Caracterización de las ectomicorrizas formadas por Laccaria trichodermophora y Suillus tomentosus en Pinus montezumae

Characterization of ectomicorrizas formed by Laccaria trichodermophora and Suillus tomentosus in Pinus montezumae

Gema Galindo-Flores¹, Citlalli Castillo-Guevara^1,3, Alberto Campos-López² y Carlos Lara¹

¹ Centro de Investigación en Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Tlaxcala, San Felipe Ixtacuixtla, Tlaxcala, México.

³ Autor para correspondencia: guevaracc@yahoo.com.mx.

Recibido: 17 de julio de 2014.
Aceptado: 10 de octubre de 2014.

Resumen

Las especies del género Pinus tienen una gran dependencia ecológica hacia la asociación ectomicorrízica. Sin embargo, a pesar de la importancia de la ectomicorriza en los ecosistemas forestales las descripciones morfológicas disponibles de estas asociaciones son escasas. En el presente trabajo se realizó la primera caracterización morfológica macroscópica y microscópica de las ectomicorrizas formadas por Laccaria trichodermophora y Suillus tomentosus en Pinus montezumae. La síntesis de las micorrizas estudiadas se efectuó mediante la inoculación con esporas en un sustrato estéril, bajo condiciones de invernadero. Laccaria trichodermophora presentó ramificación de tipo coraloide con un grosor del manto de 46.05 μm; una longitud del sistema radical de 0.4 a 2.9 mm; sin rizomorfos. Suillus tomentosus presentó ramificación de tipo coraloide con un grosor del manto de 48.03 μm; una longitud del sistema radical entre 0.4 a 1.6 mm; sin rizomorfos. La mayoría de las características descritas concuerdan con las publicadas para los géneros Suillus y Lacccaria. El conocimiento de la morfología permitirá hacer una mejor detección rápida en estudios in vitro y ex situ de la micorriza formada por hongos útiles para la producción de inoculantes con fines de manejo y conservación de sistemas forestales.

Palabras clave: descripción morfológica, ecosistemas forestales, hongos ectomicorrizógenos, micorriza.

Species of the genus Pinus have a great ecological dependence on the ectomycorrhizal association. However, despite the importance of ectomycorrhiza in forest ecosystems morphological descriptions available of these associations are rare. In this paper the first macroscopic and microscopic morphological characterization of ectomycorrhiza formed by Laccaria trichodermophora and Suillus tomentosus in Pinus montezumae was performed. The synthesis of the studied mycorrhiza was performed by inoculation with spores in a sterile substrate under greenhouse conditions. Laccaria trichodermophora presented coraloide branch type, mantle with a thickness of 46.05 μm; length of the root system from 0.4 to 2.9 mm; without rhizomorphs. Suillus tomentosus presented coraloide branch type, mantle with a thickness of 48.03 μm; length of the root system from 0.4 to 1.6 mm; without rhizomorphs. Most of the characteristics described are consistent with those published for genus Suillus and Laccaria. Morphological knowledge will allow to perform a fast detection in in vitro and ex situ studies of the useful mycorrhiza formed to produce inoculants management and conservation of forest systems.

Keywords: ectomycorrhizal fungi, forest ecosystems, morphological description, mycorrhiza.

La ectomicorriza es una forma de relación simbiótica entre las raíces de árboles o arbustos autotróficos y un hongo cuyas hifas forman un manto alrededor de éstas (Buscot et al., 2000; Brundrett, 2004). En esta asociación el hongo también desarrolla una estructura laberíntica a través del apoplasto del córtex de la raíz, llamada red de Hartig, donde se lleva a cabo la transferencia de nutrientes entre las células fúngicas y vegetales (Brundrett, 2004). Este tipo de micorriza se puede establecer entre hongos de las clases Basidiomycetes y Ascomycetes y diversos grupos angiospermas o gimnospermas (Buscot et al., 2000). Las ectomicorrizas son comunes en suelos moderadamente ácidos y ricos en materia orgánica, tanto en regiones boreales y templadas como tropicales (Sylvia, 1999; Nava-Gutiérrez y Hernández-Cuevas, 2003; Pérez-Moreno y Read, 2004).

