Efecto de Virus Fitopatógenos Sobre Características Agronómicas y Calidad del Ajo (Allium sativum L.), en el Estado de Guanajuato, México
Effect of phytopathogenic viruses on agronomic and quality characteristics of garlic (Allium sativum L.) in the state of Guanajuato, Mexico
Luis Pérez–Moreno, Dagoberto Santiago–Gómez, Esteban Rico–Jaramillo, Rafael Ramírez–Malagón y Briseida Mendoza–Celedón
Universidad de Guanajuato, Instituto de Ciencias Agrícolas, Apdo. Postal 311, Irapuato, Guanajuato, México CP 36500. Correspondencia: luispm@dulcinea.ugto.mx
]]> Recibido: Noviembre 29, 2007
Resumen
El ajo (Allium sativum) es afectado por un complejo de diferentes virus. El objetivo de esta investigación fue identificar los virus en plantas de ajo de diez localidades y determinar su efecto sobre características agronómicas y calidad del ajo. Se seleccionaron bulbos de la variedad Taiwán, de plantas aparentemente sanas y plantas con síntomas virales. Se realizaron dos experimentos independientes: en el primero se determinó la altura, diámetro y peso de bulbo y número de bulbillos por bulbo. En el segundo se analizaron las mismas variables, más la sanidad, altura de planta, número de hojas por planta y la sintomatología de virosis. También se evaluó la frecuencia y concentración relativa de los virus Leek yellow stripe virus (LYSV), Onion yellow dwarf virus (OYDV), Garlic common latent virus (GarCLV) y Shallot latent virus (SLV), utilizando la técnica DAS–ELISA. Los cuatro virus estuvieron presentes en las localidades estudiadas; los potyvirus LYSV y OYDV con una frecuencia del 96.5 y 84.4%, respectivamente y los carlavirus GarCLV y SLV con una frecuencia del 87.5 y 81.0%, respectivamente. Los resultados muestran que el complejo viral presenta un efecto detrimental sobre las características agronómicas y de calidad del ajo en las diez localidades del estudio.
Palabras clave: Mosaico del ajo, complejo viral, rendimiento, calidad.
Abstract
Garlic (Allium sativum) is affected by a complex of different viruses. The objective of this investigation was to identify viruses in garlic plants from ten locations and to determine their effect on agronomic characteristics and quality of garlic. Bulbs from the variety Taiwan were collected from apparently healthy plants and plants with virus symptoms. Two independent experiments were conducted. In the first, one height, diameter, bulb weight, and number of bulbils per bulb were evaluated. In the second experiment, the same parameters were evaluated, but the overall plant health, plant height, number of leaves per plant, and virus symptoms were included. The frequency and relative concentration of Leek yellow stripe virus (LYSV), Onion yellow dwarfvirus (OYDV), Garlic common latent virus (GarCLV), and Shallot latent virus (SLV) were also evaluated using the DAS–ELISA technique. The four viruses were present in all ten locations. The potyvirus LYSV and OYDV showed a frequency of 96.5 and 84.4%, respectively, while the carlaviruses GarCLV and SLV showed 87.5 and 81.0%, respectively. The results indicate that the viral complex present in garlic affects detrimentally the agronomic and quality characteristics of garlic in the ten localities were the study was conducted.
Key words: Garlic mosaic, viral complex, yield, quality.
