Totipotencialidad en plántulas de aguacate en la resistencia a Phytophthora cinnamomi*

Totipotency in avocado seedling resistance to Phytophthora cinnamomi

Petra Andrade-Hoyos^1§, Carlos De León¹, Eduardo Molina Gayosso², María de la Cruz Espíndola Barquera³, Dionicio Alvarado Rosales¹ y Alfredo López Jiménez¹

¹ Colegio de Postgraduados-Postgrado en Fitopatología. Carretera México-Texcoco, km 36.5, Montecillo, Texcoco, Estado de México. C. P. 56230. Tel. 01 738 724 11 71, Ext. 150 y 151, 595 95 20200, Ext. 1740, 1681 y 1116. (pandrade@upfim.edu.mx; cdeleon@colpos.mx; dionicio@colpos.mx; lopezja@colpos.mx).

³ Fundación Salvador Sánchez Colín-CICTAMEX S. C. Ignacio Zaragoza Núm. 6 Coatepec Harinas, Estado de México. C. P. 51700. Tel. 01 723 1450160. (mespindolab@gmail.com). §Autora para correspondencia: andrad@colpos.mx.

* Recibido: agosto de 2014
Aceptado: diciembre de 2014

Resumen

La identificación de plántulas resistentes de aguacate criollo raza Mexicana, responden de forma natural a la infección por el oomicete Phytophthora cinnamomi. Esta respuesta se debe a la variación genética basada en la supervivencia y en la capacidad totipotencial después de la inoculación con el oomicete. El objetivo del presente trabajo fue seleccionar plántulas resistentes para inducir totipotencialidad (formación de nuevos rebrotes) después de la inoculación. En la selección de plántulas de aguacate para resistencia se realizaron dos ensayos, en el primer ensayo se inocularon plántulas de seis genotipos de aguacate Atlixco, Tepeyanco, Tepetl, Toliman, Colín V-33 y Thomas (de 5 cm de altura y de 15 a 20 cm de altura) con un aislamiento virulento de P. cinnamomi, en el segundo ensayo se inocularon solamente plántulas de los genotipos Tepeyanco y Atlixco (de 5 cm de altura). La inoculación de plántulas en etapas avanzadas de crecimiento (de 15 a 20 cm de altura) y en etapa juvenil (5 cm de altura) permite detectar resistencia a P. cinnamomi. La población de plántulas Atlixco es fuente importante de resistencia debido a que tuvo mayor número de nuevos brotes de plántulas totipotenciales y plántulas asintomáticas. Los genotipos Toliman, Tepetl y Thomas en etapa juvenil son considerados susceptibles. Colín V-33 puede ser portainjerto resistente aP. cinnamomi. Atlixco y Tepeyanco son considerados resistentes-tolerantes al marchitamiento del aguacatero y al cancro producido por P. cinnamomi.

Palabras clave: Persea americana Mill, oomicete, regeneración de brotes, tristeza del aguacatero, cancro.

The identification of resistant seedlings from native Mexican avocado race, naturally respond to infection by oomycete Phytophthora cinnamomi. This response is due to genetic variation based on survival and totipotent capacity after inoculation with oomycete. The aim of this study was to select resistant seedlings to induce totipotency (formation of new shoots) after inoculation. Selecting for resistance avocado seedling, two trials were conducted, in the first trial six avocado seedling Atlixco, Tepeyanco, Tepetl, Toliman, Colin V-33 and Thomas genotypes (of 5 cm and 15 to 20 cm height) were inoculated with a virulent isolate of P. cinnamomi; in the second trial only seedlings from Tepeyanco and Atlixco genotypes (5 cm height) were inoculated. Inoculation of seedlings in advanced stages of growth (from 15 to 20 cm height) and juvenile stage (5 cm) allows detecting resistance to P. cinnamomi. The seedling population of Atlixco is an important source of resistance, because it had more new shoots of totipotent and asymptomatic seedlings. Toliman, Tepetl and Thomas genotypes in juvenile stage are considered susceptible. Colin V-33 can be a resistant rootstock to P. cinnamomi. Atlixco and Tepeyanco are considered resistant-tolerant to marchitamiento del aguacatero (avocado wilt) and cancro (canker) caused by P. cinnamomi.