Laccaria trichodermophora G.M. Muell. y Suillus tomentosus (Kauffman) Singer son especies de hongos ectomicorrizógenos (HECM) que se asocian a los árboles juveniles, particularmente en bosques templados (Dahlberg y Finlay, 1999; Kropp y Mueller, 1999). Estos hongos favorecen el establecimiento, supervivencia y desarrollo de la planta en esta etapa temprana al facilitar la absorción y el transporte de nutrientes tales como P, K, NH₄, NO₃, y agua (Brundrett, 2004; Finlay, 2004; Jones y Smith, 2004).

Estas especies de hongos ectomicorrizógenos han sido previamente utilizadas como inoculantes con distintas especies de árboles del género Pinus, y los resultados indican efectos positivos tanto en la capacidad de colonización del hongo como en el crecimiento de la planta (Xicohténcatl-Ahuatzin, 1998; Santiago-Martínez, 2002; Hernández, 2003; Muñoz, 2003). Entre estas especies destaca Pinus montezumae Lamb., una conífera micorrízica obligada (Brundrett et al., 1996; Dahlberg y Finlay, 1999), por su amplia distribución en México y extendido uso en la reforestación de los bosques templados del país.

Pese a la importancia no sólo ecológica sino económica que denota el conocimiento de la interacción entre hongos ectomicorrízicos y especies de plantas maderables del género Pinus, es evidente la poca información generada sobre la caracterización morfológica de sus ectomicorrizas. Por ejemplo, a la fecha se han descrito 107 morfotipos de ectomicorrizas asociadas al género Pinus, de los cuales únicamente siete corresponden al género Suillus y dos al género Laccaria (Tabla 1). Sin embargo, a pesar de que existen descripciones para otras especies de Laccaria y Suillus asociadas con Pinus, no hay descripciones de ectomicorrizas de L. trichodermophora ni de S. tomentosus asociadas con P. montezumae.

La caracterización morfológica es el método que ha sentado las bases para la descripción de las ectomicorrizas y continúa siendo ampliamente utilizado en estudios de campo y laboratorio (Agerer y Rambold, 2004—2015; Brundrett et al., 1996). Este método presenta la ventaja de poder identificar macroscópicamente los tipos ectomicorrízicos a nivel de género, y a través de observación microscópica determinar aspectos de la ectomicorriza como forma, color y estructura del manto (Agerer, 1995; Agerer y Rambold, 2004—2015. A pesar de la indudable efectividad de las actuales técnicas moleculares, la caracterización morfológica sigue siendo un complemento importante en el estudio de la asociación micorrízica (Horton y Bruns, 2001).

En el presente estudio se realiza la primera caracterización morfológica macroscópica y microscópica realizada a las ectomicorrizas formadas por Laccaria trichodermophora y Suillus tomentosus en Pinus montezumae. La caracterización morfológica de estas ectomicorrizas nos permitirá confirmar la identidad del HECM inoculado al menos a nivel de género y facilitar su seguimiento durante la formación de la asociación.

Materiales y Métodos

Obtención e inoculación de plántulas. Las semillas de Pinus montezumae provenían de San Andrés Hueyacatitla, Puebla y fueron donadas por el banco de germoplasma del vivero de San Luis Tlaxialtemalco en Xochimilco, D. F. Todas las semillas fueron desinfectadas y escarificadas de la siguiente manera: (1) se agitaron por un lapso de 1 h en una mezcla de peróxido de hidrógeno al 30 %, se lavaron con agua destilada y por último se colocaron en una solución fungicida (Benomil 1g/l); (2) se mantuvieron en refrigeración por 24 h con la finalidad de romper el estado de latencia de las semillas; y (3) se lavaron con agua destilada, se colocaron en una solución bactericida (cloranfenicol 30 mg/l) por 30 min; y se lavaron una última vez con agua destilada para eliminar el rastro de cualquier sustancia (Galindo-Flores et al., 2001).

