Efecto de la fertilización sobre el crecimiento y contenido de compuestos volátiles en Satureja macrostema (Benth) Briq.

Effect of fertilization on growth and the content of volatile compounds of Satureja macrostema (Benth) Briq.

Rafael Torres-Martínez¹, Miguel Ángel Bello-González², Jorge Molina-Torres³, Enrique Ramírez-Chávez³, Yolanda García-Rodríguez⁴, Rodolfo Fulgencio-Negrete¹, Alejandra García-Hernández¹, Rodolfo López-Gómez¹, Mauro Manuel Martínez-Pacheco¹, Blanca Nieves Lara Chávez² y Rafael Salgado-Garciglia¹

¹ Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.

³ Laboratorio de Fitobioquímica, Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Guanajuato.

⁴ Laboratorio de Ecología Química, Centro de Investigaciones en Ecosistemas, Universidad Nacional Autónoma de México

Fecha de recepción: 18 de junio de 2013;
Fecha de aceptación: 11 de diciembre de 2013.

RESUMEN

El nurite, Satureja macrostema, tiene gran importancia en la medicina tradicional mexicana. El presente trabajo evaluó el crecimiento y contenido de compuestos volátiles en la parte aérea de esta especie. El efecto de la fertilización mineral N – P - K se analizó en plantas micropropagadas (clones), cultivadas por 90 días en invernadero. Se aplicaron tres niveles de N – P – K mensualmente, de la siguiente manera: T2: 10 – 10 - 10; T3: 17 – 17 - 17 y T4: 20 – 20 – 20, además de un tratamiento testigo, T1: 1 g kg^-1 de sustrato. Las plantas del T4 tuvieron el mayor tamaño, con 50.33 cm de altura, 227.1 hojas por individuo, 9.52 cm² de área foliar y 24.94 g de peso fresco (4.72 g de peso seco). Los volátiles fueron examinados por cromatografía de gases y espectrometría de masas. Se registraron con más abundancia: pulegona, limoneno, linalol, mentona y verbenona. Se determinaron cantidades superiores a las del testigo conforme fueron más altas las concentraciones de fertilizante; así, se extrajeron para el T4: 45.95 µg g^-1 de pulegona, 2.17 µg g^-1 de limoneno, 10.79 µg g^-1 de linalol y 3.06 µg g^-1 de mentona, excepto la verbenona que fue más cuantiosa en el T1. La fertilización con T4 resultó positiva, tanto para el crecimiento de la planta, como para la abundancia de volátiles, en comparación con las plantas no fertilizadas.

Palabras clave: Compuestos volátiles, fertilización mineral, planta medicinal, Satureja macrostema (Benth.) Briq., terpenos, variación.

ABSTRACT

This study evaluated the growth and content of volatile compounds (terpenes) of the aerial parts (leaves and stems) of nurite, Satureja macrostema, a plant used in Mexican traditional medicine. The effect of mineral fertilization (N – P – K) was analyzed in micropropagated plants (clones), cultivated in a greenhouse during 90 days. Three levels of N – P – K were applied every month in the following way: T2: 10 – 10 - 10; T3: 17 – 17 - 17 and T4: 20 – 20 – 20, besides a control T1: 1 g kg^-1 of substrate. The plants fertilized with 20 – 20 – 20 (T4) attained the largest size, with 50.33 cm of height, 227.1 leaves per individual, 9.52 cm² of leaf area and 24.94 g of fresh weight (4.72 g of dry weight). The volatile compounds were examined by means of gas chromatography and mass spectrometry; the most abundant were pulegone, limonene, linalool, menthone and verbenone. The main volatile compounds analyzed by gas chromatography and mass spectrometry, were pulegone, limonene, linalool, menthone and verbenone. Many of these were obtained with treatment T4, in the following quantities: 45.95 µg g^-1 (fresh weight) of pulegone, 2.17 µg g^-1 of limonene, 10.79 µg g^-1 of linalool and 3.06 µg g^-1 of menthone; a reduced content of verbenone was found, compared to untreated plants. Fertilization with N-P-K (T4, 20-20-20) has a positive effect on growth and the content of volatile compounds of nurité (S. macrostema) plants compared to unfertilized plants.

Key words: Volatile compounds, mineral fertilization, medicinal plant, Satureja macrostema (Benth.) Briq., terpenes, variation.

