Morfometría geométrica y filogenia en Rhodniini (Hemiptera, Reduviidae) de Venezuela

Geometric morphometrics and phylogeny in Rhodniini (Hemiptera, Reduviidae) of Venezuela

Ana SOTO–VIVAS,¹ Jonathan LIRIA ² y Efraín de LUNA ³

¹ Centro de Estudios Enfermedades Endémicas y Salud Ambiental. Servicio Autónomo Instituto de Altos Estudios en Salud Doctor Arnoldo Gabaldon, Avenida Bermúdez Sur N° 93, antiguo edificio de Malariología, Maracay, Estado Aragua, Venezuela; apartado postal 2171, 2113/ZIP 2101–A. Teléfono: (0058) 2432412846.

² Departamento de Biología – FACYT, Universidad de Carabobo, Carabobo–Venezuela. E–mail: jliria@uc.edu.ve

Autor corresponsal:
SOTO–VIVAS, Ana
E–mail: anasoto.vivas@gmail.com

Recibido: 15/04/2010
Aceptado: 22/09/2010

RESUMEN

Palabras clave: Triatominae, Rhodnius, Psammolestes, morfometría, sistemática.

ABSTRACT

Tribe Rhodniini includes Rhodnius Stål and Psammolestes Bergroth. Enzymatic and molecular evidence suggest the tribe is monophyletic. Most species are wild, living in palms and bird nests. Traditionally both genera were considered related; nevertheless, molecular studies don't support the Rhodnius monophyly. The goal was to phylogenetically analyze morphometric variation in wing architecture in support of Rhodniini taxonomy and systematics. We photographed 524 wings of five representatives of Rhodniini: Psammolestes arthuri (Pinto) (n = 89), Rhodnius pictipes Stål (n = 21), R. robustus Larrousse (n = 24), R. prolixus Stål (n = 16), and R. neivai Lent (n = 22). As outgroups we studied four representatives of Triatomini: Eratyrus mucronatus Stål (n = 15), Panstrongylus rufotuberculatus (Champion) (n = 45), P. geniculatus (Latreille) (n = 183), and Triatoma maculata (Erichson) (n = 109). Landmark coordinate (x, y) configurations were registered and aligned by Generalized Procrustes Analysis. Covariance Analyses were implemented with proportions of re–classified groups and MANO VA. Then, wing shape variables (confidence intervals from relative warps) and centroid size were cladistically analysed. Statistical analyses of variance found not significant differences in wing isometric size (Kruskal–Wallis) among P. arthuri–R. neivai–R. pictipes; R. robustus–R. prolixus–T. maculata and between P. rufotuberculatus–P. geniculatus. The a posteriori re–classification was perfect in E. mucrunatus 100% and R. pictipes, followed by T. maculata 96%, R. neivai 95%, P arthuri 93.2%; R. prolixus 87.5%, P. geniculatus 87.4%, P. rufotuberculatus 84.4%, and R. robustus 76%. Cladistic analyses under parsimony selected two most parsimonious trees (L=4.461 IC=0.973 and IR=0.979), where the strict consensus showed a monophyletic group with Panstrongylus (rufotuberculatus + geniculatus) and Triatoma + Rhodniini (Rhodinus + Psammolestes), but internally it shows the paraphyly of Rhodnius regarding Psammolestes. The congruence between these results and previous molecular analyses in Rhodniini, reveal the phylogenetic information of our morphometric characters as support to systematic studies, allowing the combination of geometric morphometrics and phylogenetic methods for the first time in this group.

Key words: Triatominae, Rhodnius, Psammolestes, geometric morphometrics, systematics, cladistic analyses.

