Variabilidad genética de aislamientos de Salmonella typhimurium (grupo B) obtenidos de hígados de pollo destinados para consumo humano

Genetic diversity of Salmonella typhimurium (Group B) isolates from chicken livers intended for human consumption

Martín Talavera Rojas^a, Nydia Edith Reyes Rodríguez^a, Salvador Lagunas Bernabé^a, Pomposo Fernández Rosas^a, Vladimir Morales Erasto^a, Edgardo Soriano Vargas E.^a

^a Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México, Toluca, México. Carretera Panamericana Toluca-Atlacomulco km 15.5, Toluca, México. 50200. Teléfono/Fax: 722 2965555. mtr0035@yahoo.com.mx. Correspondencia al primer autor.

Recibido el 26 de noviembre de 2010.
Aceptado el 11 de marzo de 2011.

RESUMEN

Se determinó la frecuencia de aislamientos de Salmonella spp en hígados de pollo para venta, en cuatro mercados del área metropolitana de la ciudad de Toluca, México. El aislamiento bacteriológico se realizó de acuerdo a la norma NOM-114-SSA1-1994 para la determinación de Salmonella en alimentos. Se realizó la prueba de ERIC-PCR para determinar la variedad genética de las cepas de Salmonella aisladas. De un total de 520 muestras incluidas en el estudio, 7 (1.34 %) resultaron positivas a Salmonella serogrupo B (typhimurim). En el ERIC-PCR se observaron cuatro perfiles, encontrando similitud entre cepas de diferentes mercados, lo cual podría indicar que el manejo que se les da a las canales y vísceras es de suma importancia, además que la presencia en hígados de pollo para consumo humano debe ser considerado como una fuente importante de infección, ya que cualquier serovariedad de esta bacteria representa un potencial de infección para el humano.

Palabras clave: Hígados de pollo. Salmonella, Variabilidad-genética.

ABSTRACT

Frequency of Salmonella spp in chicken livers for sale, in four markets of the metropolitan area of Toluca, Mexico, was determined. The bacteriological isolation was carried out according to the Norma Oficial Mexicana-114-SSA1-1994 for Salmonella assessment in food. The ERIC-PCR test was carried out to determine genetic diversity of isolated Salmonella strains. Out of 520 samples included in the study, seven (1.34 %) were positive to Salmonella serotype B (typhimurium). Four profiles were observed in ERIC-PCR, finding similarity among strains from different markets, which may indicate that management of carcasses and viscera is of great importance, also that presence of chicken liver for human consumption must be considered as an important source of infection, since any serotype of this bacterium represents a potential infection for humans.

INTRODUCCIÓN

Desde la década de los ochentas, la incidencia de salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en el mundo industrializado y ha alcanzado proporciones epidémicas en varios países^(1,2,3). En México se han encontrado porcentajes elevados de contaminación en la carne de pollo y cerdo (21.3 a 36.4 %)⁽⁴⁾. En Estados Unidos durante el 2007 se presentaron 65 casos de S. montevideo asociados a la exposición de pollos vivos y tiendas de alimento⁽⁵⁾. Este incremento es el resultado de una combinación de factores relacionados con el desarrollo en la industrialización en todas las fases de producción de alimentos, cambios en la práctica del manejo de los alimentos, así como el almacenamiento, distribución y preparación de los mismos^(4,6).

La salmonelosis es una infección de importancia en salud animal y en salud pública, debido al impacto socioeconómico que ocasiona tanto en los países en desarrollo como en países que no han alcanzado las condiciones de saneamiento e higiene adecuados⁽²⁾. Al hablar de Salmonella como posible riesgo de infección por el consumo de productos de origen animal, se debe hacer referencia única y exclusivamente a S. typhimurium y S. enteritidid^(1,5-11), las cuales causan la mayoría de los brotes que afectan a personas, y constituyen uno de los principales problemas en muchos países. En humanos afecta a todos los grupos de edades, con mayor frecuencia en personas menores de cinco y mayores de 60 años^(2,7).