INTRODUCCIÓN

Desde tiempos remotos las plantas aromáticas y medicinales se han obtenido mediante la recolección de flora silvestre (Craker, 1999); costumbre que aún se practica para algunas de ellas (Cases, 2007) y conlleva a la sobreexplotación de sus poblaciones naturales. Derivado de esta problemática surge la necesidad de implementar formas de producción eficientes para lograr la sostenibilidad, como la domesticación (Zengin et al., 2008); al mismo tiempo que genera un efecto positivo al conseguirse un aumento en la calidad de la materia prima que permite estandarizar la concentración de principios activos a través de individuos homogéneos para su obtención y procesamiento (Davies, 2004).

En México, la mayoría de los cultivos con fines terapéuticos provienen de especies introducidas: manzanilla (Matricaria chamomilla L.), lavanda (Lavandula officinalis Chaix), albahaca (Ocimum basilicum L.), menta (Mentha x piperita L. (pro. sp.)), tomillo (Thymus vulgaris L.) y orégano (Origanum vulgare L.). A pesar de la alta demanda que tienen algunas silvestres nativas, no existen suficientes estudios que aborden las condiciones agronómicas que influyen en sus características cualitativas y cuantitativas. Diversas investigaciones demuestran que el abono mineral, especialmente mediante la aplicación de nitrógeno (Zheljazkov et al., 2009), fósforo (Zhu et al., 2008) y potasio (Pavlovic et al., 2006) favorece la generación de biomasa y la composición de metabolitos secundarios de interés económico, como algunos volátiles. Es fundamental conocer los factores que determinan estas diferencias para incrementar su rendimiento (Estrada, 2002). En Origanum dayi Post., Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. y Zea mays L., las variaciones entre ellos provienen del efecto que tiene la fertilización mineral completa N – P - K (Nitrógeno – Fósforo - Potasio), ya que origina cambios en la proporción de algunos monoterpenos: geranil acetato, β-cariofileno, β-bisaboleno y nerolidol (Gouinguené y Turlings, 2002; Amzallag et al., 2005; Antolinez-González et al., 2008).

Satureja macrostema (Benth.) Briq., conocida como nurité, pertenece a la familia Lamiaceae y tiene gran importancia en la medicina tradicional de los pueblos purépechas (Michoacán), quienes la consideran un símbolo de fertilidad; además de ser un remedio ante diversos padecimientos (Rzedowski y Rzedowski, 1985; Martínez, 1986; Bello, 1993). En la literatura se documenta que contiene una mezcla de compuestos químicos denominados flavonoides, los cuales fueron estudiados de manera extensa en los últimos años, sobre todo por su efecto antioxidante (Catapano, 1997; Pérez-Gutiérrez y Gallardo-Navarro, 2010); entre aquellos que se han extraído de sus hojas se citan a la naringenina, y ciertos terpenos: limoneno, pulegona, carvacrol y timol, considerados antimicrobianos (Bello, 2006).

El nurite tiene una amplia demanda en México (Bello, 2006) y a pesar de que la extracción de ejemplares silvestres supone una fuerte amenaza para la biodiversidad, aún no existen programas para su domesticación. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto de la fertilización mineral completa (N – P - K) sobre el contenido de compuestos volátiles en clones de S. macrostema durante su crecimiento en invernadero, con el fin de fomentar su producción agrícola.

MATERIALES Y MÉTODOS

Plántulas de nurite y condiciones de cultivo

Se utilizaron individuos de S. macrostema con treinta días de edad, mantenidas in vitro en medio nutritivo MS (Murashige y Skoog, 1962) con 30 g L^-1 de sacarosa y 8 g L^-1 de agar bacteriológico adicionado con 0.1 mg L^-1 de ácido indolbutírico. En el momento de su trasplante, y para su aclimatación en invernadero, presentaron una altura de 4.5 cm, 2 a 3 pares de hojas y 3 a 4 raíces de hasta 4.5 cm de longitud. Se conservaron durante treinta días en una maceta con capacidad para 1 kg de sustrato, el cual consistió en una mezcla 1:1 de turba comercial (peat-moss) y agrolita bajo condiciones de alta humedad relativa (HR) (≥70 %). Las plantas permanecieron con HR ambiental (50 a 60 %) y se regaron por pulverización cada tres días con agua corriente, sin permitir la desecación del sustrato (100 mL/maceta), la fertilización se realizó de forma mensual. Las dimensiones del invernadero son de 4 x 9 m. No existieron condiciones testigo respecto a temperatura e intensidad lumínica. La investigación se llevó a cabo de agosto a noviembre de 2012 en el campo universitario de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo en Morelia, Michoacán.

