Manejo de Plántulas de Mango (Mangifera indica L.) Obtenidas in vitro para Estudios de Sanidad Vegetal

Management of mango (Mangifera indica L.) seedlings obtained in vitro for plant health studies

Martha Elena López–Estrada¹, María Concepción Acosta–Rodríguez², Gabriel Otero–Colina³, Alejandro Casimiro Michel–Aceves⁴, y David Heriberto Noriega–Cantú⁵

¹ Brigada de Educación para el Desarrollo Rural No. 90, SEP–DGETA, Maya No. 30, Iguala, Guerrero, México CP 40000.

² Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario No. 35, SEP–DGETA, km 22.5 Carr. Fed. México–Puebla, Apdo. Postal 38, Tlalpizáhuac, Edo. de México CP 56576.

⁴ Colegio Superior Agropecuario del Estado de Guerrero, SAGARPA, km 14.5 Carr. Iguala–Cocula, Apdo. Postal 6 y 9, Iguala, Guerrero, México CP 40000.

⁵ INIFAP, Campo Experimental Iguala, km 2.5 Carr. Iguala–Tuxpan, Iguala, Guerrero, México CP 40000.

Recibido: Junio 27, 2007
Aceptado: Diciembre 4, 2007

Resumen

A partir de embriones inmaduros de mango se obtuvieron plántulas in vitro libres de contaminantes externos y transmitidos por semilla; luego se trasplantaron a suelo usando sólo materiales esterilizados. Se sembraron embriones de mango de 45 a 60 días de edad en medio B5 modificado; cuando las plántulas alcanzaron 10 cm de altura se trasplantaron a suelo + perlita expandida en recipientes de plástico especialmente diseñados y ahí se regaron con solución nutritiva universal. En la etapa in vitro se presentó 10% de contaminación por Penicillium, Aspergillus, Xanthomonas y Cladosporium. La contaminación en los recipientes asépticos alcanzó gradualmente 15% después de cinco meses. En el sustrato se determinó a Cladosporium, Alternaria, Aspergillus, Rhizopus y Fusarium, mientras que en los recipientes se identificó a Helminthosporium, Curvularia, Penicillium y Syncephalastrum.

Palabras claves: Cultivo de embriones, contaminantes, sustrato, micropropagación, desinfección.

Abstract

In vitro mango seedlings free of external and seed–transmitted contaminants were obtained from immature embryos. Then, they were transplanted to soil using only sterilized materials. Mango embryos 45–60 days old were plated in modified B5 medium; and after seedlings attained 10 cm height, they were transplanted to soil + expanded perlite in specially designed plastic containers. Plants were irrigated with nutritive universal solution. During the in vitro stage 10% contamination with Penicillium, Aspergillus, Xanthomonas and Cladosporium was observed. Contamination in plastic containers gradually reached 15% after five months. Cladosporium, Alternaria, Aspergillus, Rhizopus, and Fusarium were identified in the substrate, whereas Helminthosporium, Curvularia, Penicillium, and Syncephalastrum appeared in the plastic containers.

Keywords: Embryo culture, contaminants, substrate, micropropagation, disinfection.

