Variabilidad genética de cultivo in vitro de aguacate raza mexicana*

Genetic variability of Mexican avocado race using in vitro culture

Ivón Montserrat Cerda-Hurtado¹, Ma. Del Carmen Ojeda-Zacarías¹, Leobardo Iracheta-Donjuan², Jesús Martínez-De la Cerda¹, Jorge Ariel Torres-Castillo³ y Adriana Gutiérrez-Díez^1§

¹ Facultad de Agronomía- Universidad Autónoma de Nuevo León. Francisco Villa S/N. Col. Ex-Hacienda El Canadá. Gral. Escobedo, Nuevo León, México. C. P. 66054. Tel: 1340-4399. (ivocerhu@hotmail.com; ojedacz@yahoo.com.mx; jemarcer@yahoo.com.mx).

³ Instituto de Ecología- Aplicada Universidad Autónoma de Tamaulipas. División del Golfo 346. Col. Libertad. Cd. Victoria, Tamaulipas, México. C. P. 87019. (jorgearieltorres@hotmail.com). ^§Autor para correspondencia: mcgudiez@aol.com.

* Recibido: octubre de 2014
Aceptado: diciembre de 2014

Resumen

Explantes foliares de Persea americana Mill. var. drymifolia, se establecieron en medio DCR (Gupta y Durzan, 1985) suplementado con vitaminas y reguladores del crecimiento para producir callos, dos sub cultivos se realizaron en intervalos de 30 a 45 días entre ellos. Con el fin de determinar la variabilidad genética se generaron 341 marcadores AFLP (amplified fragment lenght polymorphism) polimórficos con 10 combinaciones de iniciadores, se analizaron 94 muestras: la planta madre, 31 callos, 31 callos del primer sub cultivo y 31 callos del segundo sub cultivo. Se determinó el contenido de información polimórfica (PIC) por combinación de iniciadores y se calculó la distancia genética entre muestras para hacer el análisis de agrupamiento. Se obtuvo la diversidad genética entre la planta madre, callos y callos de los dos sub cultivos y se realizó ei análisis de varianza molecular. Los valores PIC indicaron que las combinaciones de iniciadores fueron adecuadas para estimar la variabilidad genética de los callos. En el análisis de agrupamiento, la planta madre mostró distancias de 0.63 a 0.7 con respecto a sus callos, distancias de 0.78-0.99 se obtuvieron entre los callos y los callos de los dos sub cultivos. La diversidad genética presentó diferencias significativas, el análisis de varianza molecular demostró variabilidad genética entre la planta madre, callos y callos de los dos sub cultivos, así como dentro de los callos, callos del primer sub cultivo y callos del segundo sub cultivo. Los resultados indicaron que la variabilidad genética puede ocurrir en cualquier sub cultivo. Debido a la variabilidad genética presentada los callos no se consideraron clones.

Palabras clave: Persea americana Mill. var. drymifolia, AFLP, cultivo de callo, variación somaclonal.

Leaf explants of Persea americana Mill. var. drymifolia were established on DCR medium (Gupta and Durzan, 1985) supplemented with vitamins and growth regulators to produce callus, two sub cultures were made in intervals of 30 to 45 days between them. In order to determine the genetic variability 341 AFLP (amplified fragment lenght polymorphism) polymorphism with 10 primer combinations were generated, 94 samples were analyzed: the mother plant, 31 calluses, 31 calluses from the first sub culture and 31 calluses from the second sub culture. Polymorphic information content (PIC) was determined by primer combination and the genetic distance between samples was calculated for the cluster analysis. Genetic diversity between the mother plant, calluses and calluses of the two sub cultures were obtained and the analysis of molecular variance was performed. The PIC values indicated that the primer combinations were adequate to estimate the genetic variability of calluses. In the cluster analysis, the mother plant showed distances of 0.63 to 0.7 in regard to their calluses, distances of 0.78 - 0.99 were obtained between calluses and calluses of the two sub cultures. Genetic diversity showed significant differences, analysis of molecular variance demonstrated genetic variability between the mother plant, calluses and calluses of the two sub cultures as well as within the calluses, calluses of the first sub culture and calluses of the second sub culture. The results indicated that genetic variability can occur in any sub culture. Due to genetic variability presented in callus clones were not considered.

Keywords: Persea americana Mill. var. drymifolia, AFLP, callus culture, somaclonal variation.