Las semillas preparadas fueron sembradas por métodos convencionales usados en los viveros (Peñuelas y Ocaña, 2000), utilizando bandejas de germinación de poliestireno (Modelo CH-101 con 200 cavidades de 28 ml de volumen, Polietilenos del Sur®) y una mezcla de vermiculita/turba en una proporción 2:1 como sustrato. Las semillas germinaron a los 30 días después la siembra y a los 50 días fueron trasplantadas a contenedores forestales de plástico con capacidad de 250 ml (Modelo G2, Polietilenos del Sur®). Trece días después, cuando las plántulas desarrollaron raíces secundarias, se inocularon 120 plántulas con 5 ml de una solución con 10⁶ esporas procedentes de los hongos frescos de Laccaria trichodermophora y 120 plántulas con Suillus tomentosus. Ambas especies de hongos fueron recolectados en Cañada Grande del Parque Nacional La Malinche, Tlaxcala. Para garantizar una inoculación exitosa se llevó a cabo una reinoculación 1 mes después usando el mismo volumen de la solución.

Caracterización morfológica. El sistema radical de 13 plántulas, por cada especie de hongo inoculado, fue caracterizado morfológicamente a los 4, 6, 8 y 12 meses posteriores a la inoculación. Las raíces micorrizadas fueron fijadas en formaldehído, alcohol y ácido acético (FAA), en proporción 3:1:1 (Agerer, 1986). Las puntas micorrizadas se sometieron a un proceso de deshidratación en una serie etanólica gradual durante 1 h en cada solución (30-100 %). Posteriormente fueron incluidas en Paraplast® de forma gradual mediante mezclas de alcohol absoluto-xilol y paraplast (Modificado de López-Curto et al., 2005). Finalmente se realizaron cortes de 5 a 10 μm de grosor con un micrótomo de rotación (Leica modelo 820-II). Para la eliminación de la parafina en el tejido, los cortes se sumergieron en xilol puro, después en soluciones graduales de alcohol-xilol (100-30 %), y por último en agua destilada. Para su estudio bajo el microscopio, los cortes se tiñeron con azul de toluidina que hace posible la observación de estructuras características de las ectomicorrizas. Se tomaron fotografías del manto y de la red de Hartig utilizando una cámara (Infinity 1) acoplada al microscopio de campo claro (Zeiss Axioscop 2).

Para la descripción morfológica de las ectomicorrizas se realizó la caracterización y medición de las estructuras propuestas por Agerer (1986; 1987-1993) y Agerer y Rambold (2004-2015). Macroscópicamente se consideró el tipo de ramificación, longitud total del sistema ramificado y de las ramificaciones de segundo y tercer orden, diámetro de los ejes y de las puntas no ramificadas, y presencia de rizomorfos. Las mediciones microscópicas incluyeron el grosor del manto, de la red de Hartig y el diámetro de las hifas. El programa de digitalización de imágenes Image-pro Express versión 6.3 (Media Cybernetics Inc., 1993-2002) fue utilizado para llevar acabo la observación y medición de todas la estructuras de interés. Los rasgos morfológicos de las ectomicorrizas descritas en este trabajo fueron comparados con los existentes en la literatura para otras especies de los géneros Laccaria y Suillus en Pinus (ver Tabla 2).

Resultados

Laccaria trichodermophora G.M. Muell.