Tratamientos de fertilización completa (N – P - K)

Se aplicaron un tratamiento testigo (T1) sin fertilizante y tres niveles de fertilización (T2: 10 – 10 - 10; T3: 17 – 17 - 17; y T4: 20 – 20 - 20), con Nutrigarden Excelso^®, denominado TRIPLE por su contenido de nitrógeno, fósforo y potasio (N – P - K). La concentración se expresó en porcentaje de cada macronutriente por kilogramo de fertilizante. En T2, T3 y T4 se adicionó 1 g por individuo (1 g por maceta) sobre el sustrato, cada treinta días, para un total de tres fertilizaciones en los noventa días de experimentación.

Determinación de variables de crecimiento

Para cada tratamiento (T1 a T4) se evaluaron: altura (cm), número de hojas y área foliar (cm²) a los 0, 30, 60 y 90 días. La altura se midió considerando la longitud desde la base del tallo hasta la yema apical; el número de hojas se determinó por conteo total en ramas; y el área foliar se obtuvo mediante el método de estimación, a partir de ecuaciones matemáticas que involucran largo y ancho de las hojas (Robbins y Pharr, 1987). La biomasa (g) se recabó tanto para peso fresco (de manera directa), como para peso seco, este último únicamente se obtuvo al final del experimento, posterior a un secado a 60 °C por 18 h. Los datos fueron tomados antes de hacer el corte de material vegetal para analizar los compuestos presentes.

Análisis y cuantificación de volátiles

Se recolectó 1 g (peso fresco) de la parte aérea apical (hojas y tallo) de los ejemplares correspondientes a los cuatro tratamientos, a los 0, 30, 60 y 90 días. Para los extractos, se maceró el material de cada planta con 10 mL de hexano y 500 mL del compuesto estándar tetradecano (C₁₄H₃₀, 0.05 mg mL^-1) durante 5 días a 4 °C, después se decantaron y llevaron a sequedad con gas nitrógeno para remover el hexano y posteriormente se resuspendieron en 1 mL de hexano y permanecieron en refrigeración a 4 °C hasta su análisis.

La identificación y cuantificación de los compuestos volátiles se llevó a cabo por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM). Se inyectó 1 µL de muestra en un cromatógrafo de gases Agilent Technologies (7 890A) equipado con un detector de masas (Agilent 5 975C), que operó utilizando helio como gas acarreador, con un flujo de 1 mL min^-1, con inyección dividida (split 50:1), a una temperatura de 250 °C en una columna capilar no polar HP 5MS (30 m x 0.25 mm I.D. x 0.25µm Film), con las siguientes condiciones: temperatura inicial de 50 °C, seguida por una rampa de 5 °C min^-1 para alcanzar 280 °C por 1 min, otra rampa de 25 °C min^-1 para llegar a 380 °C, hasta 3 min. El tiempo de corrida fue de 50 minutos. El espectrómetro de masas funcionó a una velocidad de flujo de 1 mL min^-1, con un voltaje de ionización a 70 eV, a una temperatura de la interfase de 250 °C, en modo SCAN y en un intervalo de masas de 50 - 500 m z^-1.

Los compuestos volátiles se identificaron al realizar una comparación entre los tiempos de retención y espectros de masas de cada compuesto, y los de la biblioteca National Institute of Standards and Technology (NIST08) y se cuantificaron por relación directa con el estándar interno Tetradecano (Sigma Aldrich^®). Las concentraciones de los volátiles están expresadas en microgramos por gramo de peso fresco de la muestra (µg g^-1 peso fresco).

Análisis estadístico

Los datos de cada uno de los experimentos se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA, p ≤ 0.05), mediante la prueba de diferenciación de medias Tukey, se analizó un número variable de muestras (n) según cada experimento. Se utilizó el programa estadístico JMP 8.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A los treinta días de cultivo se establece el tiempo de inicio del experimento (día 0). En esa fecha se registró una longitud en las plantas de nurite de 12.08 a 13.66 cm, en este punto aquellas correspondientes a T1 (sin fertilización) alcanzaron menor altura, respecto a los demás tratamientos, sin diferencias significativas entre ellos (Figura 1A). De los 60 a los 90 días se evidenció un comportamiento similar, con individuos de T1 más pequeños; sin embargo, se observaron diferencias significativas con los tres tratamientos de fertilizante. A los 90 días la altura en T3 (46.83 ± 1.81 cm) y T4 se incrementó (50.33 ± 2.33 cm), en comparación con la de T1 (27.5 ± 1.87 cm) y T2 (40.83 ± 2.56 cm) (Figura 1A), ya que aumentaron 253.4 % y 313.9 %, respectivamente, en relación con T1.

