Monosporic strains of Metarhizium anisopliae and its pathogenicity to Galleria mellonella in Tabasco, Mexico

Magdiel Torres de la Cruz^a, Hipólito Cortez Madrigal¹³, Carlos Fredy Ortiz García^c, Silvia Cappello García^a, Manuel Pérez de la Cruz^a

^a División Académica de Ciencias Biológicas. Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, Carretera Villahermosa-Cárdenas Km. 0.5. 86039. Tabasco, México. magtorre@colpos.mx. Correspondencia al primer autor.

^b Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Michoacán, Instituto Politécnico Nacional. México.

^c Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco. México.

Resumen

La "polilla mayor de las ceras" Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) es ocasionalmente encontrada en colmenas y es la principal plaga de cera almacenada. El objetivo del presente estudio fue evaluar la patogenicidad de aislamientos monospóricos nativos de M. anisopliae sobre larvas de G. mellonella. Se utilizaron cuatro aislamientos poliespóricos nativos (MaA1, MaA2, MaA3, MaA4). De cada aislamiento se obtuvieron 10 aislamientos monospóricos; así, un total de 40 aislamientos monospóricos se utilizaron para la prueba de patogenicidad, los cuales fueron conformados en cuatro grupos con base al aislamiento poliespórico de origen. El análisis estadístico aplicado separadamente a cada uno de los cuatro grupos mostró diferencias significativas (Tukey, P<0.05) en la mortalidad de G. mellonella. Los aislamientos de M. anisopliae más patogénicos, y que superan el 80 % de mortalidad fueron: MaA4(5), MaA1(4) y MaA3(7), con 100.0, 88.9 y 83.3 %, respectivamente. Los resultados indican amplia variabilidad intra-específica de cultivos monospóricos del hongo M. anisopliae en cuanto a su patogenicidad hacia larvas de G. mellonella, demuestran la utilidad de cultivos monospóricos y su caracterización patogénica para la selección de aislamientos con características sobresalientes; así también, muestra el potencial del hongo para el desarrollo de bioinsecticidas contra la palomilla de la cera G. mellonella.

Palabras clave: Apicultura, Hongos entomopatógenos, Polilla mayor de la cera.

Abstract

"Greater wax moth" Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) is occasionally found in beehives and is the main pest of stored wax. The objective of the present study was to evaluate the pathogenicity of native monosporic strains of M. anisopliae against G. mellonella larvae. Four polysporic indigenous isolates were used (MaA1, MaA2, MaA3, MaA4). Ten monosporic strains were obtained from each polysporic isolate. Thus, a total of 40 strains was obtained and used for the pathogenicity assay. Monosporic strains were formed into four groups based on parental polysporic isolates. Statistical analysis applied separately to each of the four groups of monosporic strains showed significant differences in G. mellonella mortality. The more pathogenic strains were MaA4(5), MaA1(4) and MaA3(7), with mortality of 100.0, 88.9 and 83.3 %, respectively. The results indicate wide intra-specific variability of monosporic strains of M. anisopliae in terms of their pathogenicity to larvae of G. mellonella. They also demonstrate the utility of monosporic strains and their pathogenic characterization for selection of isolates with outstanding features; as well as, the potential of the studied fungus for development of bioinsecticides against "greater wax moth" G. mellonella.

Keywords: Apiculture, Entomopathogenic fungi, Greater wax moth, Monosporic strains.

INTRODUCCIÓN

En México, la apicultura representa una importante actividad dentro del sector pecuario⁽¹⁾. De esta actividad dependen 42 mil productores, quienes en conjunto cuentan con aproximadamente dos millones de colmenas, y permiten que el país se ubique como el quinto productor y tercer exportador de miel en el mundo⁽²⁾. En Tabasco, la actividad apícola involucra a 167 productores, 230 apiarios y 2,800 colmenas⁽³⁾ con una producción anual de 55.8 t de miel, ocupando el lugar 29 a nivel nacional⁽⁴⁾. De esta actividad se obtienen productos como miel, cera, propóleo, jalea real y apitoxina⁽⁵⁾.