]]>Por la importancia económica y social que el ajo (Allium sativum L.) representa para México y en especial para el estado de Guanajuato, es necesario prestar atención a los factores que ocasionan pérdidas a la producción, siendo uno de ellos las enfermedades, y entre éstas, las causadas por los virus. La producción de ajo en México se ha reducido debido a las infecciones virales, las cuales han presentado una incidencia elevada en lotes comerciales de la región del Bajío mexicano (Pérez et al., 1997; 2006; 2007; Pérez y Rico, 2004; Ramírez–Malagón et al., 2006). El cultivo de ajo es infectado por mezclas de virus que hacen compleja su identificación (Cadilhac et al., 1976; Delecolle y Lot, 1981; Fajardo et al., 2001). El complejo viral está integrado por más de ocho especies pertenecientes a los géneros Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus, y producen una enfermedad denominada el mosaico del ajo (Cafrune et al., 2005). El sistema de propagación vegetativo lleva a la acumulación de virus en las plantas de ajo, permitiendo su diseminación e induciendo pérdidas del rendimiento (Davis, 1995). Los potyvirus, virus enanismo amarillo de la cebolla (Onion yellow dwarf virus: OYDV) y virus rayado amarillo del puerro (Leekyellow stripe virus: LYSV), y varias especies de allexivirus son los patógenos virales más extendidos en los cultivos del género Allium a nivel mundial. Los virus OYDV y LYSV de la familia Potyviridae son los más comunes y probablemente los más dañinos al follaje de ajo y por consiguiente los que más afectan el rendimiento y la calidad de los bulbos (Dovas et al., 2001). Messiaen et al. (1981) reportaron reducciones del rendimiento de ajo por efecto de las infecciones virales del 25 al 50% dependiendo del cultivar sembrado. Lot et al. (1998) compararon los rendimientos de ajo libre de los virus OYDV y LYSV contra material de propagación comercial, y observaron que la infección simultánea de ambos virus causa reducciones significativas en peso y desarrollo del bulbo, estimando una pérdida del rendimiento debido a la infección de los virus de aproximadamente un 50%. Las plantas de ajo infectadas por virus pueden reducir más del 45% el número de bulbillos por bulbo, comparado con los producidos por las plantas sanas (Havranek, 1974). Cuando las plantas de ajo son infectadas por el LYSV, el virus impide una buena emergencia de plántulas, reduce la altura y el número de hojas de las plantas, lo cual se traduce en reducción del rendimiento (Lunello et al., 1999). Cafrune et al. (2005), evaluaron el efecto de inocular dos Allexivirus comparado con ajo sano y ajo comercial que contenía el complejo viral de campo, sobre componentes del rendimiento y calidad de los cultivares de ajo Morado–INTA y Blanco IFFIVE; encontraron que el Allexivirus GarMBFV produjo siempre bulbos menores que el tratamiento sano, con reducciones del 14 al 32% en peso y del 6 al 11% en calibre. Este virus redujo el número de bulbillos por bulbo más en ajo Blanco que en Morado, detectándose en este último una disminución del 18 al 22%. Perotto et al. (2005a), evaluaron el efecto del complejo viral del ajo sobre el número y peso de bulbillos, peso y calibre de los bulbos, en ajo sano y enfermo de los cultivares Blanco IFFIVE y Morado–INTA, detectando que los virus causaron efectos deletéreos. En el cultivar Blanco IFFIVE el peso se redujo entre 57 al 61% y el número de bulbillos de 20 al 48%; sin embargo, en el cultivar Morado–INTA la disminución fue menor, el peso se redujo entre 0 al 36% y el número de bulbillos de 9 al 33%. Perotto et al. (2005b) evaluaron el efecto de un Allexivirus serológicamente relacionado al Garlic virus D en suma al de otros virus (Potyvirus y Carlavirus) que recontaminaron el cultivo de ajo bajo condiciones de campo, detectando diferencias significativas respecto a las plantas que estuvieron originalmente libres de virus, encontrando 12% de reducción en el peso, 7% en el calibre de los bulbos y 40% en el número de bulbillos por bulbo. La reducción en el rendimiento de ajo causado por la mezcla de virus es alta; sin embargo, la contribución al daño total de cada uno de los virus individuales de la mezcla no se ha investigado todavía en México, salvo en el caso del grupo Potyvirus (OYDV y LYSV) (Pérez y Rico, 2004; Ramírez–Malagón et al., 2006). El presente trabajo tuvo como objetivos: a) determinar el efecto del complejo viral sobre algunas características agronómicas y de calidad del ajo, durante los ciclos otoño–invierno 20042005 y 2005–2006, en el estado de Guanajuato, México; y b) identificar los virus presentes en el cultivo del ajo durante el ciclo otoño–invierno 2005–2006, en follaje de plantas originadas de bulbos aparentemente sanos (asintomáticos) y aparentemente enfermos con distintos síntomas de probable origen viral, de diferentes zonas productoras del estado de Guanajuato, México.