INTRODUCCIÓN

Triatominae se clasifica como subfamilia de Reduviidae (Hemiptera, Heteroptera) y se define por su hábito hematófago y adaptaciones morfológicas asociadas a la alimentación con sangre. Hasta la fecha se han descrito 140 especies (Schofield & Galvão 2009). Los triatóminos son vectores de Trypanosoma cruzi (Chagas 1909) agente causal de la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas, una de las parasitosis de mayor importancia médica en América Latina (Lent & Wygodzinski 1979, World Bank 1993). La taxonomía de los triatóminos ha sido estudiada por varios autores examinando la variación de fuentes de evidencia morfológica y molecular bajo distintos enfoques analíticos (Dujardin et al. 1997, 1988, Lyman, et al. 1999, Hypsa et al. 2002, Schofield & Galvão, 2009). No obstante, la clasificación de las especies de Rhodnius, que incluye importantes especies transmisoras de tripanosomiasis, todavía es poco robusta. Este trabajo presenta nueva evidencia de los patrones ínter específicos de variación alar, la cual se interpreta con ayuda de análisis de morfometría geométrica y análisis filogenéticos. Estos análisis combinados permiten por primera vez resaltar la importancia de la forma de las alas en la clasificación e identificación de especies de Rhodnius.

La subfamilia Triatominae está conformada por cinco tribus, definidas por caracteres relacionados a la hematofagia. Especialmente las tribus Triatomini y Rhodniini presentan marcada disparidad morfológica y adaptaciones fisiológicas, por ejemplo al nivel de glándulas salivares (Schofield 1988, 1996, Catalá 1997, Ribeiro et al. 1998). La tribu Rhodniini incluye los géneros Rhodnius Stål, 1859 y Psammolestes Bergroth, 1911. Evidencia enzimática y molecular sugieren la monofilia de la tribu (Lent & Wygodzinsky 1979, Schofield 1988, 1994, Monteiro et al. 2000, Tartarotti et al. 2006). Pero, estudios recientes han cuestionado la monofilia de Rhodniini (Lyman et al. 1999; Monteiro et al. 2000; Hypsa et al. 2002). La mayoría de las especies de la tribu son de hábitats selváticos viviendo en las palmas y en los nidos de las aves. Solo algunas especies de Rhodnius han logrado colonizar las viviendas humanas, por lo cual son consideradas con gran importancia vectorial; tal es el caso de Rhodnius prolixus Stål, 1859 el vector principal de la enfermedad de Chagas en Venezuela, Colombia y parte de Centro América.

Dentro del género Rhodnius se clasifican 16 especies y se han propuesto dos grupos de difícil identificación dado a su similitud morfológica. El primero es el "complejo prolixus" formado por cinco especies (R. prolixus, R. robustus Larrousse, 1927, R. neglectus Lent, 1954, R. domesticus Neiva y Pinto, 1923 y R. nasutus Stål, 1859). El segundo es el "complejo pallescens" formado por ocho especies (R. pallescens, R. colombiensis Mejia, Galvão & Jurberg, 1999, R. ecuadoriensis Lent & León, 1958, R. paraensis Sherlock, Guitton & Miles, 1977, R.. pictipes Stål, 1872, R. dalessandroi Carcavallo & Barreto, 1976, R. brethesi Matta, 1919 y R. stali Lent, Jurberg & Galvão, 1993). Para las otras tres especies no se han encontrado elementos morfológicos y moleculares que las ubiquen (Lent & Wygodzinski 1979, Dujardin et al. 1999, Schofield & Dujardin 1999). Dentro del "complejo proxilus" algunos autores sugieren que R. robustus es la variante selvática y R. prolixus es derivada de las poblaciones domiciliadas (Harry et al. 1992; Harry 1993a, b; Barrett 1995, Schofield & Dujardin 1999). El género Rhodnius esta representado en Venezuela por seis especies: R. robustus, R. prolixus, R. pictipes, R. neivai, R. brethesi y R. pallescens (Cova & Suárez 1959, Lent & Wygodzinsky 1979, Torrealba et al. 1985, Osuna 1984, Carcavallo et al. 1999, Galvão et al. 2003, Schofield & Galvão 2009, Soto–Vivas 2009).

