RAPD markers associated with sex expression in Ceratozamia mexicana Brongniart (Zamiaceae)

L. Iglesias–Andreu¹; M. Luna–Rodríguez²; M. Durán–Vázquez¹; A. Rivera–Fernández¹; N. Sánchez–Coello¹

¹ Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada. Universidad Veracruzana (INBIOTECA). Campus para la Cultura, las Artes y el Deporte. Av. de las Culturas Veracruzanas Núm. 101. Colonia Emiliano Zapata, Xalapa, Ver., C. P. 91090.

² Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, Veracruz. (LATEX, S. C.), Universidad Veracruzana, Médicos Núm. 5, Unidad del Bosque, Xalapa, Ver. C. P. 91010. MÉXICO. (Autor de correspondencia).

Recibido: 6 de abril, 2010 ]]> Aceptado: 6 de mayo, 2010

RESUMEN

Ceratozamia mexicana Brongniart es una especie estrictamente dioica con un largo estadio juvenil. Con el fin de detectar marcadores moleculares asociados al azar (RAPD) y al análisis masal segregante (BSA), se trabajó con muestras de tejido foliar de individuos maduros de la población de esta especie en Coacoatzintla, Veracruz, México. Se usaron cinco iniciadores para amplificar tres mezclas de ADN de individuos de sexo conocido. Se produjeron un total de 37 bandas de las cuales el 63 % fueron polimórficas. Los iniciadores OPB08 y OPK10 generaron bandas distintivas al sexo. Con el iniciador OPK10 se observó una banda de 500 pb en dos de las tres mezclas de machos analizados, mientras que con el iniciador OPB08 se detectaron 2 bandas (1,400 y 1,100 pb) presentes en dos de las tres mezclas de machos examinados. Aunque es necesario validar los resultados obtenidos, pueden abrir una nueva alternativa para determinar tempranamente el sexo en C. mexicana.

Palabras clave: Ceratozamia mexicana, identificación del sexo, marcadores moleculares, RAPD, análisis masal segregante (BSA).

ABSTRACT

Ceratozamia mexicana Brongniart is a strictly dioecious species with a long juvenile stage. In order to detect molecular markers associated with sex, it was analyzed by the technique of random amplified polymorphic DNA (RAPD) and masal segregant analysis (BSA) samples of leaf tissue of leaf tissue of sexually differentiated individuals of the population of this species located at Coacoatzintla, Veracruz, México. 5 primers were used to amplify three bulk DNA samples of five known individuals from each sex. A total of 37 bands were produced of which 63% were polymorphic. The OPB08 and OPK10 primers generated distinctive bands to male sex in C. mexicana. With the OPK10 primer a band of 500 bp was observed in two of the three male bulk samples tested, while the OPB08 primer detected two bands (1400 and 1100 bp) in the male samples tested. Although it is necessary to validate this observation, these results could open a new alternative to early determination of sex in C. mexicana.

Keywords: Ceratozamia mexicana, sex identification, RAPD, molecular markers, bulked segregate analysis (BSA).

En plantas la determinación genética de la expresión sexual no está completamente dilucidada, pues ésta puede asociarse en especies dioicas a dos fenómenos (Ainsworth, 2000). Así, en algunas de ellas el sexo está basado en un sistema XY, en el que el macho es el sexo heterogamético XY, como es el caso de Cannabis, Humulus, Silene y diversas especies de cícadas (Ainsworth, 2000, Charlesworth, 2002, Sangduen et al., 2009), mientras que en otras el sexo está determinado por factores citoplasmáticos (Charlesworth, 2002).

Pese a la importancia de las cícadas (Jones, 1993), poco se conoce sobre la determinación de su sexo. Casi todas las especies mexicanas de cícadas son dioicas, con los sexos masculino y femenino en diferentes plantas. Dentro de ellas está C. mexicana Brongn, endémica de Veracruz, que, al igual que la mayoría de las especies de cícadas, se encuentra bajo amenaza, de acuerdo con la NOM–ECOL–059–94 (SEMARNAT). No es posible determinar el sexo de esta cícada hasta que los individuos alcanzan su madurez reproductiva, que en esta especie puede tardar de 15 a 20 años, ya que los individuos juveniles de ambos sexos no presentan un dimorfismo sexual en sus características morfológicas. Es por ello que resulta de gran utilidad disponer de un método no destructivo, rápido y confiable que permita conocer el sexo en estadios tempranos de desarrollo, a fin de contribuir a su conservación –a través de una adecuada proporción de individuos machos y hembras en la población,–y a conocer el mecanismo de determinación del sexo en esta especie.