La miel es el principal producto de la colmena⁽⁶⁾, y la cera es uno de los productos más útiles de las abejas (Apis mellifera L.), que además se utiliza en la industria farmacéutica, odontología y cosmética⁽⁷⁾. La cera contiene nutrientes, polen y miel⁽⁸⁾, por lo que es atacada por diversas especies de insectos, plaga entre las que destaca la "polilla mayor de las ceras" Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae). G. mellonella es considerada una de las plagas de la cera más devastadoras y económicamente importante en el mundo⁽⁹⁾. En su fase larvaria, este lepidóptero se alimenta de la cera de las colmenas, causando destrucción de los panales. En su desplazamiento, las larvas perforan galerías que recubren con seda. Cuando los ataques son severos, las colonias con baja población de abejas pueden abandonar la colmena; sin embargo, cuando se enfrenta a poblaciones normales de abejas dentro de una colonia, éstas no son capaces de causar daño económico⁽¹⁰⁾.

El principal daño causado por G. mellonella se presenta sobre materiales que han sido almacenados durante el periodo de receso de la actividad apícola, sin ninguna protección contra las polillas⁽¹¹⁾, y representa pérdidas entre el 30 y 50 % del valor de cada colmena⁽¹²⁾. Por otro lado, los excrementos y restos de seda producidos por larvas de G. mellonella bajan la calidad de la cera, obligando al apicultor a fundirla; sin embargo, este procedimiento constituye sólo una solución parcial al problema, ya que parte de estos desechos logran traspasar los filtros⁽¹¹⁾.

La presencia de G. mellonella obliga al productor a fumigar la cera utilizando insecticidas⁽⁷⁾. Esto representa una amenaza latente para la exportación de miel, al detectarse la presencia de residuos tóxicos, lo cual puede restringir su ingreso a ciertos mercados⁽¹³⁾. Además, el control químico no es lo suficientemente efectivo debido al difícil acceso a larvas y adultos que se encuentran en las galerías (túneles), inducen resistencia, y matan insectos benéficos⁽¹⁴⁾.

Un sistema de control más sustentable e inocuo es requerido, y el uso de enemigos naturales de insectos es una alternativa de ser evaluada contra G. mellonella⁽¹⁵⁾. Al respecto, larvas silvestres de G. mellonella son susceptibles a infecciones fúngicas⁽¹⁵⁾ y los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae han sido evaluados con resultados positivos⁽⁷⁾; sin embargo, la mayoría de los trabajos se han centrado a evaluar esta alternativa para el control de Varroa destructor (Mesostigmata: Varroidae) y Achroia grisella (Lepidoptera: Pyralidae)^(16,17,18).

En Tabasco se cuenta con aislamientos nativos de M. anisopliae⁽¹⁹⁾ que pueden ser evaluados para el control de G. mellonella; sin embargo, es necesario seleccionar las mejores cepas para el desarrollo de bioinsecticidas. Una forma de lograrlo consiste en desarrollar cultivos monospóricos, ya que permiten seleccionar las mejores características de las cepas silvestres⁽²⁰⁾; por lo que, el objetivo del presente estudio fue evaluar la patogenicidad de aislamientos monospóricos nativos de M. anisopliae sobre larvas de G. mellonella.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron cuatro aislamientos poliespóricos nativos (MaA1, MaA2, MaA3, MaA4), pertenecientes a la colección de hongos entomopatógenos del Laboratorio de Entomología del Colegio de Postgraduados, Cam pus Tabasco. Todas las cepas se multiplicaron en el medio de cultivo Agar-Dextrosa de Sabouraud + 0.1% de extracto de levadura (ADS + EL)⁽²¹⁾.

Obtención de cultivos monospóricos

De cada aislamiento poliespórico se obtuvieron 10 aislamientos monospóricos⁽²²⁾. Así, un total de 40 aislamientos monospóricos se utilizaron para la prueba de patogenicidad. A cada aislamiento se le asignó la clave correspondiente al aislamiento de origen, más el número consecutivo (entre paréntesis) del aislamiento monospórico⁽²³⁾.