MATERIALES Y MÉTODOS
Primer ciclo de cultivo. Material genético. Se seleccionaron cinco plantas de la variedad Taiwán con follaje aparentemente sano (asintomático) y cinco aparentemente enfermas con distintos síntomas presuntivos de una virosis, por ejemplo: enchinamiento y/o enrollamiento, mosaico, deformación de hojas, amarillamiento y ampollamiento, bandeado y enanismo, en cada una de 10 localidades de municipios del estado de Guanajuato: "Monte Cristo 2, Los Rodríguez", de San Miguel de Allende y "Tabla 1, El Ramillete", "Tabla 2, El Ramillete" y "Tabla 3, El Ramillete", de San Luis de La Paz, en la zona norte, "Santa Teresa Tabla 3, Valtierrilla" y "Santa Teresa Tabla 4, Valtierrilla", de Salamanca y "Pozo Alto 1, El Pato", "Pozo Alto 2, El Pato", "Laurel 1, El Pato", "Bodegas, El Pato", de Villagrán. Los bulbos de dichas plantas se produjeron en el ciclo otoño–invierno 2004–2005 y se cosecharon en marzo de 2005. Los bulbos cosechados se colocaron en bolsas de papel y se mantuvieron almacenados a temperatura ambiente de laboratorio hasta el momento de su siembra. Se analizaron las variables: a) altura, b) diámetro, c) peso y d) número de bulbillos por bulbo; se utilizó un diseño experimental completamente al azar, con un arreglo factorial, con cinco repeticiones. El factor A correspondió a las localidades de procedencia de los bulbos, con 10 niveles; el factor B se relacionó con la condición de sanidad de la planta de la que provenía el bulbo, el cual tuvo dos niveles: a) bulbos de plantas aparentemente sanas (asintomáticas) y b) bulbos de plantas aparentemente enfermas con distintos síntomas de probable origen viral; lo anterior dio un total de 20 tratamientos. La comparación múltiple de medias se hizo con la prueba de Tukey (p < 0.05).
Segundo ciclo de cultivo. La siembra del experimento se realizó el 3 de octubre de 2005 en el Campo Agrícola Experimental del Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Guanajuato (ICA–UG), en Irapuato, Guanajuato, México. Los bulbillos de cada uno de los 50 bulbos seleccionados por su aparente sanidad y los 50 bulbos seleccionados por su sintomatología de posible enfermedad viral, se sembraron en surcos individuales de 1.5 m de largo y 0.75 m de ancho. Se analizaron las variables: a) altura de planta en cm; b) número de hojas por planta; c) sintomatología de virosis, medido con una escala de 1 a 5, donde: 1 = plantas sin ningún síntoma de virosis; 2 = plantas con ligeros síntomas de virosis; 3 = plantas con síntomas regulares de virosis; 4 = plantas con síntomas fuertes de virosis y 5 = plantas con síntomas intensos de virosis; d) altura de bulbo en cm; e) diámetro de bulbo en cm; f) peso de bulbo en gramos; y g) número de bulbillos por bulbo. Se utilizó un diseño de bloques completamente al azar, con un arreglo factorial, con cinco repeticiones. La comparación múltiple de medias se hizo con la prueba de Tukey (p < 0.05). También se evaluó la presencia y concentración de los virus estudiados que fueron: los potyvirus, Virus enanismo amarillo de la cebolla (OYDV) y Virus rayado amarillo del puerro (LYSV), y los carlavirus, virus latente del shallot (Shallot latent virus: SLV) y virus latente común del ajo (Garlic common latent virus: GarCLV), se utilizó la técnica de ELISA para detectar la concentración en cada muestra.
Fechas de evaluación y colectas. La detección viral se realizó en tres fechas de muestreo de follaje, que se llevaron a cabo el 3 de diciembre de 2005, 7 de febrero y 22 de marzo de 2006, respectivamente. Se colectó una hoja de cada una de cinco plantas de la parcela experimental, éstas pudieron ser plantas de ajo con síntomas presuntivos de una virosis, por ejemplo: enchinamiento y/o enrollamiento, mosaico, deformación de hojas, amarillamiento y ampollamiento, bandeado y enanismo o también, hojas de plantas de ajo aparentemente sanas (asintomáticas). El número de muestras totales colectadas fue de 100 por cada uno de los tres muestreos realizados. Las muestras se colocaron en bolsas de plástico y se mantuvieron en congelación (–20°C) hasta el momento de su procesamiento.