Keywords: Persea americana Mill, avocado sadness, canker, oomycete, shoot regeneration.

Introducción

El oomicete Phytophthora cinnamomi causa la pudrición de la raíz y es la enfermedad más destructiva e importante del aguacate en todo el mundo (Zentmyer, 1980; Erwin et al., 1996). En México, una de las principales limitantes en la producción de aguacate es la pudrición de raíces producida por este patógeno. En 1994, esta enfermedad causó la muerte de 100 000 árboles de aguacate Persea americana variedad Hass en Uruapan, Michoacán, disminuyendo la producción con pérdidas económicas para los productores por más de 32 millones de pesos (Vidales et al, 1999; Newett et al, 2002). Este oomicete, también ocasiona 90% de incidencia de cancros en el tronco del aguacate, reduciendo la producción y superficie cultivada en la región de Michoacán (Zentmyer 1980; Ceja et al, 2000).

La pudrición de raíces y cancro del tronco del aguacatero causado por el patógenoP. cinnamomi se describió por primera vez en Puerto Rico, en 1927 (Zentmyer, 1980; Zentmyer, 1985), y actualmente este patógeno se puede encontrar distribuido en casi todas las áreas productoras de aguacate del mundo (Erwin et al, 1996; Pegg et al, 2008). Este patógeno invade la base del tronco en donde se desarrolla como un cancro que llega a alcanzar de 1 a 2 m de altura, y que se caracteriza por presentar coloraciones de café claro a oscuras y exudaciones acuosas (Zentmyer 1980; Ceja et al, 2000). En 1959, en California EE. UU., se observó por primera vez síntomas de cancro en árboles de macadamia (Macadamia integrifolia y Macadamia tetraphylla) y aguacate. En 1960, se comprobó que el agente causal del cancro en estos árboles es ocasionado por P. cinnamomi (Zentmyer et al, 1961; Zentmyer, 1980).

El oomicete forma clamidosporas, estructuras de resistencia, que sobreviven por largos períodos en el suelo, incluso sin el hospedante, por lo que, una vez establecido en una región determinada, su erradicación es difícil. Las medidas de control para este fitopatógeno son la aplicación de fungicidas a base de metalaxil y prácticas culturales. Sin embargo, los intentos de control de esta enfermedad presenta algunas limitaciones y es necesario implementar medidas de control más sustentables tal es el caso del uso de portainjertos tolerantes o resistentes a la pudrición de la raíz causada por P. cinnamomi (Pegg et al., 2008).

Desde 1940 en California, EE.UU, se ha propiciado la investigación para la búsqueda de portainjertos tolerantes a éste oomicete P. cinnamomi Rands. En 1960, Zentmyer colectó semillas de aguacate de varias regiones de México y el Caribe, las colecciones más importantes fueron las provenientes de Atlixco, Puebla, región conocida por su gran variación genética (Anderson, 1950). Estas colecciones de semillas y esquejes presentaban cierto nivel de tolerancia a la enfermedad (Zentmyer, 1961). El origen de los portainjertos de aguacate no es importante para los viveristas ya que utilizaban cualquier tipo de semilla disponible; sin embargo, Pegg et al. (2008) mencionan que en Michoacán, México los portainjertos se obtienen a partir de semilla seleccionada de árboles fuertes y sanos. En México, el éxito de la producción de aguacate Hass se debe a que se encuentra injertado sobre el material criollo de la raza Mexicana var. drymifolia.

Yasseen (1993) induce variabilidad genética mediante la utilización de bencil adenina y tidiazurón (citocininas) en semillas de aguacate para inducir más de un brote, fenómeno llamado brotes múltiples. Valteur et al. (2011) mencionan la utilización de radiación gamma para inducir policaulismo en semillas a utilizar en la propagación clonal de portainjertos tolerantes a P. cinnamomi. Sin embargo, estos trabajos no implican la obtención de portainjertos resistentes a este patógeno ya que las semillas no han sido expuestas a la infección por el oomicete.

