvieron en tubos inclinados con PDA dentro de aceite mineral a 4 °C. Antes de su uso, los hongos se cultivaron en cajas de Petri con PDA a 25 ± 2 °C con luz natural durante 5-7 d.

Inhibición del crecimiento (IC) de Alternaria chrysanthemi mediante el ensayo de microdilución en caldo. Alternaria chrysanthemi fue cultivada en PDA e incubada a 18-20 °C en oscuridad total para inducir la esporulación. Después de seis días se añadió una solución salina estéril (5 mL) sobre la superficie del micelio y se rasparon suavemente con un portaobjetos estéril. La mezcla de esporas / hifas resultante se filtró a través de una gasa de doble capa esterilizada. La suspensión de esporas se ajustó a 5x10⁴ conidios/mL con la ayuda de un hemocitómetro (Höller et al., 1999).

La inhibición del crecimiento (IC) de A. chrysanthemi por el efecto de los extractos se evaluó mediante técnica de microdilución en caldo según lo descrito por el Comité Nacional de Normas de Laboratorios Clínicos (NCCLS, 2004) con ligeras modificaciones. Todos los extractos orgánicos y sus fracciones se disolvieron en dimetil sulfóxido (DMSO) a 40 μg/μL. Posteriormente se mezclaron con medio sintético Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) y 100μL de las muestras se transfirieron a una placa de microtitulación de 96 pocillos. Para evaluar el extracto acuoso, este se mezcló directamente con el medio RPMI-1640 y luego se transfirió a la placa como se mencionó anteriormente para los extractos orgánicos. La suspensión de conidios de A. chrysanthemi (100 μΚ) se añadió a cada pocillo en la placa a la concentración final de esporas de 2.5 x 10⁴ conidios/mL; concentración final de extractos orgánicos o fracciones a 1, 0.5 y 0.25 mg/mL; y extracto acuosos a 3, 1.5 y 0.75% p/v. La anfotericina B (4 μg/mL) se utilizó como control positivo y el RPMI-1640- 2.5% de DMSO como control negativo. Las pruebas se llevaron a cabo por triplicado. Las placas de microdilución se incubaron a 23 ± 2 ° C en la oscuridad durante 96 h y el crecimiento de las hifas (CH) se determinó visualmente con un microscopio (50 χ) siguiendo la norma NCCLS. Los datos se convirtieron a porcentajes y los resultados se reportaron como IC aplicando la fórmula de Abbott: [(% CH en el control -% CH en el tratamiento) /% CH en el control χ 100] (Cuadro 1) (Abou-Jawdah et al., 2002).

La concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración fungicida mínima (CMF) se determinó mediante el ensayo de microdilución. La CMI se registró como la concentración donde no se observó crecimiento del micelio en el pozo (valores de IC del 100%), mientras que la CMF se registró como la concentración de los extractos que no permitieron crecimiento del micelio después de que las esporas tratadas se inocularon en PDA libre del extracto e incubadas durante 48 ha 24 ± 2°C. Adicionamente, se calcularon las concentraciones inhibidoras (CI₅₀ y CI₉₀) para las fracciones de A. gaumeri (Cuadro 3).

Inhibición del crecimiento micelial (ICM) por el ensayo de dilución en agar. Para evaluar la ICM, el EE de A. gaumeri se disolvió en DMSO (20 μg/μL) y se añadió directamente al medio de cultivo esterilizado (PDA) cuando se enfrío a aproximadamente 50 °C, los extractos acuosos de A. gaumeri y B. flammea se añadieron directamente al medio. Los medios se mezclaron homogéneamente y se transfirieron a placas de Petri (6 cm). Las concentraciones finales del EE fueron 1.0, 0.5 y 0.25 mg/mL, mientras que para los extractos acuosos fueron 3.0, 1.5 y 0.75% p/v. Para el ensayo, se utilizó un sacabocados para preparar discos de micelio fúngico (5 mm de diámetro) tomados de la zona de cultivo con 5-7 d de crecimiento. Un disco se colocó en el centro de una placa de Petri después de la solidificación del medio PDA. Las colonias de hongos también se cultivaron en medio PDA con y sin 5% de DMSO para el control negativo y con procloraz 45 CE (0.2 mg / mL) para el control positivo. Los cultivos de hongos se mantuvieron en la oscuridad durante 5-7 d a 18 ± 2°C para A. chrysanthemi y a 25 ± 2°C para el resto de los hongos fitopatógenos. Todos los ensayos se realizaron con cuatro repeticiones. La evaluación de la ICM se llevó a cabo como se describe en Saetae y Suntornsuk (2010) (Cuadro 2). Las concentraciones inhibitorias (Ci₅₀ y CI₉₀) también se estimaron (Cuadro 4).