En un principio se contabilizaron, en promedio, 12.83 hojas por ejemplar, número que se intensificó a los 30 días, especialmente en individuos de T2, T3 y T4, lo que se mantuvo a los 60 y 90 días de cultivo. En todo momento para T4 se inventariaron más hojas con diferencias significativas (57.66 ± 2.86 hojas), al final del experimento la cantidad fue 7.4 veces mayor que T1 (227.1 hojas) (Figura 1B).

A partir del día 30, los especímenes fertilizados (T2, T3 y T4) mostraron más desarrollo del área foliar, en particular, T4, con 4.97 cm² y no se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos. En los días 60 y 90, el área foliar del T4 (7.58 y 9.52 cm², respectivamente), fue más grande que en los otros tratamientos y 2.07 veces, en comparación con T1 (Figura 1C).

A los 90 días se determinó la biomasa (peso fresco y seco). Las plantas no fertilizadas (T1) generaron menos biomasa, y existió un aumento gradual en las tratadas con T2, T3 y T4 (Figura 2). T4 presentó diferencias significativas, con 5.9 y 7.04 veces más en peso fresco y seco, respectivamente, en comparación con T1; además de que obtuvo un peso máximo de 24.94 ± 1.51 g (peso fresco) y 4.72 ± 1.2 g (peso seco) (Figura 2).

A pesar de que S. macrostema no se cultiva ni se maneja en invernadero, se esperaba una respuesta positiva a la aplicación de fertilizante mineral, ya que algunos estudios indican que la fertilización favorece la producción de biomasa en diversos cultivos (Mohamed y Abdum, 2004; Nagdhi–Badi et al., 2004; Pavlovic et al., 2006; Zhu et al., 2008; Zheljazkov et al., 2009).

La biomasa en las plantas de nurite aumentó en proporción a la concentración de fertilizante (N – P - K) añadida, lo que concuerda con los resultados de Juárez-Rosete (2010), quien indica que la fertilización mineral promueve el desarrollo en altura y biomasa (peso fresco y seco) en Matricaria recutita L. Este efecto también ha sido demostrado en otras especies con efectos medicinales: Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. (Soto et al., 2002), Thymus vulgaris (Omidbaigi y Arjmandi, 2002) y Echinacea angustifolia DC. (Berti et al., 2002).

Efecto de la fertilización N – P - K sobre el contenido de compuestos volátiles

Se identificaron y cuantificaron los principales constituyentes del extracto hexánico de la parte aérea de nurité por CG - EM. Los terpenos limoneno, linalol, mentona, pulegona y verbenona fueron los más abundantes a los treinta días de cultivo, y su presencia se mantuvo durante los noventa días de experimentación, se determinó variación en el contenido entre los tratamientos. Los tiempos de retención por compuesto, los índices Kovats que confirman la identidad de cada terpeno y su cantidad se muestran en el Cuadro 1.

El contenido de linalol, mentona y pulegona aumentó con el tiempo de cultivo en individuos tratados (T2, T3 y T4), por lo que fue mayor a los noventa días (10.79 µg g^-1 peso fresco de linalol, 3.06 µg g^-1 de mentona y 45.95 µg g^-1 de pulegona), cuando las plantas tratadas con 20 – 20 - 20 (T4) mostraron diferencias significativas respecto a los demás tratamientos (Figura 4). Las plantas no tratadas con fertilizante (T1) presentaron disminución en el contenido de estos compuestos (Figura 4). Al final del experimento, el material correspondiente a T4 registró un incremento de 3.2 veces de linalol, (Figura 4A), 5.5 de mentona (Figura 4B) y1.49 de pulegona (Figura 4C), en comparación con el testigo.

La pulegona resultó ser el terpeno más abundante en S. macrostema, lo que coincide con investigaciones recientes que indican que es el más cuantioso en: Hedeoma multiflorum Benth (Fernández et al., 2007), Minthostachys verticillata (Griseb.) Epling. (Cariddi et al., 2007), Minthostachys mollis (Kunth.) Griseb. (Cano et al., 2008), Minthostachys setosa (Briq.) Epling. (Chaquilla–Quilca et al., 2011) y algunas especies de Satureja, como S. parvifolia (Phil.) Epling. (Juárez et al., 2000) y S. odora (Gris.) Epl. (Molina et al., 2002).