En los países industrializados se han establecido sistemas de vigilancia, que les permite conocer con relativa certeza la incidencia de las infecciones por Salmonella y otros patógenos causales de diarrea, así como el impacto de cada una de éstas en la morbilidad y mortalidad de la población^(12,13). En México no se cuenta con estadísticas nacionales de infecciones por Salmonella a causa de la falta de un sistema de vigilancia, lo que se impide se puedan identificar las principales serovariedades en las diferentes clases de alimentos, así como el riesgo que existe para la salud de los seres humanos. Esta información es indispensable para establecer las intervenciones necesarias para disminuir la morbilidad y mortalidad por las infecciones causadas por Salmonella⁽¹⁴⁾. En el valle de Toluca en un estudio transversal realizado en mataderos de aves, se observó una frecuencia de aislamiento de 3.5 % (3/85) obtenidas a partir de piel (1/85) y ciegos (2/85)⁽¹⁵⁾ y en rastros municipales de cerdos de 26.9 %⁽⁶⁾.

En los últimos años se han desarrollo nuevas técnicas moleculares de tipificación basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ERIC-PCR (amplificación de secuencias intergénicas de consenso repetitivas de enterobacterias), es una técnica de tipificación utilizada para estudiar la relación clonal en diversas bacterias gram negativas. Esta técnica está basada en la existencia de un elemento de ADN intergénico repetido a lo largo del genoma de muchas bacterias. Las secuencias de ERIC son de 126 pb de largo y parecen estar restrictas a regiones del genoma bacteriano, en regiones intergénicas de operones policistrónicos. Una secuencia consenso de estos elementos repetitivos fue usada para diseñar primers que han sido utilizados en muchas especies bacterianas desde entonces. Estos primers se usan para amplificar por PCR, fragmentos del genoma entre cada elemento repetitivo, generando un patrón diferente para cada cepa. Las diferentes bandas obtenidas son separadas por electroforesis en agarosa y visualizadas bajo luz ultravioleta después de realizar la tinción del ADN⁽¹⁶⁾. El objetivo de este estudio fue conocer la diversidad genética de Salmonella spp en aislamientos obtenidos en hígados de pollo destinados al consumo humano, expedidos en los mercados públicos de la ciudad de Toluca, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

El tamaño de muestras se obtuvo utilizando la fórmula para poblaciones infinitas (n = Z_α²*p*q/d²); donde: Z_α² = 1.96² (nivel de confianza de 95%), p = proporción esperada (3.5 % = 0.035)⁽¹²⁾, q = 1 - p (1-0.035 = 0.965) y d² = (0.05)²⁽¹⁷⁾. Una vez que se determinó el tamaño total de la muestra (520), se ponderaron de forma proporcional al número de locales establecidos en los cuatro mercados de la ciudad: el mercado J= 18 locales, S= 20 locales, M = 8 locales y H= 6 locales, de los cuales se obtuvieron 10 muestras de hígado de pollo por local.

El aislamiento bacteriológico e identificación bioquímica se realizaron de acuerdo a la Norma oficial Mexicana-114-SSA1-1994⁽¹⁸⁾. Los aislamientos de Salmonella fueron sembrados en placas de agar base sangre (BAB) incubados a 37 °C durante 18 a 24 h. Se preparó una suspensión densa de crecimiento en la placa de BBA en 0.5 ml de solución salina. La concentración del antígeno fue aproximadamente igual a la turbidez del tubo 3 del nefelómetro de Mac Farland; y se probaron con los cinco antisueros (sero- grupos B, C1, C2, D y E) más frecuentemente encontrados en México⁽⁶⁾.

La extracción de ADN se realizó utilizando un Kit comercial Genomic DNA Purification, el cual a partir de 2x10⁹ UFC, se obtuvo un rendimiento de 30 ng en 100 μl (MBI Fermentas Inc.).

Para la prueba ERIC-PCR, los iniciadores utilizados fueron ERIC-1R (5' -ATGTAAGCTCCTGGGGATT CAC- 3') y ERIC-2 (5'-AAGTAAGTGACTGGG GTGAGCG-3')⁽¹⁹⁾. La reacción final fue 50 μl el cual contenía 10 mM de Tris-HCl (pH 8.4), 50 μM de KCl, 3 mM de MgCl₂, 0.2 mM de Dntp (c/u), 0.5 U de Taq ADN polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA), y 5 ng de ADN. Los ciclos de amplificación usados fueron: una desnaturalización inicial 94 °C por 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización (1 min a 94 °C), hibridación (1 min a 52 °C), extensión (6 min a 7 4 °C) y extensión final a 74 °C durante 6 min⁽¹⁶⁾ (Termociclador de gradientes serie TC-5000). Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1%, se utilizó un marcador de peso molecular de 100-2072 pb (invitrogen), las condiciones de la electroforesis fueron 80 V durante 1 h en Tris-Borato-EDTA con bromuro de etidio (0.5 μg/ml), se visualizó y capturó la imagen con un foto-documentador (UV Transilluminator UVP Mod. M-20E y Kodak digital-science Electrophoresis documentation and analysis system 120).

