La elongación de brotes adventicios de frambuesa (Rubus ideaus L.) es influenciada por brasinosteroides*
Adventitious shoot elongation of raspberry (Rubus idaeus L.) is influenced by brassinosteroids
Emmanuel Robres-Torres1, José López-Medina1 y Ma. del Carmen Rocha-Granados1§
1 Facultad de Agrobiología "Presidente Juárez" Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Av. Lázaro Cárdenas Esq. Berlín S/N. Uruapan, Michoacán. C. P. 60190. Tel: 014525236474. (chelín_12@hotmail.com; joselopezmedina@gmail.com). §Autora para correspondencia: crochagra@hotmail.com.
]]>* Recibido: diciembre de 2014
Aceptado: abril de 2015
Resumen
La técnica de cultivo in vitro fue utilizada para estudiar el efecto de la combinación de benciladenina (BA) y brasinolido (BL), dos reguladores de crecimiento vegetal, en la formación y elongación de brotes adventicios de frambuesa (Rubus idaeus L.). También se evaluó el enraizamiento de los brotes regenerados tanto en condiciones in vitro como ex vitro. Tres selecciones de frambuesa, UMC-702, UMC-706 y UMC-708, generadas de un programa de mejoramiento genético en la Facultad de Agrobiología, fueron seleccionadas para llevar a cabo esta investigación. En la fase de multiplicación, el medio MS fue suplementado con diferentes combinaciones de bencialadenina (0 y 1.5 mg L-1) y brasinolido (0, 0.00001 y 0.00002 μM). La formación de brotes adventicios no fue dependiente de la combinación de los reguladores; sin embargo, la elongación de los mismos fue significativamente influenciada por el genotipo y el uso de brasinolido (BL); los mejores resultados se obtuvieron con la selección UMC-706 expuesta a 0.00002 μM de BL. El enraizamiento de los brotes adventicios fue mejor en condiciones ex vitro que in vitro, con mayor formación y elongación tanto de raíz como de los brotes; ello permitió una mejor aclimatación y adaptación de las plantas, lo que significa un ahorro tanto en tiempo como en costos de labor para la micropropagación de frambuesa. Así, este es el primer reporte del uso de brasinosteroides en frambuesa.
Palabras claves: Rubus, brasinolido, brotes adventicios, elongación de brotes.
Abstract
In vitro culture techniques have been used to study the effect of the combination of benzyladenine (BA) and brassinolide (BL), two plant growth regulators, in the formation and adventitious shoot elongation of raspberry (Rubus idaeus L.). Rooting of regenerated shoots both in vitro and ex vitro conditions were evaluated. Three selections of raspberry, UMC-702 UMC-706 and UMC-708, generated from a breeding program at the Faculty ofAgrobiology, were selected to conduct this research. In the multiplication phase, the MS medium was supplemented with different combinations of benzyladenine (0 and 1.5 mg L-1) and brassinolide (0, 0.00001 and 0.00002 μM). Adventitious shoot formation was not dependent on the combination of regulators; however, the elongation of it was significantly influenced by genotype and use of brassinolide (BL); the best results were obtained with UMC-706 exposed to 0.00002 μM of BL. Rooting of adventitious shoots were better in ex vitro than in vitro conditions, with higher formation and elongation both root and shoots; allowing a better acclimatization and adaptation of plants, which means savings in time and labor for micro propagation of raspberry. So, this is the first report on the use of brassinosteroids in raspberry.
]]> Keywords: Rubus, adventitious shoots, brassinolide, shoot elongation.
Introducción
La propagación de frambuesa se realiza tradicionalmente de forma vegetativa, ya sea por separación de coronas o por brotes etiolados; sin embargo, en vista de la demanda masiva de material sano y vigoroso, se ha generado un gran interés por el uso de técnicas biotecnológicas como la de cultivo de tejidos vegetales. A este respecto, se han probado técnicas como la organogénesis directa e indirecta utilizando hojas de diferentes variedades comerciales (Isac, 2009) y la criopreservación de brotes apicales (Wang et al, 2005; Gupta y Reed, 2006). Algunos sistemas para la micropropagación de frambuesa han utilizado el medio de cultivo MS (Muashige y Skoog, 1692) semisólido y líquido en inmersión temporal complementado con bencil amino purina (BAP), ácido giberélico (AG3) y ácido ascórbico (Jones y Flores, 2007); también se reporta el uso de N6-benciladenina, tidiazuron y zeatina (Reed, 1991; Popescue Isac, 1999; González et al., 2000; Vujovic et al, 2009).