La morfometría geométrica (Bookstein 1991, Rohlf & Marcus 1993, Adams et al. 2004, Zieldich et al. 2004) ha sido utilizada en insectos de importancia médica como flebotominos, mosquitos y triatóminos, para diferenciar poblaciones domiciliadas y silvestres, en estudios ontogéneticos (Dujardin et al. 1997, 1998, Feliciangeli et al. 2007, Soto–Vivas et al. 2007, Gonacalves 2008), análisis de variaciones altitudinales (Belen et al. 2004), para detectar diferencias en poblaciones de campo y colonia (Jaramillo et al. 2002), o entre diferentes regiones geográficas (Monroy et al. 2003, Lehmann et al. 2005, Yurtas et al. 2005), e inclusive como herramienta taxonómica en la discriminación de especies (Matias et al. 2001, Calle et al. 2002, 2008). Las herramientas morfométricas han demostrado su utilidad en la discriminación de insectos vectores que no pueden identificarse por medio de caracteres morfológicos tradicionales, así como en estudios de variabilidad intra–específica (Dujardin et al. 1997, 1998, Rubio–Pallis 1998, Calle et al. 2002, 2008, Yurtas et al. 2005). Los datos morfométricos también han sido empleados para la postulación de hipótesis cladísticas, demostrando que estos caracteres contribuyen en el apoyo de grupos monofiléticos (Guerrero et al. 2003, Acero et al. 2005, Camul & Polly 2005, Bogdanowicz et. al. 2005, Goloboff et al. 2006, González–José et al. 2008, de Bivort et al. 2010). Más recientemente, Catalano et al. (2010) han desarrollado algoritmos para realizar análisis cladísticos a partir de la inclusión directa sin codificación de las coordenadas x, y (y 3D) de especímenes alineados.

Como parte de un estudio taxonómico y biogeográfico de los Triatominae de Venezuela, el presente trabajo utiliza herramientas de la morfometría geométrica en combinación con análisis cladísticos con el fin de estudiar la variación de la arquitectura alar, determinando diferencias y cambios en tamaño y conformación, como apoyo a la taxonomía y sistemática de las especies de la tribu Rhodniini.

MATERIAL Y MÉTODOS

Adquisición de datos. Se revisó material depositado en siete colecciones entomológicas: Museo Cova–García, del Instituto de Altos Estudios en Salud Pública "Dr. Arnoldo Gabaldon"; Museo de Zoología Agrícola, Fac. de Agronomía, Universidad Central de Venezuela (MIZA), Museo Entomológico "José M. Osorio", Universidad Centro Occidental de los Llanos (UCLA); Colección Herman Lent, Universidad de los Andes (ULA); Colección de Artrópodos, Universidad del Zulia (LUZ); Colección de Entomología, Universidad Experimental Francisco de Miranda; Colección privada Familia Romero (FR). Se fotografiaron digitalmente las alas de 524 ejemplares de cinco especies de Rhodniini (P. arthuri (n = 89), R. pictipes (n = 21), R. robustus (n = 24), R. prolixus (n = 16) y R. neivai (n = 22)) y cuatro especies de Triatomini (Eratyrus mucronatus Stål, 1859 (n = 15), Panstrongylus rufotuberculatus (Champion, 1899) (n = 45), P. geniculatus (Latreille, 1811) (n = 183) y Triatoma maculata (Erichson, 1848 (n = 109)). En cada ala se ubicaron seis puntos anatómicos de referencia (PAR 1–6), los cuales corresponden con el tipo I sensu Bookstein (1991): Base de la vena transversal cu–pcu (PAR1), Base de la vena transversal m–cu (PAR2), doblez de la vena m (PAR3), intercepción de la vena R + Sc (PAR4), Ápice de la vena M (PAR5) y ápice de la intercepción cu–Pcu (PAR6). Los PAR 1–4 se ubican en yuxtaposición con el área coriácea del ala. La configuración de los seis pares de coordenadas xy de cada ala (Fig. 1) se capturó mediante la ayuda del programa TPSDig (Rohlf 2007).