Materiales y métodos

La selección por plántulas resistentes de aguacate se llevó a cabo en dos ensayos, en el primero se utilizaron de 90 a 148 semillas de la raza Mexicana (var. drymifolia), las semillas fueron colectadas de árboles en producción en Atlixco, Puebla y Tepeyanco, Tlaxcala. Estos genotipos se denominaron como Atlixco y Tepeyanco. El portainjerto comercial Thomas (20) y los genotipos Tepetl (20), Toliman (20) y Colín V-33 (51), provenientes de semilla de la raza Mexicana, fueron proporcionados por la Fundación Salvador Sánchez Colín, CICTAMEX S. C. ubicada en Coatepec Harinas, Estado de México (altitud de 2 260 m, latitud de 18° 48' 08" y longitud de 99° 42' 56").

Como fuente de inóculo se utilizó el aislamiento de P. cinnamomi CPO-PCU (por sus siglas de registro en el Genbank: Colegio de Postgraduados-Phytophthora cinnamomi de Uruapan, número de acceso al Genbank JQ266267) muy virulento, aislado de raíces de aguacate provenientes de un huerto ubicado en Uruapan, Michoacán, México. El oomicete se reactivó en medio agarjugo-V8® a 28 °C durante 8 días. Posteriormente, se transfirieron 10 rodajas del medio de cultivo de 5 mm de diámetro a matraces de 500 mL con medio líquido jugo-V8® (Figura 1) y se incubó a 28 °C. Diez días después de la incubación y multiplicación del oomicete, se procedió a cuantificar el número de fragmentos de micelio por mililitro con un hematocitómetro Neubauer.

Se utilizaron los sustratos de peat moss®, suelo agrícola y agrolita® (en proporción 2:2:1), posteriormente se realizó el llenado de macetas de plástico (capacidad de 1 L) con el sustrato previamente esterilizados por 4 h a15 lb de presión, durante dos días consecutivos, ocho días después se procedió a sembrar las semillas de aguacate. Previo a la inoculación de los genotipos de aguacate, se hicieron cuatro orificios de 3 cm de profundidad en el suelo circundante a la raíz de plántulas de 5 cm y de 15 a 20 cm de altura en donde se depositaron 200 mL de la suspensión de micelio de P. cinnamomi (2.5 * 10³ mL), durante el experimento la humedad del suelo se mantuvo a 90%. Las observaciones se realizaron ocho días después de la inoculación, los parámetros a evaluar fueron número de plántulas muertas, número de plantas con desarrollo de cancro y plántulas asintomáticas así como el porcentaje de plántulas que mostraban rebrotes totipotenciales, en 1959 Reinert utilizó este término refiriéndose a las plantas que tienen la capacidad de rebrotar y formar plantas completas (CIAT, 1999; Martínez-Gómez et al, 2004).

En el segundo ensayo, se utilizaron 320 semillas de raza Mexicana colectadas, de árboles en etapa de producción, de Atlixco, Puebla y Tepeyanco, Tlaxcala, estos genotipos se denominaron Atlixco y Tepeyanco, de los cuales se inocularon 160 plántulas de 5 cm de altura. La tolerancia-resistencia se determinó contabilizando el número de plántulas muertas, con síntomas de cancro y número de plántulas asintomáticas. Entre los 10 a 30 días, simultáneamente, se registró la frecuencia de brotes nuevos después de la muerte de la primera plántula. Con el propósito de evitar escape a la infección los nuevos brotes se reinocularon con 200 mL del concentrado micelial de P. cinnamomi (2.5 * 10³ mL). Posteriormente, en los brotes nuevos se registró el porcentaje de mortalidad causada por P. cinnamomi y el número de plántulas asintomáticas.

