Expresión inmunohistoquímica de metaloproteasas (MMP–1, 2 y 11) e inhibidor de metaloproteasas de tejido–1 (TIMP–1), y expresión de p53 en linfomas angiocéntricos de células T/NK tipo nasal
Metalloproteinase (MMP–1, 2 and 11), tissue inhibitor of metalloproteinase–1 (TIMP–1), and p53 expression in nasal–type angiocentric T/NK–cell lymphoma. An immunohistochemical study
Abelardo Meneses–García,ª Jorge Herrera,b Alejandro Mohar,ª Claudia García–Cuellar,ª Laura Súchil–Bernalª
ª Instituto Nacional de Cancerología, México, D.F.
b Estudios Superiores y de Postgrado, Facultad de Medicina, Instituto Politécnico Nacional. México, D.F.
]]>Correspondencia y solicitud de sobretiros:
Abelardo Meneses García,
Av. San Fernando 22,
14080 Tlalpan. México, D.F.,
Tel. 56 28 04 20 Fax: 56 28 04 21
E mail: aameneses@hotmail.com
Recibido en su versión modificada: 17 de noviembre de 2004
Aceptado: 10 de diciembre de 2004
Resumen
Se analizan 20 casos de linfomas extraganglionares de células T/NK de tipo nasal, estudiados en el Instituto Nacional de Cancerología, México, D. F., para su expresión inmunohistoquímica de las células neoplásicas, expresión nuclear de la proteína supresora de tumor p53, así como de enzimas que participan en invasión, destrucción tisular y metástasis: metaloproteasas.
Material y métodos: Se estudió el material quirúrgico de estos casos y se efectuó tinción con hematoxilina y eosina analizando sus características histopatológicas: tamaño celular y detalle citológico. Se realizó estudio de inmunohistoquímica para corroborar el tipo celular, así como CD3 (células T), CD56 (células NK), expresión nuclear de la proteína supresora de tumor p53, y la expresión de metaloproteasas tipo 1, 2, 11 (MMP–1, 2, 11) y un inhibidor de metaloproteasas 1 (TIMP–1). Se analizaron variables demográficas, como edad del paciente, sexo, localización del tumor primario, etapa clínica, tratamiento en general y seguimiento.
Estudio estadístico: Se analizó la prueba exacta de Fisher para correlacionar la expresión entre las metaloproteasas y su diferencial entre las células epiteliales, tumorales, estromales, necrosis y células endoteliales.
Resultados: Los 20 casos fueron positivos CD3 citoplásmico, CD56, 19 de ellos positivos a p53, cinco de ellos con positividad nuclear mayor al 50% de las células neoplásicas. Hubo una mayor expresión citoplásmica tumoral de MMP–1; mayor expresión citoplásmica en el epitelio de TIMP1 y MMP–11. Los pacientes con sobreexpresión de p53 tuvieron un curso clínico fatal. Tres de ellos recibieron únicamente radioterapia falleciendo dentro del primer mes del tratamiento.
Discusión: Los linfomas angiocéntricos de células T/NK tipo nasal son neoplasias frecuentes en los países de Asia, Latinoamérica, incluyendo a México. Frecuentemente esta patología se asocia a VEB con expresión fenotípica de células T/NK, cuyas características histológicas son: atipia celular linfoide, angioinvasión y necrosis, reflejado en los pacientes con destrucción progresiva de los tejidos blandos del macizo facial y curso clínico fatal.
Palabras clave: Linfoma angiocéntrico, linfoma de células T/NK, p 53 y linfomas
Summary
]]> Twenty cases of extraganglionar Nasal type T/NK cell lymphomas were analyzed at the National Cancer Institute of Mexico. We studied immunophenotype of neoplastic cells, nuclear p53 expression, and enzymes as matrix metalloproteinases participating in invasion, tissular destruction and metastases.Material and Methods: Paraffin blocks from all cases were retrieved and analyzed by hematoxilin and eosin. Histopathological features included cellular size and cytologic characteristics. We performed immunohisto chemistry to determine CD3, CD56, p53 cellular type and expression of (MMPs–1, 2,11) matrix metalloproteinases and one tissue inhibitor of TIMP 1 metalloproteinase. Demographic variables included, age, sex, primary location, clinical stage, treatment and follow up.