Además de los cinco grupos establecidos de fitohormonas, hay otras clases de compuestos de los cuales se sabe que regulan el crecimiento y desarrollo de las plantas; entre ellos se encuentran los brassinoesteroides (BRs), hormonas de tipo esteroidal (Mandava, 1988; Creelman y Mullet, 1997). Las primeras investigaciones sobre BRs se iniciaron a partir del aislamiento de la brassinolide (BL), cuando se observó que algunos extractos orgánicos presentes en el polen de Brassica napus promovían la elongación y división celular en los tallos de las plantas (Mitchell et al, 1970; Grove et al, 1979). El hecho de que cierto componente activador de estos extractos resultó ser un esteroide impulsó investigaciones internacionales sobre la química y fisiología de estos potentes reguladores del crecimiento (Rao et al, 2002).
El crecimiento inducido por BRs se debe principalmente a la división y elongación celular; así, la 24-epibrasinolide aumenta la división de células parenquimatosas de Helianthus tuberosus (Clouse y Zurek, 1991), mientras que el tratamiento de protoplastos de repollo dio como resultado la activación de la división celular (Choi et al, 1997). Se ha observado que la adición de la brasinolide, o sus homólogos 24-epi-brasinolide y 28-homobrasinolide, así como los efectos sinergéticos de éstos con auxinas y giberelinas, tienen una respuesta positiva sobre la proliferación in vitro de callos de Spartina patens (Lu et al., 2003), la elongación de tallos de Capsicun annuum (Franck-Duchenne et al., 1998), así como en la proliferación y elongación de brotes de Musa spp. (Hassan-Nassar, 2004) y la proliferación de embriones somáticos en coníferas y arroz (Pullman et al., 2003).
Los BRs son componentes obligatorios de las plantas en tejidos de crecimiento y la respuesta a estos puede ser especialmente importante para que las plantas completen con éxito su ciclo de vida (Haubrick, 2006); interactúan con las auxinas para promover el desarrollo de raíces (Bao et al., 2004). Dado que los BRs son un nuevo tipo de reguladores de crecimiento con múltiples actividades sobre las plantas, y que han sido poco utilizados en el cultivo de tejidos vegetales, el objetivo principal de esta investigación fue determinar el efecto del brasinolido, el brasinosteroide más activo, sobre la formación y elongación de brotes adventicios cultivados in vitro de tres selecciones avanzadas de frambuesa generadas mediante mejoramiento convencional.
Materiales y métodos
Material vegetativo
]]> En la presente investigación se utilizaron yemas axilares de tres selecciones avanzadas de frambuesa (Rubus idaeus L.). Las plantas se encontraban en el Rancho de la Facultad de Agrobiología "Presidente Juárez" de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, localizado en la comunidad de Santa Rosa, Municipio de Uruapan, Michoacán. Al momento de la colecta el material vegetativo fue asperjado con Manzate (1 g L-1), colocado sobre papel de estraza y puesto dentro de un embase de unicél térmico. Los materiales seleccionados presentaban las siguientes características: UMC-702: plantas caracterizadas por poseer tallos sin espinas con fruto de color rojo; UMC-706: plantas con pubescencia en el tallo y frutos de color amarillo y UMC-708: plantas con tallo pubescentes y frutos de color naranja.