Los datos del número de plántulas muertas, con cancro, asintomáticas y el número de brotes nuevos entre genotipos se analizaron con la prueba de χ² (Herrera et al, 2005); los datos fueron analizados con el software SAS® V. 9.0 para Windows (SAS Institute, 2002).

Resultados y discusión

Primer ensayo

Los primeros síntomas de la enfermedad se presentaron de 10 a 20 días después de la inoculación. Estos se caracterizaron por una marchitez en la parte aérea, pudrición de raíces, clorosis general y pérdida de turgencia. Estos síntomas pueden presentarse en cualquier etapa biológica de la planta, desde plántula hasta árboles en producción (Zentmyer, 1985; Téliz et al, 2007). Otro síntoma observado frecuentemente fue el desarrollo de cancro en el tallo que se caracterizó por presentar coloraciones de café claro a oscuras y exudaciones acuosas (Zentmyer, 1980; Ceja et al., 2000); estos síntomas son severos y se presentan cuando las plantas son es susceptibles a la infección causada por el patógeno y generalmente provocan la muerte. La variación genética de los genotipos evaluados en plántulas asintomáticas permitirá obtener portainjertos promisorios tolerantes-resistentes a P. cinnamomi (Cuadro 1).

La prueba de χ² mostró que existen diferencias altamente significativas (p< 0.001) entre los genotipos evaluados, donde los genotipos Atlixco y Tepeyanco de la raza Mexicana, al inocularse en su etapa de desarrollo de 5 cm de altura con P. cinnamomi, presentaron mayor número de plantas con cancro (21 y 8), mientras que las selecciones Tepeyanco, Atlixco y Colín V-33 mostraron un mayor número de plantas muertas (60, 38 y 21) y altos porcentajes de mortalidad que oscilaron entre 40 y 90% (Cuadro 1). Sin embargo, en los genotipos Tepetl, Toliman y Thomas hubo muerte total de plantas, aun cuando el número de plantas evaluadas fue variable en cada genotipo de aguacate (Cuadro 1).

Los genotipos Tepeyanco y Atlixco de raza Mexicana presentaron mayor número de plantas asintomáticas (22 y 31) y mostraron mejor tolerancia-resistencia ante la infección de P. cinnamomi. En el presente trabajo se obtuvieron resultados similares a los reportados por Menge (1999) en el portainjerto Thomas, el cual se comporta susceptible en la etapa de plántula (Cuadro 1).

En los genotipos de aguacate inoculados en etapa de plántula de 15 a 20 cm de altura, las pruebas de χ² (p< 0.001) mostraron diferencias estadísticas significativas en los diferentes síntomas causados por P. cinnamomi. Las selecciones Tepeyanco y Atlixco, tuvieron mayor número de plántulas con cancro y mortalidad en comparación con Thomas, Toliman, Tepetl y Colín V-33, que tuvieron menor valor porcentual de plantas con cancro (Cuadro 2).

Los síntomas del cancro del tallo en plántulas se observaron a los 10 y 25 días después de la inoculación mostraron una necrosis en la epidermis del tallo desde su base de la plántula y hasta 1 cm de longitud arriba de la base. En el tallo, la necrosis se extendió de 15 a 20 cm a los 90 días (Figura 2) cuando las plántulas mostraron síntomas de cancro en la epidermis del tallo, posteriormente se observó marchitez y finalmente murieron. Estos síntomas coinciden con las observaciones realizadas por Ceja et al. (2000). Desde 1959, se determinó por primera vez en California, EE.UU., que P. cinnamomi era el agente causal del cancro en árboles de macadamia (Macadamia integrifolia) y aguacate (Persea americana) (Zentmyer et al., 1961; Zentmyer, 1980).

En genotipos de aguacate inoculados a edad temprana (5 cm de altura) es posible encontrar resistencia a P. cinnamomi, debido a que se pueden detectar diferencias entre los genotipos de aguacate evaluados. Los genotipos Atlixco y Tepeyanco mostraron ser fuente importante de resistencia ya que presentaron mayor número de plantas sanas (asintomáticas) en etapa de plántulas (5 cm de altura) y aún en la etapa más avanzada de crecimiento (15 a 20 cm de altura).