Introducción

En plantas el cultivo in vitro es una alternativa para la conservación ex situ, el intercambio y conservación de germoplasma y la propagación clonal; la selección del explante depende de los recursos y objetivos finales de la técnica. Diversos explantes se han utilizado para obtener tipos diferentes de morfogénesis en aguacate (Yasseen, 1993), su capacidad morfogenética bajo condiciones in vitro se asocia al empleo de materiales con características juveniles (Pliego-Alfaro y Murashige, 1987). El callo es una masa amorfa de células vegetales poco diferenciadas y de rápida proliferación, sus características in vitro están determinadas por los reguladores de crecimiento utilizados, la especie, el explante inicial y las condiciones físicas de incubación (Pérez-Molphe-Balch et al., 1999). Callos obtenidos de cotiledones de aguacate se conservaron por más de 15 años sin presentar condiciones aparentes de diferenciación (Schroeder, 1976). Embriones somáticos de aguacate se han regenerado a partir de cultivo de callo (Skene y Barlass, 1983; Mooney y Van Staden, 1987; Pliego y Murashige, 1988; Efendi y Litz, 2003; Vidales et al., 2003).

La variación somaclonal son cambios genéticos en células y tejidos que pueden aparecer durante el cultivo in vitro. Estos cambios pueden manifestarse como mutaciones heredables a las progenies de las plantas regeneradas y resultan de las variaciones pre existentes en el genotipo, el nivel de ploidía, las diferencias genéticas que pre-existen en las células del explante, los efectos inducidos por el medio de cultivo, la vía de regeneración, la naturaleza del callo, la edad del cultivo y la alteración al metabolismo celular (Krikorian, 1991; Cardone et al., 2004; Medina et al., 2007; Sánchez-Chiang y Jiménez, 2009; Peredo et al., 2009). Se ha reconocido que los cultivos de callos producen progenies que difieren considerablemente del material inicial (Peredo et al., 2006). En plantas con ciclos de vida largo, la variación somaclonal es una desventaja para la micropropagación ya que las mutaciones sólo pueden ser detectadas en etapa tardía (Fourré et al., 1997).

Existen criterios morfológicos, bioquímicos y moleculares para el monitoreo de la estabilidad genética de los cultivos in vitro. Variantes somaclonales regeneradas de callo de hoja se han detectado a través de análisis enzimático en remolacha (Sabir et al., 1992) y papa (Alicchio et al., 1987); este análisis se ve limitado por la disponibilidad, la variación en relación con las condiciones ambientales de crecimiento y la edad del cultivo, ya que afectan su reproducibilidad (Rani et al., 1995; Chen et al., 1998; Cardone et al., 2004). Debido a que las mutaciones también ocurren en regiones de ADN que no expresan proteínas, en regiones espaciadoras y en otras regiones que no traducen y transcriben ADN, es necesario utilizar otro tipo de técnica como marcadores moleculares tipo RAPD, SSR y AFLP. Estos marcadores moleculares no son influenciados por el ambiente ni por los estados fenológicos de la planta, se producen en cantidad ilimitada, tienen amplia cobertura en el genoma, presentan alto nivel de polimorfismo y se detectan en etapas tempranas de los cultivos.

Los AFLP son secuencias de ADN identificadas y caracterizadas que revelan la variabilidad nucleotídica de una o varias regiones del genoma de cada individuo (Vos et al., 1995), se utilizan para caracterizar la variación somaclonal con gran precisión y menos esfuerzo que los análisis fenotípicos y cariológicos, siendo un medio para evaluar la estabilidad genética del cultivo in vitro (Cloutier y Landry, 1994; Sánchez-Chiang y Jiménez, 2009). Los AFLP se han utilizado para detectar la variación somaclonal de plantas generadas in vitro en Carya illinoinensis (Vendrame et al., 1999), Arabidopsis thaliana (Polanco y Ruiz, 2002), Alnus acuminata H. B. K. (Gutiérrez, 2002; Marulanda et al., 2006), Agave fourcroydes (González et al., 2004), Hevea brasiliensis (Medina et al., 2007) y Manihot esculenta (Medero et al., 2002). Debido a lo mencionado antes, el objetivo de este trabajo fue evaluar la variabilidad genética en cultivos de callo de Persea americana Mill. var. drymifolia utilizando AFLP.