Análisis de morfometría geométrica. A partir de la matriz de 524 configuraciones de coordenadas geométricas de los seis puntos (PAR1–6) se realizó el Análisis Generalizado de Procrustes, con el programa CoordGen (Sheets 2005a) para una su–perimposición Procrustes y luego extraer una matriz con las variables de conformación (partial warps = Pw) y el tamaño centroide (CS). Esta matriz de Pw se usó para un Análisis de Variables Canónicas con el programa CVAGen (Sheets 2005b), mediante el cual también se obtuvo la proporción de grupos (= especies) re–clasificados y MANOVA por cada eje canónico. Las diferencias en los valores de CS entre las especies fueron analizadas mediante la prueba de Kruskall–Wallis (P 0,05). Luego se calcularon las deformaciones relativas respecto a la configuración consenso (relative warps o Rw) con a = 0 en el programa TpsRelw (Rolhf 2003) para su inclusión como caracteres continuos en los análisis filogenéticos.

RESULTADOS

Tamaño isométrico. No se encontraron diferencias significativas (Kruskal–Wallis: X ² = 443.49 p < 0.001) en el tamaño isométrico del ala (Cuadro 1) en las especies P. arthuri (5.776 ± 0.037) –R. neivai (5.764 ± 0.125) –R. pictipes (6.176 ± 0.113); R. robustus (7.829 ± 0.226) – R. prolixus (7.525 ± 0.194) – T. maculata (7.272 ± 0.063); P. rufotuberculatus (9.853 ± 0.088) – P. geniculatus (10.029 ± 0.059).

CVA y cambio de la forma del ala. En el Cuadro 2 se presentan los resultados de la prueba de re–clasificación en los siete ejes discriminantes del CVA con los valores del Wilks lambda, X², grados de libertad y probabilidades. La clasificación de las 524 muestras en los grupos a priori fue basada según la identificación de las especies por la morfología tradicional y la re–clasificación a posteriori depende de las distancias de Mahalanobis entre cada muestra y la media de cada especie. Las muestras re–clasificadas perfectamente al 100% fueron las de E. mucronatus (15/15) y R. pictipes (21/21), seguidas de T. maculata con 96% de las muestras (105/109) y R. neivai 95% (19/21), P arthuri 93.2% (83/89). Las especies con porcentaje de reclasificación inferior fueron R. prolixus 87.5% (14/16), P. geniculatus 87.4% (160/183), P. rufotuberculatus con 84.4% (38/45) y R. robustus 76% (19/25).

Visualización de los cambios de la forma alar sobre el espacio del CVA.

Las especies pertenecientes a la Tribu Rhodniini, mostraron un desplazamiento de todos los PAR. La base de la vena transversal cu–pcu se mueve hacia el área coriácea del ala, mientras que la base de la vena transversal m–cu y la vena M y la intercepción R–Scu muestran un desplazamiento hacia el interior del ala; así mismo el ápice de la vena M se mueve diagonalmente hacia arriba, y el ápice de la intercepción cu–Pcu se introduce lateralmente hacia el ala, en consecuencia el corium del ala de las especies de la Tribu Rhodniini se desplaza hacia el área basal del ala, mientras que la región membranosa se estrecha y alarga.