Los materiales evaluados para resistencia en plántulas inoculadas con P. cinnamomi emitieron brotes nuevos tras morir el primer brote, como expresión de resistencia al oomicete o mecanismo de respuesta de la planta que se conoce como totipotencialidad (CIAT, 1991). En el Cuadro 3 se muestra el número de rebrotes que se producen después de la inoculación con el oomicete. Las plántulas de 5 cm de altura en los genotipos de Colín V-33, Tepetl, Tepeyanco y Atlixco presentaron valores porcentuales similares; los resultados posiblemente se deben a que provienen de una población genéticamente variable; es decir, que la población de semillas colectadas de árboles en producción tiene un amplio pool de genes por encontrarse en un huerto de polinización abierta, como resultado la prueba de χ² (p< 0.05) no mostró diferencias estadísticas significativas entre los genotipos de aguacate para la generación de nuevas plántulas. Sin embargo, Thomas y Toliman no formaron nuevos brotes después de la inoculación con P. cinnamomi; la ausencia de nuevos brotes se debe a la incapacidad y baja frecuencia genética del carácter.

El genotipo Atlixco presentó bajo porcentaje de mortalidad (Cuadro 3), mientras que Colín V-33 y Tepeyanco mostraron 25 y 33% de muerte, respectivamente, mientras que Tepetl presentó 100% de mortalidad después de 10 días de la inoculación. Los genotipos Atlixco y Tepeyanco se consideran resistentes a P. cinnamomi, al mostrar el porcentaje más alto de rebrotes asintomáticos (equivalente a 10 nuevos brotes) en comparación con el genotipo Colín V-33 que emitió 3 brotes de plántulas asintomáticas (Cuadro 3).

La inoculación en plántulas de 5 cm de altura estimuló la totipotencialidad (capacidad de rebrotación). En la Figura 3, se muestra la muerte de la primera plántula tras la inoculación con P. cinnamomi y la formación del nuevo brote con el desarrollo de una raíz principal y raíces adventicias vigorosas. La capacidad de regenerar nuevas raíces en estos genotipos es un mecanismo de respuesta de resistencia genética basada en la supervivencia y capacidad totipotencial ante la inoculación de plántulas con el patógeno. Esta respuesta de la plántulas se puede observan cuando las plántulas o portainjertos provienen principalmente de semillas de raza Mexicana. Por lo anterior, la mayoría de los árboles de aguacate en Australia y México están injertados sobre portainjertos de semillas procedentes de árboles de polinización libre, de raza Mexicana, que provee la posibilidad de que exista una variación genética en sus huertos para la selección de resistencia a P. cinnamomi. Pegg et al. (2008) mencionan que los portainjertos australianos cultivar Thomas y genotipo de raza Mexicana como Duke sobreviven y prosperan en condiciones de alta presión de inóculo debido a la capacidad de los portainjertos para regenerar rápidamente nuevas raíces.

Los resultados obtenidos en los estudios de la formación de nuevos brotes después de la inoculación sugieren que Tepeyanco, Atlixco y Colín V-33 pueden considerarse como tolerantes-resistentes a P. cinnamomi. Este fitopatógeno, de acuerdo a la observación en plántulas, podría ser el responsable de provocar mutaciones naturales al inocular en plántulas y provocar la muerte de estas, posteriormente algunas tienen la capacidad regenerar brotes nuevos de plántulas con raíces vigorosas. Aún se desconocen los mecanismos involucrados en la resistencia a la infección de P. cinnamomi en plántula de aguacate. Una explicación podría corresponder con los estudios realizados por Ehrenberg et al. (1956) quienes mencionan que otras sustancias químicas producidas por hongos pueden llegar raramente a provocar mutaciones; sin embargo, pueden aumentar la proporción de las mutaciones génicas visibles. Tal es el caso del hongo Clitocybe nebularis que aumenta la frecuencia de las mutaciones visibles.