Statistical analysis: The association of different matrix metalloproteinases in epithelial and tumoral cells, stroma, necrosis and endothelial cells were found to be significant using Fisher s exact test.
Results: All studied cases were positive to cytoplasmic CD3, CD56 (NK cells), 19 of them were positive to p53, five of them with nuclear overexpression of p53 in more than 50% of neoplastic cells. There was significant expression of MMP–1 in tumoral cells; the epithelium displayed significant expression of TIMP 1 and MMP–11. Patients with p53 overexpression displayed a poorer prognosis. Three of them had undergone radiotherapy and died within the first month of treatment.
Discussion: This type of lymphoma is a common neoplasm in Asia, Latin America and Mexico. It is worth noting it has has been linked to Epstein Barr virus with T/NK–cell phenotype, which often displays cellular atypia, an angiocentric growth pattern and necrosis. It is clinically expressed by progressive destruction of midline facial soft tissue and has a poor prognosis.
Key words: Angiocentric lymphoma, T/NK–cell lymphoma, p53, lymphomas
El linfoma no–Hodgkin de células linfoides T y células asesinas naturales (T/NK) es una entidad clínico–patológica caracterizada por destrucción progresiva de los tejidos blandos y estructuras óseas, habitualmente de la cavidad nasal y tejidos faciales de la línea media. Esta entidad es histológicamente distintiva por su angioinvasión y la presencia de extensas zonas de necrosis de tipo coagulativo.1,2 Esta neoplasia fue descrita previamente en el grupo del granuloma letal de la línea media y el linfoma angiocéntrico de células T.3–5 Alrededor del 10% de los pacientes con linfomas no–Hodgkin presentan enfermedad primaria extraganglionar en la región de la cabeza y el cuello, principalmente en cavidad nasal, senos paranasales, cavidad oral, laringe y órbita.1,6–9 Esta neoplasia se ha descrito más frecuentemente en países de Asia y Latinoamérica, incluyendo a México.2,10–14 La frecuencia en individuos de origen caucásico es muy rara.1,15 Su asociación con el virus de EB, es significativa en los países de mayor frecuencia.13–15,16–18 Debido a su frecuente localización nasal y a su inmunofenotipo de células T (CD3c) y células asesinas naturales (CD56), es en la actualidad clasificada por la Organización Mundial de la Salud como linfoma extraganglionar de células T/NK, tipo nasal,19,20
La invasión y destrucción de los tejidos por las células neoplásicas malignas, está asociada con la degradación de macromoléculas de matriz extracelular, incluyendo los componentes de la membrana basal, vasos sanguíneos y del estroma.21–23 Las metaloproteinasas (MMPs), son un grupo de estas enzimas descritas en carcinomas de la cavidad oral, cérvix uterino, cáncer de mama, de pulmón, de colon, entre otros. Algunas de ellas asociadas a mayor agresividad.24–26 En el caso de los linfomas no–Hodgkin, algunos autores mencionan a través de estudios de zimografía, una mayor expresión de MMP–2, MMP–9, TIMP–1 en linfomas de mayor agresividad.27–29 Sin embargo, hay metaloproteinasas como la tipo 11, las cuales no se expresan en células linfoides neoplásicas, y sí en neoplasias de estirpe epitelial.30 Por el momento no se ha informado la expresión de metaloproteasas en linfomas de células T/NK de tipo nasal. Otro marcador que ha sido utilizado como predictor de agresividad es la expresión de la p53, la cual se expresa en un porcentaje alto de tumores malignos; sin embargo, en linfomas no–Hodgkin, la expresión de mutaciones del gene p53 es relativamente rara.31 En algunos estudios, incluyendo Latinoamérica y México, se han informado la sobreexpresión de p53 en linfomas de células T/NK tipo nasal asociados a una mayor agresividad.32–34 En este estudio, además de evaluar la expresión por inmunohistoquímica de p53 en 20 casos de linfoma de células T/NK tipo nasal, se efectuó el análisis descriptivo del porcentaje y patrones de expresión de las metaloproteinasas 1, 2, 11 (MMP–1,2 y 11) y del inhibidor de metaloproteinasa de tejido–1 (TIMP–1).