En los últimos años ha recibido una atención especial el desarrollo de marcadores moleculares, particularmente aquellos basados en la técnica de PCR, para identificar tempranamente el sexo (Samantaray et al., 2010, Prakash y Van Staden, 2006). La amplificación al azar de ADN Polimórfico (RAPD) basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha sido empleada como marcador de ADN vinculado al fenotipo sexual en diversas especies vegetales como: Phoenix dactylifera L. (Younis et al., 2008), Populus tomentosa Carr. (Wanwei et al., 2009), Carica papaya L. (Chaves–Bedoya y Nuñes, 2007), Simmondsia chinensis (Link) Schneider (Agrawal et al., 2007) y Commiphora wightii (Arnott) Bhandari (Samantaray et al., 2010).

En este tipo de estudio ha sido igualmente útil el uso del análisis masal segregante (bulk segregant analysis, BSA, Michelmore et al., 1991). Este método ha sido utilizado con éxito para identificar marcadores moleculares ligados al sexo en varias especies dioicas. Mulcahy et al. (1992) identificaron 4 iniciadores que produjeron marcadores asociados al sexo en Silene latifolia (Mill. Greuter y Burdet). Hormaza et al. (1994) detectaron un marcador simple asociado al sexo femenino y ausente en machos en Pistacia vera L. Sakamoto et al. (1995) reportaron un marcador RAPD de 730 pb que estaba asociado con el sexo masculino de Cannabis sativa. Empleando secuencias inter–microsatélites (ISSR, simple sequence repeats), Sharma et al. (2008) detectaron un iniciador (UBC–807), de los 45 evaluados, que produjo un fragmento de ~1,200 pb asociado al sexo masculino en Simmondsia chinensis (Link) Schneider.

En Cicadales se cuenta hoy en día con dos marcadores candidatos de ADN específicos al sexo masculino. Ambos fueron desarrollados con la técnica de RAPD y han sido usados en la identificación del sexo en plantas de Encephalartos natalensis (Dyer and Verdoorn) (Prakash y Van Staden, 2006) y Cycas circinalis L. (Gangopadhyay et al., 2007). En cambio, no se cuenta con información similar en C. mexicana que permita efectuar un diagnóstico temprano del sexo en esta especie. Por ello se propuso en el presente estudio detectar marcadores RAPDs asociados al sexo en esta especie que contribuyan a establecer estrategias efectivas para su conservación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Descripción del área de estudio y colecta del material vegetal

La colecta se realizó en la población de C. mexicana ubicada en el cerro de Coacoatzintla (19° 35' 35.0", N 96° 56' 52.3'' W, 1,545 m), perteneciente al municipio de Coacoatzintla, Ver. (Figura 1). C. mexicana se localiza bajo el dosel del bosque mesófilo de montaña (Rzedowski, 1978) a una altitud que varía de los 1,450 a los 1,700 m, con una pendiente muy próxima al 40 %. Entre las especies asociadas a este tipo de vegetación se encuentran: Quercus spp., Alnus jorullensis Humboldt, Bonpland y Kunth, Clethra mexicana Conzatti, Lysiloma divaricada Jacq. y Trophis racemosa L. Urban (Alejandre et al., 1990). Esta población ha estado sometida a fuertes presiones antropogénicas debido, principalmente, a la extracción desmedida de individuos para su venta ilegal en el mercado.