En la inoculación de plántulas de 15 a 20 cm de altura, χ² (p< 0.05) no se observaron diferencias estadísticas significativas entre los genotipos que emitieron nuevas plántulas (Cuadro 4).

En los brotes reinoculados, el porcentaje de mortalidad fue superior en Colín V-33, Atlixco, Tepeyanco y Tepetl (entre 30 y 40%), se incrementó el porcentaje de plántulas asintomáticas. Los resultados indican que los genotipos Colín V-33, Tepeyanco, Atlixco y Tepetl tienen comportamiento tolerante-resistente a P. cinnamomi (Cuadro 4) y pueden utilizarse en zonas productivas de aguacate. Entre los genotipos estudiados Tepeyanco y Atlixco han sido seleccionados por su resistencia a la infección en inoculación de plántulas en la etapa de 5 cm de altura y por producir nuevos brotes con mayor número de plántulas asintomáticas después de la reinoculación.

Con la finalidad de inducir la estimulación de nuevos brotes y poder obtener individuos que muestran esta capacidad de resistencia promisoria a P. cinnamomi, se evaluó un segundo ensayo utilizando plántulas de los genotipos Tepeyanco y Atlixco, posiblemente tienen mayor variabilidad genética por este carácter formación de nuevos brotes.

Las plántulas reinoculadas de 5 cm de altura no mostraron diferencias significativas a la infección entre ambos genotipos, los cuales presentaron número similar de plántulas (40 y 45) con síntomas de cancro. Sin embargo, Atlixco mostró mayor número (81) y porcentaje de plántulas muertas (51%) en comparación con Tepeyanco que presentó 27 plántulas muertas (Cuadro 5). En los resultados obtenidos en plántulas asintomáticas, Tepeyanco tuvo mayor frecuencia de plántulas resistentes (93 que correspondió a 58%), mientras que Atlixco tuvo menos número de plántulas sin presencia de síntomas (34 correspondiente a 21%).

En la prueba para resistencia en plántulas a la marchitez del aguacatero, se está llevando a cabo simultáneamente un método de selección para resistencia a cancro del tronco, ya que recientemente esta enfermedad en la región de Michoacán alcanzó incidencia de 90% (Ceja et al., 2000). Por tanto es de suma importancia contar con portainjertos resistentes no sólo a la marchitez del aguacatero sino también al cancro del tronco.

La estimulación de rebrotes inducidos por la inoculación de los genotipos Atlixco y Tepeyanco fue de 13 y 11 que correspondió a 8% y 54%, respectivamente, de una población de 160 plántulas inoculadas (Cuadro 6). La frecuencia de plántulas totipotenciales fue baja debido a que en la naturaleza ocurre al azar y en bajas frecuencias. Para aumentar la frecuencia de nuevos brotes de ejes embrionarios de aguacate se utiliza la inducción por hormonas de crecimiento (citocininas) (Mohamed et al., 1993; Keightley et al, 2009). La reinoculación asegura la infección por P. cinnamomi en los nuevos brotes, lo cual fue posible comprobar en esta investigación, debido a que no se encontraron diferencias estadísticas significativas en el número de plántulas de los genotipos Atlixco y Tepeyanco. Además, el número de plántulas asintomáticas en Atlixco y Tepeyanco no fue significativo, pudiéndose considerar que ambos genotipos son resistentes al cancro y la marchitez del aguacatero (Cuadro 6).

Conclusiones

La inoculación de plántulas permite inducir la totipotencialidad y detectar resistencia a P. cinnamomi. Es posible obtener portainjertos resistentes a P. cinnamomi de las poblaciones Atlixco y Tepeyanco por su totiponcialidad y sanidad.

La totipotencialidad de las poblaciones Tepeyanco, Atlixco y Colín V-33 las convierte en poblaciones tolerantes-resistentes a P. cinnamomi. Estos resultados muestran nuevas perspectivas para profundizar en los mecanismos de formación de rebrotes como reacción para defensa en plántulas de aguacate raza Mexicana contra la infección causada por P. cinnamomi.

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