Procesamiento de las muestras. Se realizó en el Laboratorio de Fitopatología del ICA–UG. Para la detección de los virus se utilizó la técnica de inmunoabsorción enzimática denominada sándwich de doble anticuerpo (DAS), para desarrollarse en dos días (Clarck y Adams, 1977; Cruz y Frías, 1997). Se utilizaron los anticuerpos para las proteínas de cubierta: GarCLV (Virus latente común del ajo), LYSV, OYDV y SLV. Para los virus GarCLV, LYSVy OYDV se utilizaron anticuerpos conjugados con la enzima fosfatasa alcalina, mientras que para el SLV, la enzima estaba conjugada con la enzima peroxidasa. Los antisueros (Agdia Inc.), se mantuvieron en condiciones de refrigeración (4°C) o a temperatura ambiente de acuerdo a lo que recomienda el fabricante, hasta el momento de efectuar las pruebas. Como testigo positivo se usó el control del método (method control) y el testigo negativo (negative control, extract of onion leaves) ambos de Agdia Inc., se mantuvieron en condiciones de refrigeración (4°C) hasta el momento de efectuar las pruebas. La lectura de absorbancia (concentración del virus) se realizó en el espectrofotómetro BIO–RAD Modelo 3550–UV, a una longitud de onda de 405 nm para los anticuerpos de GarCLV, LYSV y OYDV con la enzima conjugada de fosfatasa alcalina, y 630 nm para el virus SLV con peroxidasa.
Evaluación de resultados y determinación del límite de detección. Se obtuvieron lecturas por duplicado de cada muestra, y el valor medio de cada par fue el asignado. El valor del testigo sano se obtuvo con el promedio de los dos valores promedio de lectura de absorbancia del testigo sano (negativo), que se obtuvieron para cada virus en las diferentes muestras analizadas. Como criterio para determinar el límite de detección, se utilizó el valor duplicado de la desviación estándar (S), del testigo sano. Todo valor por arriba de este límite de detección se consideró positivo.
]]> RESULTADOS
Primer ciclo de cultivo. Se observaron diferencias altamente significativas para localidades de procedencia de los bulbos y para condición de sanidad, y no significancia para la interacción de localidades por condición, con coeficientes de variación de 10.8, 11.8, 31.0 y 26.7% en las variables altura, diámetro, peso y número de bulbillos por bulbo, respectivamente; lo anterior significa que tanto las localidades de procedencia evaluadas como las condiciones de sanidad probadas, propiciaron diferentes alturas, diámetros, pesos y números de bulbillos por bulbo. El Cuadro 1 muestra que los bulbos de las localidades de "Pozo Alto 1, El Pato" y "Monte Cristo 2, Los Rodríguez", fueron los que mostraron los mayores valores en las variables evaluadas, comparado con "Santa Teresa Tabla 3, Valtierrilla" y "Tabla 1, El Ramillete". La condición de planta sana (asintomática) propició los mejores resultados (Cuadro 2).
Segundo año de trabajo. Frecuencia de la ocurrencia de LYSV, GarCLV, SLV y OYDV. A partir del análisis presuntivo reportado, se confirmó que los cuatro virus están presentes en el follaje de las plantas originadas de los bulbos provenientes de los municipios de Villagran, San Miguel de Allende, San Luis de la Paz y Salamanca, Guanajuato (Figs. 1 y 2 y Cuadro 3). Los virus detectados en orden de frecuencia como promedios del primero, segundo y tercer muestreo fueron los potyvirus LYSV y OYDV con 90.0 y 78.3%, respectivamente; seguido de los carlavirus GarCLV y SLV con un 81.0% y 75.3%, respectivamente (Figs. 1 y 2 y Cuadro 3). Efectos sobre las características agronómicas. Se observaron diferencias altamente significativas para localidades de procedencia de los bulbos y para condición de sanidad y no significancia para la interacción de localidades por condición, con coeficientes de variación de 11.5, 6.6, 43.7, 8.9, 9.7, 27.5, 20.8% en las variables altura de planta, número de hojas, sintomatología de virosis, altura, diámetro, peso y número de bulbillos por bulbo, respectivamente; lo anterior significa que el material genético de ajo el cual provenía de alguna de las diez localidades evaluadas, así como la condición de sanidad que presentaba dicho material genético, propició que se produjeran diferentes alturas, diámetros, pesos y números de bulbillos por bulbo. Los Cuadros 4 y 6 muestran que las plantas de ajo originadas en las localidades de "Pozo diámetro y peso de bulbo, comparado con "El Ramillete Tabla 1" y "El Ramillete Tabla 3". La condición de planta sana (asintomática) propició los mejores resultados (Cuadros 5 y 7).