]]> Material y métodos
Veinte casos de linfomas angiocéntricos de células T/NK de la región nasal y estructuras de la línea facial media fueron obtenidos del archivo general de Patología, del Instituto Nacional de Cancerología, México. El periodo en que fueron analizados estos casos abarcó de 1992 al año 2000 (parte de estos casos habían sido utilizados en otro estudio).18 Las biopsias fueron fijadas en formol al 10% e incluidas en parafina. Todos los casos fueron revisados y sus características morfológicas corroboradas por un patólogo externo (LQ [34]). La información clínica fue obtenida de los expedientes médicos de los pacientes.
Inmunohistoquímica
El estudio por inmunohistoquímica fue realizado utilizando la técnica de estreptovidina–biotina. Brevemente: se realizaron cortes de 3 micras de todos los tejidos, los cuales fueron colocados en portaobjetos de vidrio pretratados con organosilano. Después se desparafinaron, bloqueando con peróxido endógeno por incubación con 1.5% de peróxido de hidrógeno en metanol por 30 minutos. Las laminillas de vidrio fueron pretratadas con buffer citrato (10mM) por 15 minutos a 100°C. Un paso de preincubación con 10% de suero de caballo normal, seguido de un procedimiento de inmunoperoxidasa de tres pasos. El primer paso incluyó los anticuerpos CD3, CD56 y p53 de DAKO, Carpinteria, CA. El segundo paso una inmunoglobulina de caballo anti–ratón y un tercer paso, estreptovidina (Boehringer, Mannheim, Germany). La actividad peroxidasa fue desarrollada con tetracloruro de 3,3–diaminobencidina y con peróxido de hidrógeno como el sustrato. Los tejidos para estudio de p53 fueron considerados como positivos si hubo intensidad moderada en más de 10% de los núcleos de células tumorales. Se utilizó un microscopio de doble cabeza, marca Leica. Se gradificaron los casos utilizando un porcentaje de 0 a 100% de células positivas. Los anticuerpos dirigidos a las metaloproteasas (MMPs–1,2,11 y TIMP–1) fueron obtenidos por donación del Dr. Thomas Bugge, Ph.D (Chief, Proteases and Tissue Remodeling Unit Oral and Pharyngeal Cancer Branch. National Institute of Dental and Craniofacial Research. National Institutes of Health, Bethesda USA). El método de inmunohistoquímica fue el mismo al descrito previamente y ajustado a las especificaciones de los catálogos de Oncogene Research Products (MMP–1,2 y TIMP–1) en Boston, MA y NeoMarkers, Inc. Fremont, CA in Cancer Research (MMP–11 [Stromelysin–3]). Estos anticuerpos se utilizaron a una dilución de 1:50 con reacción a los 5 minutos. Para la valoración de las metaloproteasas se comparó la positividad expresada en intensidad leve a intensa (+, ++, +++) y el porcentaje de células: epitelio de superficie y de los conductos (como control interno), células tumorales, estroma, células endoteliales y áreas de necrosis.
Análisis estadístico
Se comparó la expresión de metaloproteasas en epitelio, células tumorales, estroma, necrosis y células endoteliales, así como entre las diferentes MMPs y TIMP–1, a través de la prueba exacta de Fisher. Para la expresión de p53 se valoró en porcentaje de positividad nuclear: > 50%; 20–50% y < 20%.
Resultados
]]> Las características de los datos clínicos de los pacientes y hallazgos histológicos se presentan en el cuadro I. De los 20 pacientes, 13 fueron hombres y 7 mujeres (relación 1.8:1), con mediana de edad de 43 años (intervalo de 22 a 93 años). El síntoma más frecuente fue la obstrucción nasal. En 13 casos la muestra del tumor fue de la cavidad nasal, en cuatro casos del paladar y en tres de la nasofaringe (Figura 1). Nueve pacientes se presentaron en etapa clínica temprana (etapa clínica I y II) y 11 pacientes en etapa clínica avanzada (III y IV). La mayoría de los pacientes recibieron tratamiento combinado a base de quimioterapia y radioterapia (12 pacientes), cuatro pacientes recibieron quimioterapia como tratamiento único, tres pacientes sólo radioterapia y un paciente no alcanzó a recibir tratamiento (caso 19). Catorce pacientes fallecieron a causa de la enfermedad, tres de ellos durante el tratamiento (caso 5, 12 y 15 ). Once de ellos fallecieron independientemente del tratamiento recibido. Seis pacientes están vivos. Cinco de ellos sin evidencia de enfermedad y uno con enfermedad recurrente después de 10 años (caso 18).