Análisis cladístico. Se obtuvieron dos árboles de mínima longitud (L = 4.461 IC = 0.973 e IR = 0.979). El consenso estricto de estos (Fig. 3) muestra tres clados relevantes: A, B y C. El clado C incluye las dos especies de Panstrongylus estudiadas (Jackknifing 76 / boostraping 79). Las sinapomorfías para este grupo son: Relative warp2 (carácter 1): 0.003–0.024 →–0.019––0.016 y CS (carácter 8): 8.159–8.812 → 9.680–9.912. El clado A (85/86), agrupa a Triatoma maculata + Rhodniini por la presencia de las sinapomorfías: Relative warp1 (caracter 0): 0.025–0.028 → 0.002–0.008 (Fig. 3A) y CS: 8.159–8.812 → 7.385–7.396. En el clado B se incluyen las especies de Rhodniini (62/60), soportado por una sinapomorfía el Relative warp1 (carácter 0): 0.002–0.008 → –0.041–0.037 (Fig. 3B). Luego se aprecia una tricotomía con Rhodnius prolixus, Rhodnius robustus y el clado B1 (63/67) que agrupa a Psammolestes arthuri + Rhodnius pictipes + Rhodnius neivai soportado por una sinapomorfía en CS: 7.385–7.396→ 5.954–6.010. Finalmente algunas especies mostraron caracteres autapomórficos: P. arthuri con Relative warp1: –0.049—–0.040 → –0.062—–0.051, Relative warp2: 0.016–0.024 → –0.039—–0.032, Relative warp4 (carácter 3): –0.003–0.001 → 0.016–0.012, Relative warp6 (carácter. 5): –0.010–0.003 → 0.005–0.012 y CS: 5.954–6.010 → 5.702–5.850, P. rufotuberculatus con Relative warp7 (carácter 6): –0.001–0.001 → –0.018–—0.013, P. geniculatus con Relative warp1: 0.025–0.028 → 0.031–0.035, R. neivai con Relative warp7: –0.001–0.001 → –0.022—–0.014, R. pictipes con Relative warp1: 0.016–0.024 → 0.033–0.049, y Triatoma maculata con Relative warp1: 0.016–0.024 → 0.045–0.052, Relative warp3 (caracter 2): –0.005–0.001 → –0.015—–0.008, Relative warp5 (caracter. 4): –0.006–0.000 → 0.002–0.008, Relative warp6: –0.005–0.003 → 0.008–0.012 y Relative warp8 (caracter 7): 0.000 →–0.004–—0.001.

Se llega a la misma hipótesis de filogenia de Rhodniini (resultados no incluidos) a partir de análisis filogenéticos obtenidos con diferentes métodos (Maximun Likeli–hood, Felsenstein 2002) o con diferentes variables de la forma (coordenadas xy de los puntos anatómicos) analizadas en TNT según procedimientos filogenéticos propuestos recientemente (Catalano et al. 2010; Goloboff & Catalano 2010).

Visualización de los cambios de la forma alar sobre la filogenia. Mediante la optimización de los caracteres continuos (Relative warps + tamaño centroide) en el árbol de consenso estricto se obtuvieron rangos de las sinapomorfías para cada nodo, lo cual permitió ingresar el valor medio en tpsRelw para reconstruir las conformaciones alares. En el caso del nodo A (Fig. 3A), la configuración de coordenadas muestra un desplazamiento horizontal de la intercepción de las venas R–Scu (PAR4) y el ápice de la vena M (PAR5), mientras que en el nodo B (Fig. 3B) se aprecian deformaciones diagonales en la base de la vena transversal m–cu (PAR2), dobles de la vena M (PAR3) y ápice de la intercepción de las venas cu–Pcu (PAR6).

Tamaño del ala. Los resultados de los análisis de la variación de tamaño de las alas, estimado por el tamaño del centroide (CS), revelaron diferencias significativas entre especies. Falconer (1981) propone que los caracteres métricos son los primeros que cambian en el transcurso de la evolución y esta responde al compromiso de la demanda del entorno y las del genoma. En este sentido, la variación en tamaño del ala detectada puede estar asociada a diferentes ambientes o a diferentes modos de vida y ser el resultado de causas macro y micro evolutivas. Las especies pequeñas explotan ecotopos como palmas y nidos de aves, tal es el caso de P. arthuri asociado a nidos de Phascellodomus rufifrons y otros Fornaridae, mientras que R. neivai se asocia a las palmeras (Copernitia tectorum) y troncos de árboles secos (Carcavallo et al. 1998). En particular resalta el hecho que en este estudio no se evidenciaron diferencias en tamaño entre R. robustus y R. prolixus. Estas especies ocupan ecotopos como palmeras silvestres (Longa y Scorza 2005) y algunos autores han sugerido que R. robustus es la forma selvática y R. prolixus se originó como adaptaciones al domicilio.

La visualización de las diferencias de conformación. La función de placas delgadas (thin plate spline) que se interpola en el AGP permitió observar las diferencias de conformación como deformaciones de rejillas con respecto a una configuración consenso. Las diferencias de conformación observadas entre las especies fueron profundas a excepción de las especies del complejo prolixus, permitiendo a los análisis discriminantes hacer reclasificaciones muy buenas. Este patrón de cambio del ala es congruente con la hipótesis de la divergencia evolutiva que probablemente comenzó al inicio de la separación de las especies de Rhodniini (Schofield & Dujardin 1999).