Explantes de 1 cm² de hojas jóvenes desarrolladas y sanas de un árbol de P. americana var. drymifolia de seis años de edad, se establecieron en medio DCR (Gupta y Durzan, 1985), pH 7.5 y 4.5 g L^-1 de Phytagel^, adicionado con vitaminas y reguladores de crecimiento: 200 mg L^-1 de inositol, 50 mg L^-1 de glutamina, 500 mg L^-1 de caseína hidrolizada, 0.3 mg L^-1 de 6-bencilaminopurina, 0.01 mg L^-1 de ácido naftalenacético, 0.1 mg L^-1 de tiamina, 0.5 mg L^-1 de ácido nicotínico, 0.5 mg L^-1 de piridoxina, 2 mg L^-1 de glicina, 10 mg L^-1 de ácido ascórbico, 10 mg L^-1 de ácido cítrico, 1.5 mg L^-1 de 2,4-D, 0.3 mg L^-1 de kinetina, 20 g L^-1 de sacarosa. Los explantes se colocaron a 20 ºC ± 2 ºC en oscuridad hasta la formación de callo. Dos sub-cultivos de los callos se realizaron en el mismo medio de cultivo.

La visualización y análisis de los fragmentos amplificados se realizó por electroforesis en poliacrilamida a 6.5% en un secuenciador LI-COR IR² 4200 (Li-Cor Inc, Lincoln, NE, USA), con el programa SAGA^MX (Li-Cor Inc, Lincoln, NE, USA); se generó una matriz de datos binarios asignando el valor de 1 a la presencia de banda y 0 a la ausencia. El análisis de datos se realizó por medio del programa Info-Gen (Balzarini y Di Renzo, 2013), para la descripción de los AFLP se calculó el contenido de información polimórfica (PIC), el porcentaje de amplificación, y la probabilidad de que dos individuos compartan el mismo alelo. Para la planta madre, callos, callos del primer sub-cultivo y callos del segundo sub-cultivo se calculó la diversidad genética (prueba de Friedman) y se realizó el análisis de varianza molecular (Balzarini et al., 2010). Las distancias genéticas se calcularon por medio del índice de Nei estándar, el dendrograma se construyó utilizando el algoritmo UPGMA (Balzarini et al., 2010).

La formación de callo ocurrió a los 30 días después del establecimiento in vitro, la de los callos de los dos sub-cultivos ocurrió de 30 a 45 días después del establecimiento en medio fresco. Los AFLP generados estuvieron en el rango de 70 a 460 bp. Se produjeron en total 341 marcadores AFLP polimórficos. El promedio de AFLP por combinación de iniciadores fue de 34.1; en estudios de estabilidad genética en plantas de yuca Manihot esculenta Crantz. propagadas por embriogénesis somática y organogénesis, Medero et al. (2002) identificaron de 36 a 38 marcadores AFLP por combinación de iniciadores M- + E- con tres y dos nucleótidos selectivos, y entre 20 y 26 marcadores por combinación de iniciadores con tres nucleótidos selectivos, estos marcadores permitieron determinar que los clones fueron genéticamente idénticos a sus plantas madres. En callos organogénicos de lúpulo Humulus lupulus L., Peredo et al. (2006) identificaron 54 marcadores AFLP por combinación de iniciadores, los patrones de los marcadores identificados fueron idénticos entre la planta madre y los callos. En el estudio de variación somaclonal entre callos embriogénicos y plantas donadoras en Hevea brasiliensis, Medina et al. (2007) identificaron 62.5 marcadores AFLP polimórficos por combinación de iniciadores.

El promedio de bandas amplificadas por iniciador con otros marcadores ha sido menor, con ISSR utilizados para medir la estabilidad genética en plantas regeneradas de Evolvulus glomeratus se identificaron 11.25 bandas por iniciador, 95.5% fueron monomórficas (Maritano et al., 2010). Con RAPD Villaça et al. (2008) identificaron 2.7 bandas polimórficas por iniciador en plantas de Zea mays regeneradas de callo, en Humulus lupulus con RAPD se identificaron 7.3 bandas por iniciador (Peredo et al., 2009). Estos resultados confirman la ventaja de utilizar AFLP en estudios de estabilidad genética de cultivos in vitro ya que proporcionan mayor información debido a la mayor cantidad de bandas polimórficas.

Los valores PIC de las combinaciones de iniciadores oscilaron entre 0.27 y 0.36, lo que indicó que las combinaciones utilizadas fueron útiles para estimar la variabilidad genética de los callos. Los valores bajos de probabilidad de que dos muestras compartan el mismo alelo, indicó un alto grado de confianza para la identificación de los callos (Cuadro 1) (Balzarini et al., 2010).