Se colectaron muestras de tejido foliar de 30 individuos sexualmente diferenciados (15 individuos machos e igual número de individuos hembras). Para ello se seleccionaron sólo aquellas hojas localizadas en la parte superior de la planta, que tuviesen una apariencia sana. El material foliar colectado se etiquetó debidamente y se trasladó, para su análisis, en una hielera conteniendo paquetes de geles congelados. Una vez en el laboratorio, se conservaron bajo condiciones de refrigeración a 4°C hasta el momento de su procesamiento.

Extracción de ADN

La extracción de ADN a partir del tejido foliar de C. mexicana, se realizó siguiendo el procedimiento reportado por Steward y Vía (1993) basado en el uso del bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB). El procedimiento fue ligeramente modificado en este trabajo en cuanto al tiempo de la primera centrifugación (8 min) a 2,000 rpm y el tiempo (20 min) de la centrifugación final realizada a 14,000 rpm. Concluida la centrifugación, se desechó la fase acuosa y se dejó secar la pastilla y al final se resuspendió en 100 µL de agua. Las muestras se mantuvieron en congelación a –20°C hasta su análisis. Posteriormente se efectuó la determinación cualitativa del ADN extraído por electroforesis en geles de agarosa al 0.8 % en tampón TBE 0.5 X a un voltaje de 90 voltios. Al término de la electroforesis los geles fueron teñidos con solución de bromuro de etidio (10 m·gmL^–1) y se visualizaron en un transiluminador de luz UV (Electtrofor 365 Uvifor L20). La cuantificación del ADN total se realizó por espectrofotometría, en un espectrofotómetro GENESYS 20 determinando la absorbencia a 260 nm del ADN presente en cada una de las muestras obtenidas. El ADN presente se estimó con la fórmula propuesta por (Valadez y Günter, 2000). La pureza del ADN se determinó con los valores 260/280 (Sambrook y Russell, 2001).

Análisis masal segregante (BSA)

Una vez analizado el contenido y calidad del ADN genómico extraído se realizaron las diluciones del ADN total de cada uno de los individuos en estudio (30 individuos en total). Con ello se aseguró contar con la misma concentración de ADN en cada una de las mezclas de ADN formadas (tres mezclas de ADN conformadas por 5 individuos por género) siguiendo el análisis masal segregante (BSA) descrito por Michelmore et al. (1991).

Análisis RAPD

El ADN genómico de cada mezcla formada fue sometido a la reacción de PCR para detectar marcadores RAPDs usando 5 iniciadores (Kit B: OPB₀₈, Kit K: OPK₁₀ y OPK₁₅, Kit E:OPE₁₇ [marca Operon Technologies] y S₁₅₂, este último usado en coníferas por Xie et al [2009] (Cuadro 1). Las reacciones de RAPD fueron efectuadas en un Termociclador Perkin Elmer (PE480) en un volumen Anal de 25 µL conteniendo una concentración de 1x del tampón de PCR (3 mM MgCl₂, 30 mM KCl y 10 mM Tris, pH 8.3), 2 mM de MgCl₂, 200 µM de cada uno de los dNTPs (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 15 picomol de iniciador, 0.5 unidades de Taq DNA polimerasa (marca Promega) y 20 ng de ADN genómico. El programa seguido fue el siguiente: 2 minutos de desnaturalización inicial a 94 °C, y 45 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 94 °C; 2 minutos de alineación del iniciador a 40 °C y 2 minutos de elongación a 72 °C. Posteriormente se mantuvo constante a 72 °C por 5 minutos y luego se conservó a temperatura de 4 °C hasta la realización de la electroforesis. Todas las amplificaciones fueron repetidas dos veces. La separación de los productos amplificados se realizó por electroforesis horizontal en gel de agarosa (1.8 % p/v) conteniendo bromuro de etidio (5 µL de solución 10 m·gmL^–1 de bromuro de etidio para un gel de 120 mL). Se utilizó como tampón de corrida para la electroforesis 1x TBE [54 m·gmL^–1 de Tris–HCl; 27.5 m·gmL^–1 de ácido bórico; 0.01 M de EDTA pH 8,0] al igual que el empleado en la preparación del gel. Se utilizó una fuente de poder Scie–Plas (modelo PSU400/200) para realizar las corridas a 100 volt por 2.5 horas. Cada pozo del gel fue cargado con 5 µL de los productos amplificados y 3 µL de tampón de carga (marca Promega). Se aplicaron al inicio y fin de cada gel 2 µL de marcador de peso molecular de 100 pb (marca Promega). Los geles se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta (marca Consort).