Filogenia. Rhodniini se ha propuesto como un grupo monofilético (Lent & Wygodzinski 1979) que incluye los géneros Rhodnius y Psammolestes. Esta clasificación se basa en características no compartidas por otros triatóminos, como la inserción apical de la antena, la forma corporal, callosidades postoculares, genitales masculinos, arquitectura superficial de los huevos y la presencia de nitroforina en las glándulas salivales (Lent & Wygodzinsky 1979, Tartarotti et al. 2006). Sin embargo, análisis filogenéticos con base en ARN ribosómico, Citocromo B y la región 28S ARN nuclear (D2) incluyen a Psammolestes con especies de Rhodnius (Lyman et al. 1999; Monteiro et al. 2000). Particularmente, se detectó un clado que contempla a Psammolestes tertius y R. pictipes+R. brethesi+R. ecuatoriensis+R. pallescens. Otro clado propuesto es el formado por especies del grupo prolixus (R. nasutus+R. neglectus+R. domesticus+R. prolixus+R. robustus) y R. neivai (Monteiro et al. 2000). Recientemente, Hypsa et al. (2002) también encontraron que Rhodniini es monofilético y que Rhodnius es parafilético respecto a Psammolestes según su análisis filogenético de 57 especies de tres tribus de Triatominae basado en secuencias de regiones del 16S y 12S del ADN ribosomal.

Los resultados cladísticos y la hipótesis de parafilia en Rhodnius del presente trabajo son congruentes con los cambios taxonómicos señalados por Hypsa et al. (2002: 456), en donde las especies de Psammolestes pasarían a formar parte de Rhodnius en nueva combinación genérica: Rhodnius arthuri (Pinto, 1926) comb. n., R. coreodes (Bergroth, 1911) comb. n., y R. tertius (Lent & Jurberg, 1965). La parafilia de Rhodnius soportada tanto con datos moleculares (Hypsa et al. 2002; Lyman et al. 1999; Monteiro et al. 2000) como con nuestros datos morfométricos analizados filogenéticamente indican que la tribu Rhodniini diversificó rápidamente con grandes cambios morfológicos, entre ellos la pérdida de los caracteres ancestrales compartidos por los miembros de este grupo monofilético.

En conclusión, nuestros resultados revelan la importancia de los caracteres morfométricos como apoyo a los estudios sistemáticos en Triatominae. Esta investigación combina por primera vez el análisis de puntos anatómicos mediante morfometría geométrica y los métodos filogenéticos utilizando caracteres morfométricos continuos. Este estudio hace una comparación entre dos maneras de interpretar cambio de forma. La pregunta de investigación es la misma: ¿cuál es el cambio de forma? La respuesta usual en todo análisis de morfometría es usar el plano de la ordenación del CVA (ordenación multivariada sin jerarquía) para inferir el cambio de forma. La respuesta complementaria que ilustra este trabajo es usar el cladograma (ordenación multivariada con jerarquía) para inferir el cambio histórico de la forma. Este trabajo documenta que la estimación del cambio de forma es más apropiada para la taxonomía de un grupo cuando se le da el enfoque filogenético, para el análisis de las configuraciones de coordenadas después de la superposición Procrustes y el cálculo de las deformaciones relativas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se realizó con el apoyo de las siguientes personas e Instituciones que permitieron revisar los ejemplares: Sra. Hortencia Frontado asistente, Museo Cova–García IAES "Dr. Arnoldo Gabaldon"; Dr. Eduardo Osuna, Curador MIZA–UCV; Dra. Rosa Briseño, Curadora Museo Entomológico "José M. Osorio" UCLA; Dr. Elis Aldana, Curador Colección Herman Lent ULA; Ing. Agr. José Camacho, curador Colección de Artrópodos LUZ; Ing. Agr. Belkis Gómez, curadora Colección Entomológica, UEFM; Sr. Francisco Romero curador, Colección Privada Familia Romero.

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