DISCUSIÓN
El sistema de propagación vegetativa del ajo mantiene de una generación a otra sistemas bióticos, especialmente lleva a la acumulación de virus en las plantas, permitiendo su diseminación e induciendo pérdidas del rendimiento durante ciclos de cultivo sucesivos (Davis, 1995). Los resultados obtenidos muestran que en las siembras comerciales de ajo del estado de Guanajuato, México, se presentan infecciones complejas de virus. Otros estudios reportan resultados similares como los de Fajardo et al. (2001) y Conci et al. (2002) para siembras comerciales de ajo de Brasil y Argentina, respectivamente. En relación a los cuatro virus estudiados, éstos están presentes en la mayoría de las plantas muestreadas, observando su presencia en el material genético de ajo de las diez localidades incluidas en el estudio. Por otra parte, las plantas infectadas presentan sintomatologias similares, tales como: enchinamiento, mosaico, deformación de hojas, amarillamiento y achaparramiento, lo cual imposibilita asociar una sintomatologia especifica con alguno de los virus en particular por la sola observación óptica, y no se puede determinar con precisión que virus están presentes al estar frente al síntoma. Es decir, un solo virus o un complejo viral pueden ocasionar una sintomatologia similar, aún cuando existan diferencias relacionadas con el estado fisiológico del cultivo, la relación virus–cultivar y la temperatura del ambiente (Fig. 3). Por otra parte, Peña–Iglesias y Ayuso (1982), habían reportado que muchas veces los sintomas virales no son visibles y que un gran número de agricultores ven reducción del tamaño del bulbo sin saber a qué atribuirlo aunque se presuma la presencia de virus. Esa determinación sólo es posible con el uso de técnicas inmunológicas como se hizo en el presente estudio o con el uso de técnicas de RT–PCR.
]]> De manera general, los porcentajes de muestras seropositivas fueron mayores en el primer y tercer muestreo y menores en el segundo. Lo anterior no significa que los virus hayan desaparecido de las plantas en el segundo muestreo, sino que posiblemente se haya reducido el titulo viral y por lo tanto la prueba de ELISA resultó negativa. Resultados similares han sido reportados por Koch y Salomon (1994) quienes observaron cambios en las concentraciones de OYDV a través del tiempo al analizar plantas obtenidas de meristemos. Asimismo, Conci et al. (2002) reportaron cambios en las concentraciones de LYSV en plantas de ajo en diferentes estadios de desarrollo del cultivo. Lo anterior demuestra la importancia de acotar diferentes tiempos de lectura viral para tener resultados confiables y reducir la posibilidad de diagnosticar plantas enfermas como sanas. En el presente trabajo se encontró que los potyvirus OYDV y LYSV fueron los más conspicuos en las diferentes materiales evaluados, con porcentajes de infección de 78.3 y 90.0, respectivamente. Esto concuerda con los porcentajes de potyvirus reportados por Alvarado–Rodríguez (1999) y por Pérez et al. (2007), quienes encontraron que 64 y 62% de las plantas muestreadas estaban infectadas por potyvirus, respectivamente. Los resultados obtenidos también muestran que la presencia del complejo viral afectó negativamente las características agronómicas, ya que en una planta de ajo infectada por virus se afecta el tamaño, peso y altura de sus bulbos. Se reportan resultados similares en otros estudios, como en los de Messiaen et al. (1981), para las siembras comerciales de FrmiciayporCafrunee/a/. (2005), Lunelloeía/. (1999), Perotto et al. (2005a), Perotto et al. (2005b) para las siembras comerciales de Argentina. Muchos productores de ajo seleccionan los bulbillos más grandes para la siembra con lo cual obtienen bulbos más grandes; el tamaño de diente de una determinada planta es afectado por su posición en el bulbo, por las condiciones ambientales, la fertilidad del suelo y por el daño de otros factores bióticos. La selección de bulbos más grandes y por lo tanto bulbillos más grandes dentro de un campo comercial de ajo. Dirige indirectamente a la selección de plantas en las cuales la concentración de los virus es reducida (Fig. 4). Esta práctica se traduce en un incremento en el costo de la semilla de ajo y