Se obtuvieron diferencias significativas en las comparaciones múltiples para la prueba de Friedman de diversidad genética y proporción de loci polimórficos entre la planta madre, callos, callos del primer sub-cultivo y callos del segundo sub-cultivo; en ambos casos los callos del primer sub-cultivo fueron estadísticamente diferentes y presentaron mayor variabilidad genética (valores más altos de diversidad genética y proporción de loci polimórficos), los callos y callos del segundo sub-cultivo fueron estadísticamente iguales mientras que la planta madre no presentó variabilidad genética. El análisis de varianza molecular demostró que existe variabilidad genética entre la planta madre, callos, callos del primer sub-cultivo y callos del segundo sub-cultivo (12%) (p< 0.0001); así como dentro de los callos, callos del primer sub-cultivo y callos del segundo sub-cultivo (88%) (p< 0.0001).

El dendrograma del análisis de agrupamiento (Figura 1) tuvo una correlación cofenética de 0.96 lo que indicó poca distorsión entre las distancias genéticas y la de agrupamiento. Distancias de 0.63 a 0.7 de la planta madre con respecto a los callos se presentaron en 45.6% de los callos, 29.8% de los callos del primer sub-cultivo, y 19.3% de los callos del segundo sub-cultivo. Distancias de 0.78 a 0.99 con respecto a la planta madre se presentaron en 8.5% de los callos, 34.3% de los callos del primer sub-cultivo y 48.6% de los callos del segundo sub-cultivo; la menor variabilidad somaclonal se presentó entre los callos y los callos del primer sub-cultivo.

En los callos del segundo sub-cultivo la distancia genética aumentó con respecto a la planta madre, en algunos callos que se continuaron con tercer y cuarto sub-cultivo las distancias genéticas con respecto al segundo sub-cultivo fueron de 0.08 y 0.32, respectivamente; las distancias genéticas con respecto a la planta madre fueron de 0.72 y 0.85, respectivamente. Maritano et al. (2010) sugieren un valor de distancia de 0.05 para considerar que los clones obtenidos por cultivo in vitro son genéticamente idénticos, por lo que de acuerdo con los resultados, los callos obtenidos no son clones ya que presentaron variabilidad genética.

Zucchi et al. (2002) reportaron intervalos de polimorfismo de 3.06% a 5.1% entre la planta madre y los explantes derivados de los sub-cultivos en caña de azúcar, los polimorfismos se presentaron en todos los sub-cultivos y no se incrementaron con el número de los mismos; al igual que en nuestro trabajo se mostró mayor nivel de variación entre la planta madre y los explantes establecidos in vitro. El proceso de cultivo in vitro es un factor estresante para el genoma de la planta, durante el cultivo in vitro la planta sufre des-diferenciación celular principalmente en la primera generación, en las siguientes generaciones o sub-cultivos el nivel de polimorfismo decrece debido a procesos nos predecibles (Zucchi et al., 2002). Existen reportes que difieren con los resultados obtenidos en este trabajo, estudios de variación genética y epigenética por medio de AFLP en lúpulo indicaron que no se produjeron re-arreglos genéticos durante el cultivo in vitro de callo y sus plantas derivadas, siendo posible producir plantas sin variación por organogénesis indirecta (Peredo et al., 2006), estos resultados permitieron sustentar que la variación genética producida por el cultivo in vitro depende entre otros factores del género y especie y del genotipo de la planta madre.

Los marcadores AFLP permitieron estimar la variabilidad genética entre y dentro la planta madre, sus callos y callos sub-cultivados. Los callos y sus sub-cultivos no son clones ya que presentaron variabilidad genética. De acuerdo con el propósito de la aplicación de las técnicas de cultivo in vitro, es necesario, que se consideren los factores que influyen en el tipo y frecuencia de la variación somaclonal (explante, edad de la planta madre, edad del tejido, genotipos, condiciones de incubación). Si el objetivo de la técnica in vitro en cultivos como el aguacatero y otras plantas perennes es la propagación clonal, conservación de germoplasma o transporte del mismo para programas de mejoramiento, se recomienda integrar otro tipo de marcadores moleculares que detecten regiones de expresión debido a que los AFLP detectan variación sin consecuencia fenotípica.

Literatura citada

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