Influencia del Tipo de Muestra en la Inmunodetección del Virus del Mosaico de la Malanga

Sample-Type Influence on Dasheen Mosaic Virus Immunodetection

Rosa Elena González Vázquez¹, José Efraín González Ramírez¹ y Dariel Cabrera Mederos²

¹ Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales, Apdo. 6, Santo Domingo, Villa Clara, CP 53000, Cuba. Correspondencia: relena@inivit.cu.

Recibido: Diciembre 14, 2011
Aceptado: Marzo 13, 2012

Resumen

La malanga (Xanthosoma spp.) es uno de los cultivos más cotizados por la población cubana, por su riqueza energética y fácil digestión. El virus del mosaico de la malanga (DsMV, por sus siglas en inglés) constituye en el país una de las principales enfermedades de este cultivo. El traslado indiscriminado de semilla, ha aumentado su incidencia con pérdidas que alcanzan el 60%. En el Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales se evaluó la influencia del tipo de muestra utilizada (plantas procedentes de campo y producidas in vitro) en los resultados del inmunoensayo ligado a enzima ELISA-DAS, utilizando el genotipo 'INIVIT MX-2006'. Con este propósito, se evaluó el tejido sintomático y asintomático de plantas de campo con síntomas y controles positivos y negativos de plantas producidas in vitro. Se obtuvo un 22.5% de resultados falsos negativos en plantas de campo. La relación de los valores de absorbencia positivos y negativos de ambas muestras fue estadísticamente superior en plantas producidas in vitro. Los resultados anteriores indican que la utilización de plantas producidas in vitro es mejor para el diagnóstico de esta enfermedad.

Palabras clave: DsMV, diagnóstico viral, ELISA-DAS, malanga.

Abstract

Keywords: DsMV, viral diagnosis, ELISA-DAS, dasheen.

Résumé

Le malanga (Xanthosoma spp.) est l'une des cultures les plus demandées par la population cubaine, à cause de sa richesse énergétique et digestion facile. Le virus de la mosaïque du Malanga (DsMV, pour son sigle en anglais) est dans ce pays l'une des principales maladies de cette culture. Le transfert indiscriminé de la graine a augmenté son incidence avec des pertes atteignant 60%. L'Institut de la Recherche des Viandes Tropicales a évalué l'influence du type d'échantillon utilisé (plantes provenant du terrain et plants produites à partir de culture in vitro) sur les résultats de dosage d'immuno-essai liés aux enzymes ELISA-DAS, en utilisant le génotype 'INIVIT MX-2006'.

Dans ce but, nous avons évalué les tissus des plantes symptomatiques et asymptomatiques provenant du terrain, et aussi des contrôles positifs et négatifs à partir des plantes obtenues in vitro. Nous avons obtenu 22,5% de résultats faux négatifs sur les plantes provenant du terrain. Le rapport des valeurs d'absorbance positive et négative des deux échantillons était statistiquement plus élevé chez les plantes cultivées in vitro. Les résultats ci-dessus indiquent que l'utilisation de plantes cultivées in vitro est meilleure pour le diagnostic de cette maladie.

Mots clés: DsMV, diagnostic viral, ELISA-DAS, malanga.

La malanga (Xanthosoma spp. y Colocasia esculenta) es un producto valioso en muchos países tropicales y subtropicales, por su elevado valor dietético. Es la única vianda cuya digestión se realiza a pH neutro o cercano a éste, por lo que se recomienda en la dieta de personas con trastornos digestivos. La malanga es susceptible a enfermedades fungosas, bacterianas y virales (Folgueras et al., 2009; Hernández et al., 2000). El Virus del Mosaico de la Malanga (DsMV, del inglés Dasheen mosaic virus) es la enfermedad viral, en la malanga, más difundida a nivel mundial. En Cuba, el DsMV se informó por Quintero en 1987 y Hernández et al. (2000) en los géneros Colocasia y Xanthosoma, con una incidencia del 95%. El DsMV es transmitido, de forma no persistente, por varias especies de áfidos (Zettler et al., 1978; Díaz et al., 2010). Esta enfermedad produce retardo en el crecimiento y disminuye los rendimientos, hasta el 60%, en clones comerciales de malanga (Brunt, 1992).