Los resultados fueron evaluados por medio de la prueba de Ji cuadrada⁽¹⁷⁾. Para el análisis de patrones de bandas se elaboró un registro de patrones de bandeo, y a cada banda se le asignó en una matriz binaria como ausente "0" o presente "1". Para conocer las relaciones genéticas y la agrupación de los aislamientos se hizo un dendograma usando el programa POPGENE (ver. 1.32; Molecular Biology and Biotecnology Centre, University of Alberta and Center for international Forestry Research, AB, Edmonton, Canada)^(20,21), usando el método UPGMA (Modificado del procedimiento NEIGHBOR de la versión 3.5 de PHYLIP)⁽¹⁸⁾, basado en la matriz de distancias genéticas de Nei⁽²²⁾.

RESULTADOS

De un total de 520 muestras (hígado de pollo), se obtuvieron 7 (1.34 %) aislamientos de Salmonella serogrupo B (typhimurim). El porcentaje de aislamiento para cada Mercado fue: J= 0.56, S= 0.5, M= 2.5 y H= 5.0 % (P>0.05; Cuadro 1). En el ERIC-PCR, se identificaron cuatro patrones de banda: el primer patrón es del mercado M-A y S-A con un 86 % de similitud, el segundo patrón es H-B y H-C con el 100 % de similitud, el tercer patrón es M-B y H-A el cual tiene el 100 % de similitud, y el ultimo patrón es J-A (Cuadro 2, Figura 1), y se muestra en el dendograma de las cepas de Salmonella typhimurium aisladas (Figura 2).

DISCUSIÓN

La salmonelosis es una enfermedad fundamentalmente de origen alimentario, donde la fuente más frecuente de infección son los alimentos contaminados. A pesar de todos los controles que se han puesto en práctica, las infecciones por Salmonella debidas al consumo de alimentos contaminados continúa siendo un problema serio, con millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes pérdidas económicas junto con otro tipo de bacterias patógenas como Campylobacter, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Klebsiella.

Durante las operaciones de sacrificio se producen fenómenos de inter-contaminación, lo que provoca una proliferación de patógenos en las canales inicialmente sanas. Así, la carne y visceras de pollo son las responsables de numerosas intoxicaciones alimentarias en México^(2,6). La contaminación inicial de la piel es de especial importancia, pues se propaga de la piel a la carne durante el despiece y las transformaciones sucesivas del producto, por lo que la vigilancia de Salmonella en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los alimentos constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementación de estrategias eficientes de control de la misma, ya que es una zoonosis de distribución mundial⁽¹⁴⁾. Epidemiológicamente, las infecciones por Salmonella en México pueden causar pequeños brotes en la población en general, sin embargo el 60 al 80 % de los casos son esporádicos⁽²⁾.

La frecuencia obtenida (1.54 %) en este trabajo se encuentra por debajo de lo reportado por Zepeda⁽¹⁴⁾, quien encontró una prevalencia de 3.5 % en la misma zona de muestreo pero realizado en rastro. Otros países reportan 4.7 % en Zambia⁽²³⁾, España 11.3 %⁽²⁴⁾, Colombia 16.2 %⁽²⁴⁾, F rancia 16.7 %⁽²⁴⁾, Brasil 20 %⁽³⁾, Dinamarca 23 %⁽²⁴⁾, Etiopía 23.6 %⁽²⁶⁾, Venezuela 32.5 %⁽²⁷⁾, Estados Unidos 38 % ⁽⁹⁾, Japón 94.1 %⁽²⁸⁾. En la ciudad de Toluca sólo se ha realizado un estudio y el serovar encontrado fue typhimurium, aunque en estudios anteriormente realizados en México los serotipos con mayor frecuencia corresponden a Salmonella enteritidis y Salmonella derby⁽¹⁴⁾. En otros países se ha observado Salmonella typhimurium en Brasil y Venezuela^(3,27), Salmonella enteritidis en Japón y Zambia^(23,28), Salmonella heidelberg en Estados Unidos⁽⁹⁾, Salmonella spp en Camerún, España, Dinamarca y Francia⁽²⁴⁾, Salmonella anatum en Colombia⁽²⁵⁾, y Salmonella saintpaul en Etiopia⁽²⁶⁾. Sin embargo se debe de considerar que el tipo de muestreo que se realizó en el presente estudio fue con una duración de tres meses, realizándose el muestreo por mercado; los otros estudios realizados como en Zambia el periodo de observación no se reporta⁽²⁰⁾, en Colombia y Brasil se realizó durante un año^(3,6), en Etiopia en el periodo 1997-2002⁽²⁶⁾, en Venezuela se realizaron en toda una década⁽²⁷⁾, en Estados Unidos tuvieron una duración de dos años⁽⁹⁾, en Japón de tres años⁽²⁸⁾, y Dinamarca, España y Francia de recopilaciones de informes de la OMS durante 1995⁽²⁴⁾. Esto es importante señalarlo, ya que como se puede observar, la duración del muestreo y el tamaño de la muestra van en relación directa con el porcentaje de positividad, ya que entre más tiempo pasa, se puede obtener un mayor número de cepas.