Establecimiento in vitro
Se eligieron yemas apicales y laterales de las tres selecciones de frambuesa mencionados, de las cuales se cortaron 90 brotes de tamaño uniforme con tijeras de podar, entre los 9 y 12 cm de longitud. En el laboratorio de Fisiología Vegetal de la Facultad de Agrobiología, los brotes fueron lavados con jabón de polvo, y seccionados de 1.5 a 2 cm de longitud para posteriormente ser tratados con Manzate 200 (Dupont) 1 g L-1 de agua por 30 min en movimiento. En campana de flujo laminar, los explantes fueron colocados en una solución de hipoclorito de sodio al 15% (v/v) durante 25 min., seguido de tres enjuagues con agua destilada estéril. Para su establecimiento in vitro cada explante fue colocado en un tubo de ensaye (20 mL) que contenía 10 mL del medios MS suplementado con vitaminas de Anderson (Anderson, 1976) y 1 mg L-1 de benciladenine (BA). Una vez sembrados los explantes, éstos se colocaron en un cuarto de crecimiento a temperatura de 24°C±1 y un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad.
Efecto del brasinolide
Para determinar el efecto de los brasinosteroides sobre el formación y elongación de yemas laterales de frambuesa, 5 yemas de cada una de las tres selecciones fueron colocadas en medio MS suplementado solamente con (0.00001 y 0.00002 (μM) brasinolide 90% (Suntton Chemical Company, USA), o mezclado éste con 1.5 mg L-1 de benciladenina; se incluyó un tratamiento solamente con BA y un testigo sin fitorreguladores. Las variables evaluadas en esta fase fueron: número de brotes por explante y longitud de brotes.
Para determinar las concentraciones y combinaciones de los reguladores utilizados en este trabajo nos basamos en el hecho de que la mayoría de los reportes mencionan que la mejor dosis de BA es de 1 a 2 mg L-1, por lo cual se eligió una dosis intermedia de 1.5 mg L-1. Para el caso de BL 90%, solo se seleccionaron dosis bajas (0.0001 y 0.00002 μM) debido a que se observó, en experimentos anteriores, que a mayores concentraciones de este fitorregulador las plántulas presentaron una mayor elongación y vetrificación, lo que dificultaba su adaptación y subsecuente sobrevivencia.
Enraizamiento in vitro y ex vitro
]]> Para el enraizamiento in vitro se utilizó el método reportado por Avitia-García (1984), donde se utilizaron sales MS al 50% de su concentración y la adición de 15 a 20 g L-1 de sacarosa al medio de cultivo, sin la utilización de reguladores de crecimiento. Para el enraizamiento ex vitro se utilizó la técnica reportada por Acurero-Matus (2007), con adición del enraizador comercial "Radix 1 500" (ácido indol-3-butírico, 1 500 ppm). De cada selección de frambuesa se extrajeron 90 explantes y a éstos se les retiró el medio de cultivo, se impregnaron del enraizador y se colocaron en charolas con turba canadiense ("peat-moss") previamente desinfectada en autoclave a una temperatura de 121°C durante 15 min. Para este caso las variables evaluadas fueron número raíces y longitud de plantas.
Diseño experimental
Para evaluar el número y longitud de brotes se utilizó un diseño experimental completamente al azar con seis tratamientos repetidos cinco veces, cada unidad experimental estuvo representada por cinco plantas. En la etapa de enraizamiento tanto ex vitro e in vitro se utilizaron solamente dos tratamientos, cada uno representado por 30 unidades experimentales y repetido tres veces. El análisis de varianza y prueba de comparación de medias (Tukey, p ≤ 0.05) de la información se realizó con ayuda del paquete estadístico Java Memory Profiler (JMP, versión 7, 2008).
Resultados y discusión
Formación de brotes
En relación a la formación de brotes, se observó que la adición de brasinolide (BL) en combinación con benciladenina (BA) resultó más efectiva que con solo la adición de BL (Figura 1). Aunque el análisis de varianza no mostró diferencia significativa entre las selecciones, sí se encontró una gran diferencia entre tratamientos, donde los valores más altos correspondieron a aquellos que solo contenían BA o la combinación de ésta con cualquiera de las dosis de BL; y aunque menos eficientes, los tratamientos que solo contenían BL mostraron mayor número de brotes que el testigo (Figura 2).