por ende en los costos de producción. La eliminación de la mayor parte de las plantas que contienen alta concentración de los virus se traduce en incrementos en el rendimiento, debido principalmente aun incremento de más del 50% del tamaño de los bulbos y de los bulbillos, debido a un daño menor y un incremento en vigor de las plantas libres de virus (Fig. 4) (Lot et al., 1998; Oh era/., 1994; Verbeek et al., 1995; Walkey, 1990; Walkey y Antill, 1989). La disminución en diámetro, altura, y peso de bulbo en ias plantas con síntomas demuestra el efecto de los virus sobre el rendimiento y la calidad, estos resultados son similares a los reportados por otros autores (Canavelli et al., 1998; Conci, 1997; Lot et al., 1998; Walkey y Antill, 1989). Las ventajas de usar semilla de ajo sana en comparación con el uso de semilla infectada por virus quedaron demostradas en los experimentos realizados en este estudio. La calidad y el rendimiento de los materiales de ajo sanos (asintomáticos) fueron más altos en términos de altura, diámetro, peso y número de bulbillos por bulbo (Fig. 4). El efecto de los virus sobre las plantas induce bajos rendimientos, lo que se traduce en pérdidas para el productor, ya que actúan en los tejidos de las plantas afectando las hojas mediante la producción de mosaico, enrollamiento de hojas, amarillamiento, enanismo, franjas amarillas en hojas, reducción en altura y número de hojas de las plantas de ajo (Fig. 3). Por otra parte, la evaluación de las variables: altura de planta, número de hojas y sintomatología de virosis, mostró respuestas significativas en las localidades de "El Ramillete Tabla 1" y "El Ramillete Tabla 3" (Cuadro 4), pudiendo constatar que las plantas enfermas dan lugar a resultados pobres (Cuadro 5), asimismo, para las variables evaluadas en bulbos (altura, diámetro, peso y número de bulbillos, se pueden observar respuestas no significativas en las localidades de "Pozo Alto 1, El Pato" y "Santa Teresa Tabla 3" (Cuadros 6 y 7), esto puede ser debido a la época en que se realizó cada muestreo, al origen de la semilla botánica del cultivar sembrado por los diferentes productores, a la región del estado de Guanajuato donde se siembra el ajo o a la concentración de estos virus que están teniendo las plantas; se observa que un bulbo enfermo es afectado en su altura, diámetro, peso y en el número de bulbillos, lo que lo lleva a obtener una calidad deficiente. Con base en los resultados encontrados es imprescindible conocer algunos aspectos relacionados con la sintomatología y con la epidemiología de los virus en las zonas productoras de ajo del estado y del país, tales como su distribución, su forma de diseminación, rango de hospedantes, transmisión por semilla, prácticas de cultivo, y conocer su efecto en el rendimiento, para poder establecer las medidas de control que sean necesarias.
CONCLUSIONES
Se detectó la presencia en diferentes proporciones, de los virus GarCLV, SLV, LYSV y OYDV. La concentración de los cuatro virus en el follaje de ajo fue diferente de acuerdo a la época en que se realizó cada muestreo. En algunas de las plantas que no mostraban síntomas aparentes de virosis, se detectaron algunos de los virus estudiados. Una misma sintomatología puede ser causada por uno o más virus en las plantas enfermas de ajo. Se observó el impacto en el rendimiento y calidad de los bulbos, de los cuatro virus estudiados. Los daños causados por los virus en las plantas repercuten en el rendimiento y calidad del ajo, mismo que se traduce en pérdidas económicas para el productor. Se sugiere sembrar semilla sana cada ciclo de producción, lo cual se puede lograr mediante el cultivo de meristemos y la termoterapia, o bien, seleccionando como material de siembra las plantas que no presenten sintomatología de virosis al momento de la cosecha.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece el financiamiento parcial para la realización del proyecto, a la Dirección de Investigación y Posgrado de la Universidad de Guanajuato (Convocatoria 2004, Apoyo a la Investigación) y al Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de Guanajuato (Convenio No. 06–16–K117–23).
]]>LITERATURA CITADA
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