Histopatología
En todos los casos se demostró infiltrado de células linfoides atípicas de forma difusa, con angioinvasión y acompañados por zonas de necrosis confluente de tipo coagulativo (Figuras 2 y 3). El espectro histológico varió desde células grandes a células de tamaño intermedio, predominando el patrón mixto (17 casos). Las células linfoides atípicas frecuentemente mostraron irregularidad nuclear, patrón de cromatina en grumos gruesos, con ocasionales nucléolos principalmente en las células grandes y mitosis atípicas. Acompañando a estas células linfoides atípicas, se observaron cantidades variables de células plasmáticas, histiocitos, neutrófilos y eosinófilos (estos últimos en relación con zonas de ulceración).
Inmunohistoquímica
Los resultados de inmunohistoquímica para células linfoides T (CD3), células NK (CD56) y p53 se muestran en el cuadro II. Todos los casos de esta serie fueron positivos a células T/ NK, así como a p53, excepto un caso (caso 11). Cinco casos mostraron positividad nuclear mayor al 50% de las células tumorales (casos 3,5,10,13 y 17) (Figura 4). La expresión de metaloproteasas 1,2,11 y TIMP–1 se muestran en el cuadro III. La MMP–1 fue positiva en las células tumorales de los 20 casos y con intensidad de moderada a severa (p=0.008). En contraste la TIMP–1 fue negativa en las células tumorales en 19 casos. De acuerdo con la prueba de Fisher, hubo mayor significancia estadística al correlacionar positividad entre epitelio y células endoteliales, en la expresión de MMP–1, 2 y 11, así como TIMP–1.
]]> Discusión
Los linfomas de células T/NK tipo nasal, de acuerdo a la clasificación actual de la OMS,19 corresponden a 7% de los linfomas no–Hodgkin registrados en el Instituto Nacional de Cancerología, México. Este tipo de linfomas de células linfoides T/NK predominan en individuos orientales, latinoamericanos y mexicanos, como fue corroborado en esta serie,2,10–14,16,18y compartiendo una estrecha asociación con el virus de Epstein–Barr, como ha sido publicado por diferentes investigadores y en diversas zonas geográficas del mundo.7,13–18,32,34 Algunos autores sugieren que una exposición crónica en sitios anatómicos como la cavidad nasal y el paladar, expuestos desde muy temprana edad al virus de EB, pueden dar lugar a través del tiempo a mutaciones y transformación oncogénica de las células que participan en la defensa tisular, como son las células linfoides T y células asesinas naturales.35
En esta serie la localización del linfoma fue mayor en la cavidad nasal (13 casos), aunque se ha descrito en sitios lejanos al macizo facial, como son los testículos, piel, tracto gastrointestinal.1,2,34,36 En este estudio la mayor prevalencia fue en hombres con una amplia gama de edades, desde la pediátrica hasta en individuos de edad avanzada.
Debido a que las células neoplásicas parecen tener predilección por invadir y destruir la pared de los vasos sanguíneos, frecuentemente se encuentran extensas zonas de necrosis, por ello, se ha enfatizado en la necesidad de efectuar por lo menos seis biopsias en diferentes zonas de la lesión, y así evitar el retraso en el diagnóstico de la enfermedad.2 Estas zonas de necrosis igualmente pueden ser secundarias a la liberación de gránulos citotóxicos por las células T y NK como lo demostró Elenitoba y cols, en el que prácticamente todos su casos mostraron positividad a perforinas, granzimas y TIA–1.18
Sin embargo, considerando que hay otros mecanismos de daño tisular, los que favorecen la invasión tumoral y metástasis, se analizó la expresión de enzimas proteolíticas relacionadas a estas funciones. Entre ellas, el grupo de metaloproteasas 1,2 y 11, así como el inhibidor de metaloproteasas de tejido–1. Otra de las MMP involucradas en estos procesos es la MMP–9, la cual para ser estudiada se requiere de material en fresco, no así las mencionadas previamente, las que pueden ser analizadas en material incluido en parafina. De esta manera, es posible analizar las células que expresan estas MMPs, así como su interrelación entre las células epiteliales, tumorales, estromales, endoteliales y en las zonas de necrosis. En algunos estudios se ha mencionado que la expresión de la mayoría de las metaloproteasas reside en las células del estroma, las cuales estimulan a las células tumorales para su síntesis y posterior liberación, en los momentos de invasión y metástasis.37 En este estudio pudimos observar que la expresión de estas metaloproteasas fue más evidente en el citoplasma de las células tumorales y en particular la MMP–1, la cual fue más intensa a medida que se encontraba más cercano a los vasos sanguíneos, sugiriendo la posibilidad de su participación en el daño a la pared del vaso sanguíneo.