El cultivo de tejidos vegetales es un conjunto de técnicas que se basan en la siembra aséptica de tejidos y órganos sobre un medio de cultivo específico para lograr diferentes objetivos, entre los que destaca la obtención de plantas libres de contaminantes (Kozai, 2006). Los embriones normalmente se desarrollan dentro de óvulos que a su vez están cubiertos por los ovarios; puesto que existen ya en un ambiente estéril, la desinfección de la superficie del embrión es innecesaria a menos que se dañen las capas de la semilla o esté presente una infección sistémica (Razdan, 2003). La propagación in vitro tiene también la aplicación de obtener material biológico para trabajar sobre los aspectos de sanidad, como es el caso del presente trabajo, cuyo objetivo fue conseguir un ambiente aséptico durante el establecimiento in vitro de embriones de mango (Mangifera indica L.), germinación y trasplante a un sistema de frasco cerrado, a fin de obtener plantas libres de contaminantes para observar fenómenos patológicos. Se colectaron 250 frutos inmaduros de 45 a 60 días de edad a partir de la antesis, procedentes de árboles de mango criollo poliembriónico en Iguala, Guerrero, México. Se lavaron con detergente y se enjuagaron con agua de la llave. En la campana de flujo laminar se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 6% por 15 min y se lavaron dos veces con agua destilada estéril (autoclave, 121°C, 1.05 kg/cm², 60 min). Con instrumentos estériles se extrajo el óvulo de cada mango y se le retiró la nucela, se desinfectaron en hipoclorito de sodio al 0.6% por 10 min, se lavaron tres veces con agua destilada estéril, se sembraron en frascos con medio basal B5 modificado (Gamborg et al., 1968), y se incubaron en un cuarto de crecimiento con temperatura de laboratorio (entre 20 y 32°C) e iluminación fluorescente. Todos los contaminantes observados se sembraron en papa–dextrosa–agar (PDA) y se identificaron a nivel de género mediante las claves de Barnet y Hunter (1998). Para determinar si las semillas eran o no portadoras de gérmenes, se sembraron 50 embriones y sus nucelas en cajas Petri con PDA y otros 50 embriones y sus nucelas en medio de Nash–Snyder (peptona–PCNB, pentacloronitrobenceno) (Leslie y Summerell, 2006). A este último medio se le adicionaron sulfato de estreptomicina (1 g en 20 mL de agua) y neomicina (0.12 g en 12 mL de agua), previo tratamiento en filtros milipor de 0.22 μm de abertura y una vez que el medio se esterilizó en autoclave y bajara a una temperatura de aproximadamente 50°C. Las cajas Petri se colocaron bajo luz artificial a 25°C y se revisaron a 24, 48 y 72 h. Cuando habían alcanzado aproximadamente 10 cm de altura, las plantas se trasplantaron a suelo orgánico + perlita expandida (Agrolita®) + tezontle (2:1:1 por volumen), en recipientes especialmente diseñados (Fig. 1). Los frascos y las macetas se lavaron con agua y detergente, posteriormente, en la campana de flujo laminar se lavaron con agua destilada y con alcohol al 96%. Cuando quedaron completamente secos se introdujeron en bolsas dobles de polietileno, las que se sellaron con calor, exponiendo los recipientes a rayos UV Las torundas se hicieron con rectángulos de algodón de 6 x 7 cm envueltos en gasa. Las tapaderas se lavaron igual que los frascos y las macetas, pero se esterilizaron con autoclave, ya que resistieron el calor. En el Cuadro 1 se muestran las variantes usadas para esterilizar los diferentes materiales usados. En todos los casos, se usó el método que resultó en 100% de asepsia. Luego de su trasplante (Fig. 1), las plantas se incubaron a temperatura de laboratorio (20–32°C) y dentro de la campana de flujo laminar se regaron cada 45 días con solución nutritiva universal de Juárez–Hernández et al. (2006). A los 18 días prácticamente 100% de los embriones de mango habían germinado, lo que se asocia con su condición de semillas recalcitrantes (Corbinaeu et al., 1987). El uso de mango criollo poliembriónico permitió obtener de una a cuatro plantas de cada óvulo, las que crecieron rápidamente hasta alcanzar aproximadamente 15 cm en 21 días. El hecho de haber usado mangos poliembriónicos permite trabajar con material genéticamente diferente, con lo que se cuenta con variación en el material biológico en consecuencia mayor representatividad en la respuesta de plantas en estudios de patogenicidad. El Cuadro 2 muestra los contaminantes observados en los materiales usados a lo largo del proceso de desarrollo de las plantas. Todos los contaminantes identificados se consideran organismos oportunistas que se establecieron durante el proceso a pesar de las condiciones de asepsia, y ninguno ha sido citado como patógeno o endófíto en mango (Morales–Rondón y Rodríguez–González, 2006). En ninguno de los óvulos sembrados aparecieron contaminantes. El hecho de que las plantas hayan sido trasplantadas a suelo, ofrece como ventaja que son independientes de reguladores de crecimiento y sustancias orgánicas que podrían afectar el crecimiento de hongos o bacterias inoculadas durante estudios de patogenicidad in vitro. Las plantas obtenidas por el método in vitro desarrollado pueden ser sacadas de sus frascos y aclimatadas al ambiente de laboratorio o invernadero, en cuyo caso inevitablemente perderán su condición de asepsia. Sin embargo, podrá garantizarse que están libres de patógenos selectos y con un manejo adecuado podrán mantenerse libres de éstos o inocularlas selectivamente, lo que las hace útiles para determinar relaciones de etiología.

LITERATURA CITADA

Barnet, L.H., and Hunter, B.B. 1998. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Fourth Edition. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA. 218 p.         [ Links ]

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Juárez–Hernández, Ma.J., Baca–Castillo, G.A., Aceves–Navarro, L.A., Sanchez–García, P., Tirado–Torres, J.L., Sahún–Castellano, J. y Colinas–León, Ma.T. 2006. Propuesta para la formulación de soluciones nutritivas en estudios de nutrición vegetal. Interciencia 31:246–253.         [ Links ]

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Morales–Rondón, V. y Rodríguez–González, M. 2006. Hongos endófitos en plantaciones de mango "Haden" de la planicie de Maracaibo, Venezuela. Revista de la Facultad de Agronomía de la Universidad de Zulia (LUZ) 23:273–283.         [ Links ]

Razdan, M.K. 2003. Introduction to Plant Tissue Culture. Second Edition. Science Publishers, Inc. Enfield, New Hampshire, USA. 375 p.         [ Links ]