La cantidad de brotes de frambuesa producidos in vitro depende en gran medida de la concentración de las citocininas, específicamente la benciladenina, y del cultivar propagado (Avitia y Rodríguez, 1984; McNicol and Graham, 1990). Se ha observado que varios cultivares de frambuesa responden a concentraciones que van desde 0.5 hasta 2 mg L-1 de BA en combinación con AIB o ANA, o solo zeatina (Graham et al, 1997; Palonem y Buszard, 1998; Debnath, 2004; Zawadzkay Orlikowska, 2006; Wu et al, 2009), o bien de 1 a 2 mg L-1 de tidiazuron con 0.5-1 mg L-1 de ácido 1H-indole-3-butanoico (AIB) (Swartz et al., 1990; Cousineau y Donnelly, 1991).
En esas investigaciones se reportó un número máximo de 3.8 brotes por explante, lo cual difiere de lo obtenido en el presente trabajo, donde se obtuvieron hasta 4.8 brotes por explante; y aunque la adición de brasinolido no tuvo un efecto significativo en la proliferación de brotes, se observó que la mejor respuesta se obtuvo a una concentración de 1.5 mg L-1 de BA sola o en combinación con cualquiera de la dosis de brasinolido (Figura 2).
En algunos trabajos se ha observado que el homobrasinolido, un análogo de brasinolido, en combinación con AIA o 2iP, tienen un pronunciado efecto en la estimulación de brotes de meristemos apicales de banana (Hassan-Nassar, 2004). En este mismo sentido, la adición de brasinolido al medio de cultivo, en concentraciones de 0.005 mg L-1, contribuyeron en el crecimiento de los brotes regenerados de Spartina petens (Lu et al, 2003).
En los procesos de regeneración y propagación in vitro de un gran número de plantas se han utilizado las citocininas combinadas con las auxinas como reguladores de crecimiento, para la obtención de brotes laterales o adventicios de un sin número de plantas tanto herbáceas como leñosas (Gaspar et al., 1996), mientras que los brasinosteroides, que presentan una amplia distribución en el reino vegetal y muestran una inusual actividad promotora del crecimiento cuando son aplicados exógenamente, han sido poco utilizados en estos procesos, aun y cuando se ha demostrado su efecto sinergista con auxinas y citocininas (Bao et al, 2004).
Elongación de brotes
Respecto a la elongación de brotes generados en cada una de las selecciones, se encontró que la selección UMC-702 generó brotes de mayor longitud (1.2 cm), seguida por la selección UMC-708 (0.8 cm) y la UMC-706 (0.4 cm), con diferencias estadísticas significativas (Tukey, 0.05) solo entre esta última y UMC-702.
Enraizamiento y crecimiento de brotes
En cuanto al número de raíces a partir de los brotes generados in vitro, hubo una mayor eficiencia en condiciones ex vitro, con el mayor número de raíces y longitud de brotes logrados en la selección UMC 706 (Cuadro 1; Figura 4).
El enraizamiento de los brotes es una parte importante de cualquier esquema de propagación in vitro. Usualmente es necesario que los explantes sean puestos en un medio especial para formar raíces, incrementando así el tiempo y costo en estos procesos. Una manera de reducir el costo en la micropropagación puede ser removiendo los explantes sin raíz de las condiciones in vitro y enraizarlos en un sustrato especial ex vitro (George et al, 2008). En el presente trabajo fue evidente una mayor formación de raíces y elongación de brotes bajo condiciones ex vitro que in vitro.
La mayoría de las observaciones del enraizamieto in vitro de las frambuesas revelan que el medio MS, con la mitad de las sales minerales y suplementado con auxinas, es esencial para la potenciación de la rizogénesis (Isac, 2009). Sin embargo, nuestros resultados muestran que la mayor formación de raíces en las selecciones utilizadas se logró en condiciones ex vitro, mientras que en condiciones in vitro el enraizamiento fue menos eficiente, las plantas fueron más cortas, y con poca raíces que las cultivadas ex vitro.
Conclusiones
]]> Los brasinoesteroides son un nuevo tipo de reguladores de crecimiento que presentaron un efecto marcado sobre la elongación de los brotes adventicios de frambuesa crecidas in vitro, pero no sobre la inducción y formación de los mismos, pues los análisis estadísticos demostraron que cuando se pasaron a un medio con benciladenina no hubo un aumento significativo en el número de brotes.Así mismo, se observó que tanto la etapa de aclimatación como la de enraizamiento ex vitro son procesos que se pueden llevar a cabo al mismo tiempo, evitándose la fase de enraizamiento in vitro de las plántulas de frambuesa.