Las técnicas inmunoquímicas y moleculares, son las principales vías para la identificación y diagnóstico de los virus vegetales (Chen et al., 2006). En Cuba, se han obtenido anticuerpos policlonales para la detección del DsMV por técnicas de UM-ELISA (Ultra-Micro-Enyme Linked Immuno Sorbent Assay) (Hernández et al., 2000). Sin embargo, la técnica más utilizada en los laboratorios de certificación viral es el ELISA en sus variantes DAS, Doble Antibody Sandwich, e indirecto. En este tipo de análisis se corre el riesgo de obtener resultados falsos negativos, lo cual, entre otras causas, puede estar asociado al tipo de muestra que se utilice. Esta problemática trae consigo que se lleve a campo semilla infectada, y de este modo se disemine la enfermedad provocando afectaciones económicas y fitosanitarias. Este trabajo tuvo como objetivo evaluar la influencia del tipo de muestra utilizada en los resultados del diagnóstico mediante la metodología de ELISA-DAS.

MATERIALES Y MÉTODOS

En los experimentos, se utilizó el genotipo 'INIVIT MX-2006' (Xanthosoma spp.), comprendido dentro de la lista de genotipos comerciales en el programa de producción del INIVIT para la entrega a las biofábricas del país. Las determinaciones inmunoquímicas se realizaron mediante inmunoensayo ligado a enzima a partir del sistema comercial (ELISA-DAS para el Virus del mosaico de la malanga) de la casa comercial Agdia, EU. La absorbancia se determinó a 405 nm con un lector (BIO-TEK ELx-800, EU) y se empleó un lavador automático de placas (DAS srl, Italia), según recomendaciones del fabricante.

Se utilizaron bancos de controles positivos y negativos formados por plantas producidas in vitro, iniciadas a partir de plantas de campo infectadas con el DsMV y bancos in vitro de controles negativos, respectivamente.

Las comparaciones estadísticas se realizaron con el paquete estadístico STATGRAPHIC plus 5.0 y Statistix versión 1 sobre Windows.

Evaluación de tejido foliar sintomático y asintomático de plantas sintomáticas procedentes de campo. Se utilizaron 20 plantas sintomáticas, las cuales llevaban 120 días sembradas. De cada planta se tomó una muestra de tejido foliar de la región sintomática y una muestra de la región asintomática. Las 40 muestras de tejido foliar se diagnosticaron siguiendo la metodología de ELISA-DAS.

Se comparó la media de los valores de lectura positivos de ambos grupos de muestras (sintomáticas y asintomáticas), con una prueba de Mann Whitney. Además, se compararon las medias de las razones del valor de absorbancia de cada muestra con el control negativo (VA_M/C^-) correspondiente.

Se determinó el porcentaje de fiabilidad del ELISA-DAS en tejido foliar procedente de campo a partir de la relación entre falsos negativos y el total de muestras analizadas.

Evaluación de tejido foliar de plantas producidas in vitro establecidas como controles. Se utilizaron 20 plantas producidas in vitro como controles positivos y negativos, que se establecieron a partir de plantas infectadas y sanas, respectivamente. En ambos casos, el material fue recomprobado siguiendo la metodología enunciada anteriormente. Se calculó la relación entre el control positivo y el control negativo de este diagnóstico. Se realizó la comparación de las medias de los valores de lectura positivos de muestras de campo con los obtenidos en las plantas de malanga producidas in vitro, mediante una prueba de Mann Whitney.

Para determinar la cantidad de veces que el valor de lectura positivo supera numéricamente al control negativo, se calculó la razón entre los valores de absorbancia de cada muestra y los controles negativos correspondientes en plantas producidas in vitro y plantas procedentes de campo. Los valores medios obtenidos se compararon estadísticamente con una prueba de Mann Whitney, para un intervalo de confianza del 95%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Evaluación de tejido foliar sintomático y asintomático de plantas sintomáticas procedentes de campo. Según los valores de lectura obtenidos en las 20 muestras de campo que presentaron síntomas de la enfermedad viral, en cinco muestras se obtuvieron valores de absorbancia inferiores al límite de corte, lo que representa un 25% de falsos negativos (Cuadro 1). Estos resultados pueden estar asociados a la naturaleza del tejido vegetal. Las hojas jóvenes contienen abundantes mucílagos que al macerarse forman un líquido viscoso, difícil de pipetear, lo que puede influir en la utilización de una muestra que no sea lo suficientemente homogénea, lo cual reduce la reacción Ag-Ac y produce valores de lectura que no coinciden con el estado fitosanitario de la muestra evaluada. Peralta (1997) señala que en el diagnóstico mediante ELISA se debe garantizar la homogeneidad de la muestra.