Obtención de larvas de G. mellonella

Panales de cera infestados naturalmente con larvas de G. mellonella se obtuvieron del apiario del Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco. Pupas de la palomilla se transfirieron a frascos de vidrio de 2 L de capacidad. A su vez, los adultos emergidos se transfirieron a nuevos frascos de vidrio de 2 L para permitir el apareamiento y oviposición. Las poblaciones de palomillas se mantuvieron a 30 ± 1 °C y 70 % de humedad relativa. Las larvas de G. mellonella se alimentaron con dieta artificial de acuerdo con Realpe et al⁽²⁴⁾. Para la elaboración de 1 kg de dieta, se mezclaron 464 g de salvado de maíz y 69 g de levadura seca. De forma separada, 67 g de cera de abejas fueron derretidos y adicionados a la primera mezcla. Posteriormente, 207 g de glicerina y 193 g de miel de abejas se adicionaron a la mezcla. Esta mezcla se colocó en recipientes cerrados y se conservó a 4 °C hasta su uso⁽²⁴⁾.

Preparación de suspensión de esporas de M. anisopliae

Se utilizaron cultivos de aislamientos monospóricos de 15 días de edad. Los conidios se cosecharon de la superficie del cultivo bajo condiciones asépticas, inundando la caja Petri con agua destilada estéril (ADE) + dispersante al 0.1% (inex®), y raspando la colonia con un bisturí. La suspensión se filtró con gasa clínica para separar el micelio y los conidios agitados durante 10 min en un agitador magnético (Thermolyne®, Artu r H . Th om as Co., Philadelphia, PA, EUA). El conteo de conidios se real izó en cámara de Neubauer y su concentración estimada mediante la fórmula C= (Cc) (4 x 10⁶)(Fd/80), donde: C= número de conidios ml^-1; Cc= número promedio de conidios contados en la cámara de Neubauer y, Fd= factor de dilución⁽²⁵⁾.

Pruebas de patogencidad

Con base al aislamiento poliespórico de origen, cuatro grupos de 10 aislamientos monospóricos fueron conformados. Por cada aislamiento monospórico, 10 larvas del cuarto instar de G. mellonella se sumergieron durante 5 s en una suspensión de 2 x 10⁷ conidios/ml^-1 de acuerdo con Toriello et aß⁶) e Ibarra⁽²⁷⁾. Inmediatamente después, las larvas se colocaron en cámara húmeda que consistió de una caja Petri con papel filtro húmedo en su interior. Posteriormente se incubaron a 25 ±1 °C y se registró la mortalidad diaria durante ocho días. Las larvas muertas se removieron e incubaron en cámara húmeda individual a 25 ± 1 °C para confirmar el desarrollo micelial y la producción conidial de M. anisopliae sobre la cutícula del insecto. Como testigo se utilizaron 10 larvas inmersas sólo en ADE+ inex® (0.1%). Tres repeticiones por aislamiento monospórico y testigo se establecieron. La mortalidad obtenida (%) se corregió mediante la fórmula de Abbott⁽²⁸⁾. Los datos obtenidos se transformaron al arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción. Cada grupo de aislamientos monospóricos (conformado en base al aislamiento poliespórico de origen), fue sometido, de forma independiente, a un análisis de varianza (ANVA). La prueba de separación de medias se corrió con un margen de error de 0.05 (Tukey, α= 0.05) mediante el programa estadístico SAS⁽²⁹⁾.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Diferencias significativas se encontraron en la mortalidad de G. mellonella al analizar cada cada uno de los cuatro grupos de cultivos monosporicos. Así, en los cepas monospóricas obtenidas del aislamiento poliespórico MaA1 la mortalidad fluctuó del 24 al 89 % (F= 9.18, gl= 9, P<0.001) (Cuadro 1). En este grupo, el aislamiento monospórico más virulento fue MaA1(4) (88.9 %) sin mostrar diferencias significativas con el MaA1(5), MaA1(6), MaA1(2), MaA1(9) y MaA1(3); el menos virulento fue el MaA1(1) (24.3 %) sin diferencias significativas con los aislamientos MaA1(10) y MaA1(8).

En cuanto a los 10 aislamientos monospóricos provenientes del aislamiento poliespórico MaA2, la mortalidad fluctuó entre 14.8 y 76.6 % (F= 10.36, gl= 9, P<0.001) (Cuadro 2). El aislamiento con mayor virulencia fue MaA2(1) (76.7 %) sin diferencias significativas con MaA2(7) MaA2(5) MaA2(10) MaA2(3) MaA2(4) y MaA2(8), en tanto que el aislamiento menos virulento fue el MaA2(9) (14.8 %), sin mostrar diferencias con el aislamiento MaA2(2).