Sistema micorrízico.- Los valores citados corresponden al promedio de 46 mediciones. La ectomicorriza presentó una longitud de 0.4 mm en etapas jóvenes de desarrollo de la micorriza (Figura 1A) llegando a los 2.9 mm en etapas maduras de la micorriza y 0.3 mm de diámetro en promedio (Tabla 2); con ramificaciones de tipo dicotómico de segundo orden (0.7 X 0.2 mm) y de tercer de orden (0.2 x 0.1 mm) en etapas jóvenes de la micorriza y coraloide en etapas maduras de la micorriza; sin presencia de rizomorfos (Figura 1B).

Esclerocios.- No presentó esclerocios.

Anatomía.- Micorriza.- Presencia de micelio hialino, ligeramente denso, alrededor del manto (Tabla 2, Figura 1C-E) (D).

Manto.- Los valores citados corresponden al promedio de 130 mediciones. El manto presentó organización plectenquimatosa de tipo B (Figura 1G) según la clasificación de Agerer (1991), es caracterizado por la disposición irregular de las hifas sobre la superficie de la raíz, con grosor de (14.48) -46.5-(81.52) μm (Figura 1F), conformado por hifas de 7.1 μm en promedio de diámetro. La ectomicorriza presentó desarrollo de una red de Hartig con 142.3 μm de grosor total en promedio que abarcó 2 capas de células corticales (Tabla 2, Figura 1E, H).

Suillus tomentosus (Kauffman) Singer

Sistema micorrízico.- Los valores citados corresponden al promedio de 108 mediciones. La ectomicorriza presentó una longitud de 0.4 mm en etapas jóvenes de desarrollo (Figura 2A) llegando a 1.6 mm en etapas maduras de la micorriza y de 0.1 mm de diámetro en promedio (Tabla 2); con ramificaciones de tipo dicotómico de segundo orden (0.6 x 0.1 mm) y de tercer orden (0.3 x 0.1 mm) en etapas jóvenes de la micorriza y coraloide en etapas maduras de la micorriza; sin presencia de rizomorfos (Figura 2B, C).

Terminaciones no ramificadas.- El manto presentó buena visibilidad, con ausencia de transparencia, carbonización y tubos lactíferos; con superficie generalmente lisa; coloración café rojizo (2.5YR4/4) ligeramente brillante en etapas jóvenes de desarrollo de la micorriza, a rojo muy oscuro (2.5YR2.5/2) ligeramente brillante en etapas maduras de la micorriza; con terminaciones no ramificadas principalmente rectas a ligeramente torcidas (Tabla 2, Figura 2A-D)(B, C).

Esclerocios.- No presentó esclerocios.

Anatomía.- Micorriza.- Presencia de hifas emanantes ocasionales y cristales (Tabla 2, Figura 2D-E).

Manto.- Los valores citados corresponden al promedio de 50 mediciones. El manto presentó organización plectenquimatosa de tipo F (Figura 2H) según la clasificación de Agerer (1991), caracterizado por la presencia de células redondas sobre manto de hifas entrelazadas, con grosor de (21.49) -48.03-(88.87) μm, conformado por hifas de 10.4 μm de diámetro en promedio. La ectomicorriza presentó el desarrollo de una red de Hartig con 140.6 μm de grosor total en promedio (Tabla 2, Figura 2E, I). Las células corticales que se encontraban en contacto con el manto interno presentaron coloración café oscuro debido a la producción de taninos y abarcaron una y media capa de células corticales (Figura 2I).

Discusión

Los resultados obtenidos permiten documentar por primera vez la caracterización de las ectomicorrizas formadas por los hongos Laccaria trichodermophora y Suillus tomentosus en el sistema radical de Pinus montezumae. Laccaria trichodermophora presentó una ramificación de tipo coraloide a diferencia de L. bicolor y L. próxima que presentan una ramificación tipo dicotómica (Tabla 2; Danielson et al., 1984; Ingleby et al., 1990; Santiago-Martínez et al., 2003; Carrasco-Hernández et al., 2010). Otro rasgo significativo de la ectomicorriza formada por L. trichodermophora es que el rango en el grosor del manto —14.4 a 81.5 μm— es más amplio que el producido por L. bicolor (23.5 a 31.4 μm) y L. proxima (15 a 40 μm) (Tabla 2; Danielson et al., 1984; Ingleby et al., 1990; Santiago-Martínez et al., 2003; Carrasco-Hernández et al., 2010).