Otro factor predisponente es el manejo desde la matanza hasta la venta al consumidor. La frecuencia de Salmonella typhimurium para cada mercado fue diferente debido al número de locales muestreados, pero se puede observar que uno de los mercados con menor número de locales tiene un porcentaje mayor de positividad, como es el mercado H. En los resultados obtenidos por medio de ERIC-PCR nos indica la similitud entre asilamientos del mercado M como el mercado H y S, lo que podría sugerir que posiblemente el distribuidor de los mercados sea el mismo, ya que la toma de muestras para cada mercado se realizó en periodos distintos; al contrario del Mercado J que se encontró en un perfil diferente, pero cada una de las cepas se encuentran con cierto porcentaje de similitud y distancias genéticas cercanas; esto nos indica que la procedencia y el manejo de las canales tiene mucha importancia.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

El número de aislamientos resultó ser bajo, pero estos resultados deben de ser tomados en cuenta desde el punto de vista epidemiológico, ya que la presencia de cualquier serovar de Salmonella representa un riesgo potencial como fuente de infección al humano; además de que es de los pocos estudios que se han realizado directamente de expendios de pollos de abasto en mercados.

LITERATURA CITADA

1. González FT, Rojas HRA. Enfermedades transmitidas por alimentos y PCR: prevención y diagnóstico. Salud Publica Méx 2005;(47):388-390.         [ Links ]

2. Gutiérrez-Cogco L, Montiel-Vázquez E, Aguilera-Pérez P, González-Andrade MC. Serotipos de Salmonella identificados en los servicios de salud de México. Salud Pública Méx 2000;(42):490-495.         [ Links ]

3. Silva EN, Duarte A. Salmonella enteritidis em aves: retrospectiva do Brasil. Rev Bras Cienc Avic 2002;(4):85-100.         [ Links ]

4. Zaidi MB, Calva JJ, Estrada-García MT, León V, Vázquez G, Figueroa G, López E, et al. Integrated food chain surveillance system for Salmonella spp in Mexico. Emerging Infec Dis 2008;(14):429-435.         [ Links ]

5. Davies R, Breslin M, Corry JE, Hudson W, Allen VM. Observations on the distribution and control of Salmonella species in two integrated broiler companies. Vet Ree 2001;(149):227-232.         [ Links ]

6. Talavera RM, Vázquez CJC, Flores BR, Robles GF, Lagunas BS, Alonso FMU. GyrA gene mutations and fluoroquinolone resistance in Salmonella isolates from pigs in central Mexico. Vet Rec 2007;(160):630-632.         [ Links ]

7. Barrow AP. Salmonella control past, present and future. Avian Pathol 1993;(22):651-669.         [ Links ]

8. Betancor L, Schelotto F, Martinez A, Pereira M, Algorta G, Rodríguez MA, Vignoli R, Chabalgoity JA. Random amplified polymorphic DNA and phenotyping analysis of Salmonella enterica serovar enteritidis isolates collected from humans and poultry in Uruguay from 1995 to 2002. J Clin Microbiol 2004;(42):1155-1162.         [ Links ]