Algunos estudios indican que la interacción de las células linfoides con componentes de la membrana basal (laminina, colágena tipo IV) o por interacción con la célula endotelial, podrían inducir a las células linfoides a producir metaloproteasas.38 Así, estas proteasas podrían contribuir significativamente en los eventos asociados a la transformación de las células T y NK a través de la membrana basal subendotelial. Algunos estudios no han demostrado la expresión de TIMPs en los procesos linfoproliferativos, salvo en los linfomas de alto grado de estirpe B. En este estudio, las células tumorales fueron negativas al TIMP–1 y positividad leve en el epitelio de superficie y de los conductos (12 casos), lo cual podría deberse a un probable mecanismo de defensa contra las células invasoras, y ello explicar el frecuente hallazgo de encontrarse áreas de epitelio y conductos inmersos en el tumor sin daño tisular, a diferencia de lo que lo hacen las células endoteliales. La falta de expresión de MMP–2 y la baja expresividad de MMP–11 limitada al epitelio, puede explicarse, ya que la primera interviene principalmente para fraccionar la colágena tipo IV, y favorecer la migración de células endoteliales y así aumentar la angiogénesis; fenómeno que no suele observarse en este tipo de linfomas, cuya característica es no encontrar colágena ni aumento de la vascularidad. Con relación a la MMP–11, ésta participa más en las neoplasias de estirpe epitelial en su proceso de invasión y metástasis, no así en los procesos inmunoproliferativos, lo cual puede explicar el hallazgo mostrado en este trabajo.
El gene p53 es el más frecuentemente mutado en cáncer humano, y es el prototipo regulador del crecimiento y división celular.39 Sin embargo, las mutaciones del gene p53 son relativamente raras en los linfomas no–Hodgkin.31 Extrapolando el hallazgo de Quintanilla y cols, en su análisis de la presencia de mutaciones del gene p53 en cinco pacientes de 25 y que en cuatro de éstos pacientes tuvieron un curso evolutivo fatal, realizamos inmunohistoquímica para p53 y se observó que cinco pacientes (caso 3,5,10,13 y 17) tuvieron sobreexpresión de esta proteína nuclear y de la misma manera los pacientes tuvieron un curso clínico agresivo, falleciendo los pacientes en menos de cuatro meses, independientemente de la modalidad de tratamiento instituido. Cabe destacar que tres de estos pacientes recibieron únicamente radioterapia, y la muerte en ellos ocurrió dentro del primer mes de recibir tratamiento, a pesar que dos de ellos tenían etapa clínica temprana. Sun, Wicha y Leopold40 mencionan que pacientes que reciben radioterapia pueden manifestar mayor expresión y daño de p53 con el consiguiente aumento en la agresividad tumoral, por lo que debe tomarse en cuenta en estudios futuros.
En conclusión, los linfomas de células T/NK son frecuentes en nuestro medio, están estrechamente vinculados a VEB y tienen una evolución progresiva y habitualmente fatal. Las extensas zonas de necrosis y destrucción tisular en estos pacientes pueden ser secundarias a la liberación de perforinas, granzimas o gránulos citotóxicos (TIA–1), así como a enzimas como las metaloproteasas. La sobreexpresión de p53, confiere una mayor agresividad probablemente aumentando la resistencia a la radioterapia sobre todo en pacientes con positividad nuclear (50%) a esta proteína.
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