En Suillus tomentosus puede resaltarse que tiene una longitud del sistema radical de 0.4 a 1.6 mm que en comparación con S. bovinus (12 a 15 mm), S. collinitus (3 a 5 mm), S. plorans (10 a 20 mm), S. sibiricus (7.3 mm) y S. variegatus (2 a 10 mm) es la más pequeña. Otro rasgo importante para esta ectomicorriza es la ausencia de rizomorfos que es una constante en las cinco especies antes mencionadas (Tabla 2; Uhl, 1988; Agerer, 1990; Treu, 1990c; Mleczko y Ronikier, 2007). El grosor del manto para S. tomentosus fue de 21.4 a 88.8 μm siendo el rango más reducido en comparación con S. plorans que presenta un rango de 60 -160 μm y S. sibiricus de 86 -138 μm. Sin embargo, la mayoría de las características descritas para S. tomentosus concuerdan con las otras descripciones para el género Suillus (Tabla 2).

Las discrepancias encontradas entre algunas características como tipo de ramificación, longitud del sistema radical, presencia de rizomorfos y grosor del manto de las dos especies de hongos ectomicorrizógenos pueden atribuirse a que éstas son reguladas por propiedades del huésped, del hongo, o por interacciones que involucran a ambos y al ambiente (Brundrett, 2004). Sin embargo, los mecanismos por los cuales operan estos procesos aún no han sido esclarecidos, por lo que se requieren estudios detallados al respecto.

Desde el punto de vista fisiológico, en la red de Hartig, específicamente en la zona de interface, hay modificaciones en la organización y estructura de las células corticales, que facilitan el intercambio bidireccional de nutrimentos lo cual está estrechamente relacionado con la habilidad de explotar, traslocar y optimizar el recurso disponible entre ambos interactuantes (Brundrett, 2004; Peterson y Massicotte, 2004). La realización de estudios morfológicos más detallados de la estructura de las micorrizas formadas por diferentes especies de hongos y plantas permitirá entender algunos aspectos fisiológicos fundamentales como el intercambio de nutrimentos.

En el contexto ecológico el conocimiento de los distintos morfotipos de ectomicorrizas, contribuye a la comprensión de los procesos de sucesión o recambio de especies de hongos micorrizógenos en el sistema radical del hospedero a lo largo de su ciclo de vida. Estos procesos repercuten en el establecimiento y supervivencia de la planta hospedera bajo distintas condiciones ambientales (Finlay, 2004; Kernaghan, 2005).

Actualmente numerosas especies de hongos ectomicorrízicos son cultivados en laboratorio y utilizados en micorrizaciones controladas de plantas en vivero. Para ello, es necesario determinar las condiciones y técnicas culturales que permitan la optimización de esta simbiosis hongo-planta. De esta manera, la adecuada selección e identificación de las especies de hongos micorrízicos como simbiontes y su posterior manipulación, tanto en laboratorio como en vivero, pueden ser aspectos claves para lograr con éxito el establecimiento de especies vegetales en campo (Honrubia et al., 1992; Pereira et al., 2007). Dado que existen diferencias morfológicas entre las raíces ectomicorrizadas con diferentes especies de hongos, la caracterización morfológica de las ectomicorrizas es fundamental para un manejo adecuado en vivero de inoculaciones controladas. El presente trabajo contribuye en este sentido, posibilitando la implementación de técnicas silviculturales de inoculación micorrízica controlada con L. trichodermophora y S. tomentosus para su uso en P. montezumae y reforzar de forma adecuada los programas de reforestación en nuestro país.

Agradecimientos

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