Ensayo en discos de hoja. Discos foliares de crisantemo (1.5 cm²) se cortaron de plantas establecidas bajo condiciones de invernadero. Las hojas se desinfectaron con 1% NaOCl (1 min) y etanol al 70% (1 min). Los discos foliares se colocaron en placas de múltiples pocillos (formato de 12 pocillos) en agar- agua (2%). La fracción ACR-1E se disolvió en agua:etanol:DMSO:tween 20 (50: 47.5:2.5:0.06, v/v) a concentraciones de 8, 4 y 2 mg / mL. Los discos foliares se impregnaron con 16 μL de la fracción de cada concentración (85, 42.5 and 21.2 μg/cm²); después de la evaporación del disolvente, los discos se inocularon con 16 μL de la suspensión de esporas (2.5 x 10⁴ esporas/mL) de A. chrysanthemi. Los discos foliares se incubaron entonces durante siete días a 24 °C y luz natural. La actividad antifúngica se registró como se describe en Boehlendorf et al. (2004) usando el siguiente escala: 10 = presencia de micelio sin IC, 7 = Buena pero IC micelial incompleta, 3 = ligera IC micelial, y 0 = no se observó IC micelial.

Análisis estadísticos. Los datos de porcentajes (IC, ICM y IS) se transformaron a y = arsin (aqrt / 100). Los datos fueron analizados mediante análisis de varianza y comparación múltiple de medias (Tukey, P = 0.05) utilizando el software Sistema de Análisis Estadístico (SAS) versión 9.1.3 para windows. Las concentraciones de inhibición (CI₅₀ y CI₉₀) se calcularon por análisis Probit.

RESULTADOS

Actividad antifúngica de extractos de plantas contra Alternaria chrysanthemi. De todos los extractos (acuosos y etanólicos) evaluados por el ensayo de microdilución, sólo seis mostraron actividad IC contra A. chrysanthemi (Cuadro 1). Los más activos fueron los extractos etanólicos y acuosos de raíces de A. gaumeri (75 y 69% IC, respectivamente) y los EA del tallo y hojas de B. flammea (63 y 50%, respectivamente) (Cuadro 1).

Estos extractos de plantas también se evaluaron en el ensayo de dilución en agar mediante diluciones en serie. El EE de la raíz de A. gaumeri mostro la más alta ICM (78%) y también la más baja CI₅₀ y Ci₉₀ (0.53 y 1.50 mg/ mL, respectivamente) (Cuadro 2, 4). Además, los valores de CMI y CMF fueron de 2 mg/mL. El extracto acuoso del tallo y las hojas de B. flammea mostró una actividad moderada (ICM = 57 y 45%, respectivamente) (Cuadro 2).

La inhibición de la esporulación no fue significativamente diferente (77- 82%) en A. chrysanthemi expuesta al EA del tallo y hojas de B. flammea (ambos a 9.1 x 10³ esporas /mL) ni el EE y EA de las raíces de A. gaumeri (1.3 x 10⁴ y 1.2 x 10⁴, respectivamente) (Cuadro 2).

Actividad antifúngica de las fracciones del extracto etanólico de Acalypha gaumeri. La partición guiada por bioensayo del EE de la raíz de A. gaumeri se realizó mediante el ensayo de microdilución (Cuadro 3). La actividad antifúngica se observó en las fracciones de polaridad media ACR-1B y ACR-1E, donde los valores de IC fueron 50 y 100%, respectivamente. Además, la fracción ACR-1E mostró valores de CMI de 0.25 mg/ mL, y la CI₅₀ y CI₉₀ de 0.13 y 0.14 mg / mL, respectivamente (Cuadro 3).