Las amplificaciones fueron repetidas varias veces para asegurar la adecuada reproducibilidad y consistencia de los perfiles de bandas obtenidos. Las bandas que no mostraron adecuada resolución y repetibilidad se consideraron como artefactos de la PCR y no se incluyeron en el análisis. Cada banda amplificada RAPD se registró con base en el tipo de iniciador y peso en pares de bases (pb). El tamaño de los alelos se determinó por comparación de movilidad en el gel con el marcador de tamaño molecular de ADN de 100 pb (marca Promega).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos mostraron la presencia de perfiles de bandas RAPDs repetibles y reproducibles en las mezclas de ADN de los individuos sexualmente diferenciados con los cinco iniciadores evaluados (Figura 2).

En el Cuadro 1 se resumen los iniciadores y sus secuencias (5'– 3'), así como el número y rango en peso molecular (pb) de los productos de amplificación generados por cada iniciador. Se detectó un total de 37 bandas. De ellas, el 63 % resultaron polimórficas. El número de productos amplificados por iniciador varió de 4 a 10 para machos y de 3 a 8 para hembras El número de bandas por sexo osciló entre 2 y 11 para machos y de 3 a 9 para hembras, con un número promedio de 7 y 5 bandas para machos y hembras, respectivamente.

De los cinco iniciadores analizados, sólo OPK₁₀ y OPE₁₇ mostraron bandas distintivas al sexo en C. mexicana. Con el decámero OPK₁₀ se observó la presencia de una banda de 500 pb, en dos de las tres mezclas de machos evaluadas, mientras que con el OPE₁₇ se detectaron dos bandas (1,400 y 1,100 pb) que tipificaron a las mezclas de individuos machos evaluados (Figura 3).

Los marcadores específicos al sexo pueden representar ADN amplificado de un cromosoma sexual o bien polimorfismo de ADN (ej. mutaciones puntuales) que están ligadas a genes sexuales (Valadez y Günter, 2000). Sin embargo, es posible que las bandas detectadas no estén estrechamente ligadas con el locus determinante del sexo en esta especie. Como se sabe, las bandas ligadas al sexo por lo regular se presentan en muy baja frecuencia y no siempre de modo consistente. Algunos autores han requerido del empleo de un mayor número de iniciadores (20 iniciadores) para detectar la presencia de marcadores asociados al sexo masculino en Cannabis sativa (Sakamoto et al., 1995, Mandolino et al., 1999), y de 400 a 900 iniciadores RAPDs en Pistachio vera L. y Humulus lupulus L. (Hormaza et al., 1994; Polley et al., 1997).

Por ello es de esperar que el análisis de un mayor número de iniciadores y mezclas de individuos sexualmente diferenciados permitan detectar marcadores estrechamente ligados al sexo en esta especie. En ese caso se tiene previsto convertir los marcadores RAPDs asociados al sexo masculino detectados (OPK₁₀500 así como OPE₁₇1000 y OPE₁₇1400) en marcadores SCARs (sequence characterized amplified regions), más específicos y altamente reproducibles, para proceder a validar estos resultados en la identificación temprana del sexo, en esta y otras especies de cícadas amenazadas del estado de Veracruz, como Zamia furfuracea L. Sin embargo no se descarta la posibilidad de que la expresión del sexo en C. mexicana tenga una base epigenética (cambios en los patrones de expresión genética que ocurren sin alteraciones en la secuencia nucleotídica), como ha sido establecido en otras especies vegetales (Janousek et al., 1996; Spielman et al., 2001).

AGRADECIMIENTO

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el financiamiento recibido para la realización de este trabajo, parte del proyecto (CB–CONACYT: 000000000083156): Bases bioquímicas y moleculares para la identificación temprana del sexo en Ceratozamia mexicana Brongn. (Zamiaceae): un fósil viviente de México amenazado.

LITERATURA CITADA

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