9. Byrd JA, DeLoach JR, Corrier DE, Nisbet DJ, Stanker LH. Evaluation of Salmonella serotype distributions from commercial broiler hatcheries and grower houses. Avian Dis 1999;(43):39-47.         [ Links ]

10. Castellan DM, Kinde H, Kass PH, Cutler G, Breitmeyer RE , B ell DD, E rnst RA, et al . Descriptive study of California egg layer premises and analysis of risk factors for Salmonella enterica serotype enteritidis as characterized by manure drag swabs. Avian Dis 2004;(48):550-561.         [ Links ]

11. Gast KR, Guard-Bouldin J, H olt SP. Colonization of reproductive organs and internal contamination of eggs after experimental infection of laying hens with Salmonella heidelberg and Salmonella enteritidis. Avian Dis 2004;(48):863-969.         [ Links ]

12. De Jong BK, Ekdahl. The comparative burden of salmonellosis in the European Union member states, associatedand candidate countries. BMC Public Health 2006;10:6:4.         [ Links ]

13. Mead PS, Slustsker L, Dietz V, McCaig LF, Bresee JS, Shapiro C, Griffin PM, Tauxe RV. Food-related illness and death in the United States. Emerg Infect Dis 1999;(5):607-625.         [ Links ]

14. Zepeda EVL. Estudios mexicanos sobre Salmonella: epidemiología, vacunas y biología molecular. Rev Lat Microbiol 2006;48:2:121-125.         [ Links ]

15. Frecuencia de aislamiento de Salmonella spp durante el proceso de matanza del pollo de engorda en mataderos de la ciudad de Toluca, Estado de México. [tesis licenciatura]. Toluca, México, Universidad Autónoma del Estado de México; 1994.         [ Links ]

16. Soriano VE, Téllez G, Hargis M, Newberry L, Salgado-Miranda C, Vázquez C. Typing of Haemophilus paragallinarum Strains by Using Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Based Polimerase Chain Reaction. 2004;(48):890-895.         [ Links ]

17. Wayne WD. Bioestadística. Base para el análisis de las ciencias de la salud. 4^a ed. México: Ed. Limusa; 2006.         [ Links ]

18. NOM (Norma Oficial Mexicana)-114-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de Salmonella en alimentos.         [ Links ]

19. Versalovic J, Koeuth T, Lupski JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res 1991;(19):6823-6831.         [ Links ]

20. Felsenstein J. Phylip Manual, version 3.3. University Herbarium, University of California, Berkley, CA, USA. 1990.         [ Links ]

21. Yeh FC, Boyle TJB. Population genetics analysis of codominant and dominant markers and quantitative traits. Belgium J Bot 1999;(129):157.         [ Links ]

22. Nei M. Genetic distance between populations. Am Naturalist 1972;(106):282-283.         [ Links ]

23. Hang'ombe BM, Sharma RN, Skjerve E, Tuchili LM. Occurrence of Salmonella enteritidis in pooled table eggs and market-ready chicken carcasses in Zambia. Avian Dis 1999;(43):597-599.         [ Links ]

24. Uribe C, Suárez MC. Salmonelosis no tifoidea y su transmisión a través de alimentos de origen aviar. Colomb Med 2006;(37):1-9.         [ Links ]

25. Espinal MP, Prieto SD, Otero JV, Máttar VS. Presencia del gen de invasividad IN V A en cepas de Salmonella spp. aisladas de alimentos del caribe colombiano. Rev Cubana Salud Pública 2006;(32):1-6.         [ Links ]

26. Molla B, Alemayehu D, Salah W. Sources and distribution of Salmonella serotypes isolated from food animals, slaughterhouse personnel and retail meat products in Ethiopia: 1997-2002. Ethiop J Health Dev 2003;(17):63-70.         [ Links ]

27. Infante DM, Noguera C, León JA, Herrera JA, Valdillo P. Aislamiento de Salmonellas en aves y pollos beneficiados. C.N.I.A.P. 1991;(37):1-5.         [ Links ]

28. Matsumoto A, Miyama M, Murakami S. Comparison of Salmonella isolation rates in different types of egg-layer hen houses in Chiba, Japan. Avian Dis 2001;(45):195-200.         [ Links ]

29. Wei G, Pan L, Du H, Chen J, Zhao L. ERIC-PCR fingerprinting-based community DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragments as molecular markers to identify and track populations common to healthy human guts. J Microbiol Methods 2004;59:91-108.         [ Links ]