Ensayo de disco de hoja de la fracción de ACR-IE. La fracción ACR-1E se evaluó a diferentes concentraciones contra A. chrysanthemi en ensayo de disco de hoja de crisantemo. Los datos no mostraron ningún crecimiento del micelio de A. chrysanthemi en los discos tratados a 8 mg/ mL (85 μg/cm²), mientras que se observó una inhibición incompleta de crecimiento micelial cuando se aplicaron 4 mg/ mL (42.5 μg/cm²) en los discos de hoja de crisantemo (Figura 1).

Espectro de actividad antifúngica de Acalypha gaumeri. El EE de la raíz de A. gaumeri se evaluó mediante el ensayo de dilución en agar contra seis hongos comunes (Cuadro 4). El EE de la raíz de A. gaumeri inhibió el crecimiento micelial de todos los hongos evaluados, la actividad antifúngica varió de 68 hasta 97% a una concentración de 1 mg/ mL (Cuadro 4). La CI₅₀ calculada (0.33 mg/ mL) y la CI₉₀ (1.01 mg/ mL) mostraron que la especie fúngica más sensible fue la C. cassiicola. En contraste, la menos sensible fue C. capsici (CI₅₀ = 0.60 mg/ mL y la CI₉₀ = 4.60 mg/ mL).

DISCUSIÓN

En el presente trabajo, se buscaron productos antifúngicos naturales provenientes de la flora local de la Península de Yucatán. Se evaluaron extractos etanólicos y acuosos de nueve especies de plantas contra A. chrysanthemi. Los datos de los ensayos in vitro antifúngicos (Cuadro 1, 2) mostraron que ambos tipos de extractos de raíz de A. gaumeri inhibieron el crecimiento micelial y la esporulación de A. chrysanthemi usando concentraciones de 1 mg/mL para el EE y 3% p/v para el EA. Además, se observó que el EE mostró valores más bajos de CI₅₀ y CI₉₀ para inhibir el crecimiento de A. chrysanthemi en comparación con el EA (Cuadro 2). Algunos trabajos anteriores también han reportado una mayor actividad de los extractos alcohólicos en comparación con los extractos acuosos contra las especies de Alternaria (Hassanein et al., 2008; Shirzadian et al., 2009; Zaker, 2013). La eficacia de los extractos de A. gaumeri estuvo dentro del rango reportado para otras especies de Alternaria cuando se expusieron a otros extractos de plantas (Ammar et al., 2013; Wenqiang et al., 2006).

Para monitorear la actividad antifúngica de A. gaumeri en A. chrysanthemi, el EE se sometió a separación preliminar por partición con disolventes de polaridad creciente. Las fracciones y los precipitados obtenidos se evaluaron contra A. chrysanthemi, donde las fracciones de polaridad media (ACR-1B y ACR-1E) fueron las más activas. Ambas fracciones mostraron valores menores de CI₅₀ y CI₉₀ que las del EE (Cuadro 3). Además, la fracción ACR-1E fue evaluada in vitro en crisantemo mediante el ensayo de disco de hoja. Los resultados mostraron una inhibición completa de crecimiento de hifas de A. chrysanthemi a concentraciones de 8 mg/mL (Figura 1). Concentraciones menores de los extractos permitieron el crecimiento del micelio en el medio de cultivo y en el bode del disco de hoja. Esto indica que el EE de A. gaumeri podría afectar a la penetración o el establecimiento de A. chrysanthemi en el tejido foliar de las hojas de crisantemo. Lin et al., (2011) reportaron que los extractos crudos de Solanum nigrum inhibieron de manera eficiente el desarrollo de los síntomas de mancha de la hoja en col negra causada por A. brassicicola a una concentración de 5 mg/mL.