Literatura citada
Acurero, M.A. M. 2007. Optimización de un protocolo de cultivo in vitro de Aloe vera L. (Zábila). Ciencia. 15(3):319-330. [ Links ]
Anderson, J. O. 1976. Embryogenesis in wild carrot cells. In vitro 12:332. [ Links ]
Avitia, G. E. y Rodríguez, A. J. 1984. El cultivo de frambuesa roja. Centro de fruticultura, Colegio de Posgraduados, Montecillo, Estado de México. 33 p. [ Links ]
]]>Bao, F. ; Shen, J.; Brady, S. R.; Mudas, G. K.; Asami, T. and Yang, Z. 2004. Brassinosteroids interact with auxin to promote lateral root development in arabidopsis. Plant Physiol. 134(4):1624-1631. [ Links ]
Choi, Y. H.; Fujioka, S.; Nomura, T. ; Harada,A.; Yokota, T. ; Takatsuto, S. and Sakurai, A. 1997. An alternative brassinolide biosynthetic pathway via late C-6 oxidacion. Phytochemistry. 44:609-613. [ Links ]
Clouse, S. D. and Zurek, D.1991. Molecular analysis ofbrassinolide action in plant growth and development. In: Cluter, H. G.; Adam, G. and Yokota, T. (Eds.). Brassionosteriods: chemestry, bioactivity and applications (acs symposium series). American Chemical Society. Washington, D. C. 122-140 p. [ Links ]
Cousineau, C. J. and Donnelly, J. D. 1991. Adventitious shoot regeneration from leaf explants of tissue culture and greenhouse-grown raspberry. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 27:249-255. [ Links ]
Creelman, R. A. and Mullet, J. E. 1997.Oligosaccharins, brassinolides, and jasmonates: Nontraditional regulators of plant growth, development, and gene expression. Plant and Cell. 9:1211-1223. [ Links ]
]]>Debnath, S. C. 2004. Clonal propagation of dwarf raspberry (Rubus pebescens Raf.) trough in vitro axilarry shout proliferation. Plant Growth Regulation. 43:179-186. [ Links ]
Franck-Duchenne, M.; Wang, Y.; Ben, T. S. and Beachy, R. N. 1998. In vitro stem elongation of sweet pepper in media containing 24-epi-brassinolide. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 53:79-84. [ Links ]
Gaspar, T.; Kevers, C.; Penel, C.; Greppin, H.; David, M. R.; Thorpe, T. A. 1996. Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture. In vitro cell and developmental biology 32 (4):272-289. [ Links ]
George, F. E.; Hall, A. M. and De Klerk, G-J. 2008. Micropropagation: uses and methods. In: George. E. F. (Ed.). Plant propagation by tissue culture. 3th Edition, Springer, Dordrecht. 29-64 pp. [ Links ]
González, M. V.; López, M.; Valdes, A. E. and Ordas, R. J. 2000. Micropropagation of three berry fruit species using segments from field-grown plants. Ann. Appl. Biol. 137(1):73-78. [ Links ]
]]>Graham, J.; Iasi, L. and Millian, S. 1997. Genotyp-specific regeneration from a number of Rubus cultivars. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 48:167-173. [ Links ]
Gregory, L. E. and Mandava, N. B.1982. The activity and interaction of brassinolide and giberellic acid in mung bean epicotyls. Plant Physiol. 54:239-243. [ Links ]
Grove, M. D.; Spencer, G. F.; Rohwedder, W. K.; Mandava, N. B. and Worley, J. F. 1979. Brassinolide, a plant growth-promoting steroid isolated from Brassica napus pollen. Nature 281:216-17. [ Links ]
Gupta, S.; Reed, B. M. 2006. Cryopreservation ofshoot tips of blackberry and raspberry by encapsulation-dehydratation and vitrification. Cryo Letters. 27(1):29-42. [ Links ]
Hassan-Nassar, A. 2004. Effect of homobrassinolide on in vitro growth of apical meristems and heat tolerance of babana shoots. Int. J. Agric. Biol. 6(5):771-775. [ Links ]
]]>Haubrick, L. L. 2006. Brassinosteroids and plant function: some clues, more puzzles. Plant Cell and Environment. 29(3):446-447. [ Links ]