De las 20 muestras asintomáticas procedentes de campo analizadas, cuatro tuvieron valores de absorbencia negativos, correspondiente al 20% del total de muestras evaluadas. Se observó que 16 muestras restantes fueron positivas al diagnóstico, con valores de absorbancia superiores al límite de corte. Lo cual puede estar asociado a la concentración viral disponible. En este caso las plantas pueden estar infectadas, presentar síntomas de enfermedad y no ser detectadas las proteínas virales mediante ELISA. Para Zettler et al. (1987) el virus puede estar ausente o en baja concentración en tejidos que no presenten síntomas. Cabrera et al. (2010) señalan una alta concentración viral en zonas sintomáticas de hojas de malanga Xanthosoma infectadas con el DsMV.

En las muestras sintomáticas y asintomáticas positivas al diagnóstico, los valores medios de absorbancia no mostraron diferencias estadísticamente significativas según la prueba de Mann Whitney para el intervalo de confianza del 95% (Cuadro 2). No existen diferencias significativas entre las medias de la razón calculada entre el valor de absorbancia y el control negativo en las muestras positivas.

Del total de muestras procedentes de campo que fueron diagnosticadas por ELISA-DAS, nueve resultaron falsos negativos, lo que indica que esta prueba mostró un 77.5% de fiabilidad para muestras procedentes de campo. González et al. (2005) señalan que las diferentes variantes de la técnica ELISA alcanzan más del 90% de confiabilidad para el diagnóstico del DsMV. Sin embargo, Hu y Wang (1988) recomiendan el uso repetido, al menos tres veces de esta prueba. Debido a la distribución aparentemente no uniforme del virus en las especies vegetales se requieren múltiples realizaciones de ELISA en el tiempo y sobre diferentes tejidos de la planta (Hu y Wang, 1994).

La obtención de un elevado porcentaje de falsos negativos en la detección del DsMV en plantas de campo, así como de reacciones positivas en muestras de tejido asintomático de similar procedencia, indican que para realizar un diagnóstico eficiente y confiable del DsMV en malanga no es conveniente emplear muestras provenientes de campo.

Evaluación de tejido foliar de plantas producidas in vitro establecidas como controles. En las plantas producidas in vitro de malanga empleadas como controles positivos se observó mosaico y deformación en los foliolos, síntomas típicos producidos por el DsMV (Fig. 1).

La relación entre los valores del control positivo y negativo fue 6.2. Según Alberti (1998), las mejores relaciones son aquellas en las que la relación entre los valores de absorbancia de los controles positivos y negativos es menor de 10.

Al analizar los valores de la evaluación a las plantas producidas in vitro con respecto a la realizada a plantas de campo se obtuvo, que los valores de absorbancia de la lectura en plantas producidas in vitro superaron numéricamente a los obtenidos en las plantas de campon (Cuadro 4).

La comparación estadística entre las medias positivas de los valores de lectura de las plantas producidas in vitro y las plantas de campo muestran diferencias estadísticas. La razón entre valor de absorbancia de cada muestra y su control negativo correspondiente, fue mayor en plantas producidas in vitro que en plantas procedentes de campo, con diferencias estadísticas.

Este análisis permite inferir que el diagnóstico del DsMV debe realizarse con plantas producidas in vitro. La utilización de este material favorece la diferenciación entre las muestras positivas y negativas y ofrece mayor porcentaje de fiabilidad, pues disminuyen los falsos negativos. De igual modo, la razón entre el valor de absorbancia del diagnóstico en plantas producidas in vitro y su control negativo correspondiente, indican preferentemente la utilización de plantas producidas in vitro para el diagnóstico mediante ELISA-DAS. Cuando se emplean plantas producidas in vitro para el diagnóstico, los valores de lectura positivos se alejan numéricamente del control negativo, lo cual aumenta la diferencia entre los valores de absorbancia de las muestras sanas con respecto a las infectadas, y hace más eficiente el diagnóstico. Reyes et al. (2006) obtuvieron alta incidencia de DsMV en campo cuando utilizaron plantas producidas in vitro libre de virus como material de siembra. Igarza (2001) mayor facilidad y esto permite obtener una muestra homogénea para realizar el diagnóstico.

CONCLUSIONES

El diagnóstico realizado con tejido vegetal de plantas producidas in vitro aumenta la fiabilidad del inmunoensayo, ya que disminuye la incidencia de resultados falsos negativos y aumenta la diferencia cuantitativa entre muestras positivas y negativas.

LITERATURA CITADA

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