La especie A. gaumeri (Euphorbiaceae) es una planta endémica herbacea de la Península de Yucatán (Fernández-Concha et al., 2010). Con la excepción de nuestros estudios (Cristóbal-Alejo et al., 2006; Cruz-Estrada et al., 2013; Gamboa-Angulo et al., 2008) no hay reportes anteriores sobre sus propiedades biológicas o composición química. El género Acalypha incluye 462 especies, y una búsqueda en la literatura produjo varios informes sobre el potencial de las especies de Acalypha contra hongos patógenos de plantas, por ejemplo, Acalypha australis contra Colletotrichum lagenarium (Inagaki et al., 2008); Acalypha indica contra Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Candida tropicalis, Fusarium oxysporum, y Microsporum canis (Siva et al., 2008; Jebakumar et al., 2005; Somchit et al., 2010), y Acalypha wilkesiana contra Aspergillus flavus, C. albicans, F. solani, Trichophyton interdistale, y T. mentagrophytes (Alade and Irobi, 1993). Estudios fitoquímicos en varias especies de Acalypha mostraron la presencia de metabolitos tales como flavonoides, policétidos, y los terpenos (Adesina et al., 2000; Gutierrez-Lugo et al., 2002) alcaloides (Hungeling et al., 2009) y una amida (Siems et al., 1996). Actualmente se están llevando a cabo estudios químicos para identificar los metabolitos responsables de los efectos antifúngicos de A. gaumeri.

Algunos trabajos anteriores también reportan que A. gaumeri fue activo en otros hongos, tales como Colletotrichum y Fusarium (Gamboa-Angulo et al., 2008). Por lo tanto, el EE fue probado en varios hongos (Tabla 4). Los resultados mostraron que el EE de A. gaumeri suprimió el crecimiento micelial de todos los hongos evaluados; éstos incluyen tres cepas de Alternaria, dos especies de Colletotrichum (C. gloeosporioides y C. capsici), Corynespora cassiicola, Curvularia sp. (ITC10), Fusarium oxysporum, y Helminthosporium sp. (ITC04). En particular, la inhibición (IC) de las especies de Alternaria, varió del 78% al 94% contra A. tagetica, Alternaria sp. (ITC02) y A. chrysanthemi.

Otra planta con efecto significativo contra A. chrysanthemi fue B. flammea, hojas y tallos (Theophrastaceae, antes Jacquinia flammea Mill sp.), y el cual es un árbol endémico de la península de Yucatán. Se utiliza en medicina tradicional maya para tratar la fiebre. El extracto metanolico de las raíces de esta especie ha sido reportado con actividad antifúngica contra dermatofitos (García-Sosa et al., 2011) y contra las líneas HeLa y RAW 264.7 de células cancerosas humanas. Esta planta produce ácido vanílico 4-0-neohesperidósido y sakurososaponina. Este último compuesto es uno de los responsables del efecto antifúngico de la B. flammea (Sánchez-Medina et al., 2009).

CONCLUSIONES

El EE de la raíz de A. gaumeri en estudios in vitro mostró la más alta actividad antifúngica contra A. chrysanthemi, seguida sólo por el EA del tallo y hojas de la B. flammea. Los resultados del ensayo de disco foliar de crisantemo fueron altamente eficientes, por lo que, podrían ser efectivos en ensayos en invernadero y en el campo. Además, el espectro de actividad antifúngica de A. gaumeri aumentará cuando se evalúen otros patógenos. Los resultados presentados en este estudio sugieren que los extractos de A. gaumeri tienen el potencial de actuar como fungicidas naturales. Además, este es el primer reporte donde se evalúa la actividad antifúngica de A. chrysanthemi utilizando el ensayo de microdilución. Este ensayo podría ser utilizado en programas donde se evalúe un gran número de extractos en la búsqueda de productos antifúngicos naturales. Y para finalizar, esta búsqueda corrobora el valioso potencial de nuestra flora regional para el desarrollo de fungicidas ecológicos en un futuro próximo.

Agradecimientos. Los autores agradecen a Eduardo Balam, Paulino Simá-Polanco, Filogonio May-Pat y a Sergio Pérez por su valiosa asistencia técnica. Esta investigación fue apoyada económicamente por Fomix-Conacyt (Proyecto YUC-2011-C09-168624). A.A.V.D. agradece a CONACYT por la beca de estudiante de doctorado (N ° 211999).

LITERATURA CITADA

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