Isac, V. 2009. Procotol for in vitro micropropagation of raspberry, and plant regeneration by organogénesis. In: Mezzetti, B.; Ruzic, D. and Gajdosova, A. (Eds.). A guide to some in vitro techniques. Small fruits. European research: from genomics to sustainable production, quality and health. 14-23 pp. [ Links ]
Jones, C. F. y Flores, M. D. 2007. Establecimiento in vitro y pruebas preliminares de micropropagación en medio semisólido y líquido de frambuesa (Rubus idaeus L.). Tecnología en Marcha. 20(3):46-54. [ Links ]
Lu, Z.; Huang, M.; Ge, D-P.; Yang, Y-H.; Cai, X-N.; Qin, P. and She, J-M. 2003. Effect ofbrassinolide on callus growth and regeneration in Spantina patens (Poaceae). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 73:87-89. [ Links ]
Mandava, N. B. 1988. Plant growth-promoting brassinosteroids. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39:23-52. [ Links ]
]]>McNicol, R. J. and Graham, J. 1990. In vitro regeneration of Rubus from leaf and stem segments. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 21: 45-50. [ Links ]
Mitchell, J. W.; Mandava, N. B.; Worley, J. F.; Plimmer, J. R. and Smith, M. V. 1970. A unique plant growth promoting steroid fron Brassica napus pollen. Nature 225: 1065-1066. [ Links ]
Murashige, T. and Skoog, F. 1962.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant. 15:473-497. [ Links ]
Palonen, P. and Buszard, D. 1998. In vitro screening for cold hardiness of raspberry cultivars. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 53:213-216. [ Links ]
Popescu, A. N. and Isac, V. 1999.High frequency of shoot regeneration from leaf-derived callus in raspberry (Rubus idaeus L.). Acta Horticulturae. 538:667-672. [ Links ]
]]>Pullman, G. S.; Zhang, Y. and Phan, B. H. 2003. Brassinolide improves embryogenic tissue initiation in conifers and rice. Plant Cell Reports. 22:96-104. [ Links ]
Rao, S. S. R.; Vardhini, B. V.; Sujatha, E. andAnuradha, S. 2002. Brassinosteroids- A new class of phytohormones. Current Science. 82(10):1239-1243. [ Links ]
Reed, M. B. 1991. The use of zeatin to initiation in vitro cultures of Vaccinium species and cultivars. HortScience. 26(10):1320-1322. [ Links ]
Swartz, J. H.; Bors, R.; Mohamed, F. and Naess, S. K. 1990. The effect of in vitro pretreatments on subsequent shoot organogenesis from excised Rubus and Malus leaves. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 21:179-184. [ Links ]
Takatsuto, S. 1994. Brassinosteroids: distribution in plants, bioassays and microanalysis by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography. 658:3-15. [ Links ]
]]>Vujovic, T.; Ruzic, D. and Cerovic, R. 2009. Plant regeneration by organogénesis in blackberry. In: Mezzetti, B.; Ruzic, D. and Gajdosova, A. (eds.). A guide to some in vitro techniques. Small fruits. European research: from genomics to sustainable production, quality and health. 30-33 pp. [ Links ]
Wang, Q.; Laamanen, J.; Uosakainen, M. and Valkonen, J. P. T. 2005. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of raspberry (Rubus ideaus L.) by encapsulation-vetrificacion and encapsulation-dehydration. Plant Cell Reports. 24:280-288. [ Links ]
Wu, J-H.; Miller,A. S.and Hall, H. K. 2009.Factors affecting the efficiency ofmicropropagation from lateral buds and shoot tips of Rubus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 99:17-25. [ Links ]
Zawadzka, M. and Orlikowska, T. 2006. The influence of Fe EDDHA in red raspberry cultures during shoot multiplication and adventitious regeneration from leaf explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 85:145-149. [ Links ]
]]>