Para nurite, el rendimiento del contenido de volátiles crece con la madurez de las hojas y los diferentes niveles de fertilización, lo que promovió la acumulación de pulegona, linalol y mentona (Figura 4) y la disminución de limoneno y verbenona (Figura 5). Rohloff et al. (2005) señalan que la presencia de monoterpenos se eleva con la edad de las hojas, pero a las tres semanas de edad puede declinar. También se ha documentado que el rendimiento de los aceites esenciales depende del desarrollo en el área foliar y de tricomas glandulares (Jeliazkova et al., 1999).

El aumento de linalol durante la fertilización en ejemplares de T4 concuerda con los resultados de Gouinguené y Turlings (2002) en Zea mays, quienes mencionan que la aplicación de fertilizante completo logró escalar los niveles de dicho compuesto respecto a las plantas no fertilizadas.

La reducción de pulegona a partir de los 60 días (Figura 4C) se explica por la crecida en los niveles de mentona (Figura 4B). Este comportamiento ha sido citado en Mentha arvensis auct. non L. (Nassiff et al., 2002), Mentha X piperita L. (pro. sp.) (Arzani et al., 2007), Mentha pulegium L. (Nassiff et al., 2004), Minthostachys verticillata (Griseb.) Epling. (Cariddi et al., 2007) y Minthostachys mollis (Cano et al., 2008); y confirma que la pulegona es el intermediario central en la biosíntesis de mentona, por lo que presumiblemente, la eventual caída de pulegona se relaciona con la subida de mentona.

El limoneno disminuyó en todos los tratamientos, en el caso de T4, a los 30 días se obtuvo el mayor contenido (2.17 µg g^-1), tras lo cual, comenzó a declinar. A pesar de ello, en T4 se determinó significancia estadística (Figura 5A).

Algunos estudios consignan que en especies de la familia Lamiaceae, ciertos compuestos volátiles se biosintetizan a partir del limoneno (Soheil y Rodney, 2003), uno de ellos es la pulegona; aunque existe muy poca información acerca de la reversibilidad de la reacción (Bohlmann et al., 1998; Muruyama et al., 2002), pero esto explicaría el decrecimiento de limoneno durante los noventa días de experimentación, mientras que la concentración de pulegona tuvo un comportamiento contrario. Un resultado similar se documentó en Lippia alba (Mill.) N. E. Br. ex Britton et P. Wilson, con un contenido de limoneno bajo (4.7%); en tanto que, el de la carvona (un intermediario de la síntesis de pulegona) sube (23.6 %) (Parra-Garcés et al., 2010).

En el material del T1 la verbenona no presentó mayores cambios y mantuvo un contenido similar entre cada muestreo (Figura 5B). Sin embargo, en las plantas tratadas con los tres niveles de fertilización (T2, T3 y T4) se observó un decremento en el contenido de verbenona desde los 30 y hasta los 90 días, momento en el que los valores, incluso, resultaron menores a los de T1. El contenido entre tratamientos con fertilizante no tuvo diferencias significativas, pero sí con el testigo (2.58 µg g^-1) (Figura 5B). La disminución de verbenona por efecto de la fertilización mineral se observó en plantas de maíz por Gouinguené y Turlings (2002), quienes argumentan que la tasa de fertilización completa causa cambios en las proporciones de los volátiles, cuya estructura se constituye por un doble ciclo (10 carbonos), como en el caso de la verbenona. Además se ha documentado que la fertilización afecta la reacción de dos moléculas de mirceno para formar al terpeno α -pineno, un intermediario para su biosíntesis (Barrera et al., 2008).

Los resultados de la presente investigación reflejan que bajo condiciones de invernadero y mediante la utilización de fertilizantes con diferentes niveles de N – P - K, se puede favorecer el aumento y rendimiento de compuestos volátiles (Golmakani y Rezaei, 2008), hecho que está estrechamente relacionado con el incremento de biomasa en las plantas tratadas.

CONCLUSIONES

La fertilización mineral a base de N – P - K (20 – 20 -20) en S. macrostema cultivada en invernadero registró un efecto positivo en el crecimiento de las plantas y en el contenido de los compuestos volátiles mayoritarios como el linalol, limoneno, mentona y pulegona. El principal componente volátil de nurite es el terpeno pulegona.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo financiero para su publicación a través del proyecto PIFI / 2012 -16MSU 0014T – 04 - 01

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