Respecto a los aislamientos monospóricos derivados del aislamiento poliespórico MaA3, la mortalidad fluctuó entre 19.9 y 83.3 % (F= 6.36, gl= 9, P<0.003) (Cuadro 3). El aislamiento que causó mayor mortalidad fue MaA3(7) (83.3 %), sin diferencias estadísticas con MaA3(2), MaA3(1), MaA3(8), MaA3(9), MaA3(4), MaA3(10), MaA3(3); el tratamiento menos patogénico hacia larvas de G. mellonella fue el monospórico MaA3(6) (19.9 %), sin diferenciarse de los aislados MaA3(3) y MaA3(5).

Con respecto a los aislamientos provenientes del aislamiento poliespórico MaA4, la mortalidad fluctuó del 10 al 100 % (F= 6.06, gl= 9, P<0.001) (Cuadro 4). MaA4(5) fue el aislamiento que causó mayor mortalidad (100 %), y MaA4(10) fue el que causó menor mortalidad (10 %). Los ocho aislamientos restantes formaron dos grupos intermedios.

Los resultados indican una amplia variabilidad intraespecifica de cultivos monospóricos del hongo M. anisopliae en cuanto a su patogenicidad hacia larvas de G. mellonella. Lo anterior demuestra la utilidad de cultivos monospóricos y su caracterización patogénica en la selección de aislamientos con características sobresalientes; así también, muestra el potencial del hongo estudiado para el desarrollo de bioinsecticidas contra G. mellonella.

Con base en los resultados, los aislamientos de M. anisopliae más patogénicos hacia G. mellonella fueron MaA4(5), MaA1(4) y MaA3(7). Estos aislamientos superaron el 80 % de mortalidad con 100.0, 88.9 y 83.3 %, respectivamente. Resultados similares fueron encontrados por Neupane⁽³⁰⁾, el cual obtuvo cepas de M. anisopliae con mortalidad de 96.6 % sobre G. mellonella, después de 10 días de haberse aplicado a una concentración de 1 x 10⁷ conidios ml^-1. Así también, Khalid et al⁽⁷⁾ y Klingen et al⁽³¹⁾ obtuvieron cepas con mortalidad del 100 % sobre G. mellonella, a una concentración de 5.5 x 10⁶ y 3.6 x 10⁶ conidios/ml^-1, respectivamente. En nuestro estudio la mortalidad obtenida fue con una dosis de 2 x 10⁷ conidios/ml^-1 y la mortalidad se obtuvo a los ocho días, por lo que nuestras cepas pueden ser consideradas para el control de G. mellonella en México. Sin embargo, la abeja debe ser considerada como organismo no blanco; por lo que, la dosis utilizada en la presente investigación debe ser evaluada sobre abejas.

De acuerdo con lo anterior, dos características claves de un bioinsecticida son deseables: alta virulencia contra la plaga y poca o nula virulencia contra organismos no objetivo⁽⁷⁾. Esto es particularmente importante en el caso del control de G. mellonella, ya que cualquier patógeno que perjudica a la colonia de abejas de miel no sería aceptable, independientemente de su virulencia contra G. mellonella. Al respecto, Neupane⁽³⁰⁾ evaluó cepas virulentas de M. anisopliae sobre adultos de abejas (A. mellifera) a una concentración de 1x10⁷ conidios/ml^-1, con resultados positivos al no encontrar efecto significativo sobre la mortalidad de las abejas, por lo tanto, su aplicación para controlar G. mellonella en colmenas infectadas puede ser practicada sin riesgos de afectar la colonia de abejas. Además, M. anisopliae presenta bajo riesgo para humanos y otros mamíferos⁽⁷⁾.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

Los resultados indican amplia variabilidad intra-específica de cultivos monospóricos de M. anisopliae en cuanto a su patogenicidad hacia larvas de G. mellonella; demuestran la utilidad de cultivos monospóricos y su caracterización patogénica para la selección de aislamientos con características sobresalientes; con potencial para el desarrollo de bioinsecticidas contra la palomilla de la cera G. mellonella. Hasta ahora, los resultados son alentadores; sin embargo, es necesario realizar estudios sobre ecología de M. anisopliae en las condiciones de Tabasco, multiplicación masiva de los aislamientos promisorios, técnicas y tiempo de aplicación en relación con el ciclo de vida de la abeja.

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