Sobrevivencia de Azospirillum brasilense después de aplicar herbicidas en Triticum aestivum L. Var. Altiplano*

Survival of Azospirillum brasilense after applying herbicides on Triticum aestivum L. Var. Altiplano

Juan Francisco Aguirre-Cadena¹, Silvia Reyna Téllez², Mariana Cuautle² y Juan Francisco Aguirre-Medina^§3

¹ Colegio de Postgraduados. Campus Puebla, Carretera Federal México-Puebla km. 125.5, Santiago Momoxpan, San Pedro Cholula, Puebla. C. P. 72760, México. (juaguirre86@hotmail.com).

³ Universidad Autónoma de Chiapas. Facultad de Ciencias Agrícolas. Entronque carretera costera y Estación Huehuetán. C. P. 30660. (964) 6270439. Huehuetán, Chiapas, México. (juanf56@prodigy.net.mx). ^§Autor para correspondencia: juanf56@prodigy.net.mx.

* Recibido: mayo de 2014
Aceptado: septiembre de 2014

Resumen

Los herbicidas son ampliamente utilizados en la agricultura y se aplican en diversas cantidades que pueden influir directa o indirectamente en los microorganismos del suelo y sus procesos. Con el objetivo de evaluar la sobrevivencia de Azospirillum brasilense inoculado en la variedad altiplano de trigo a la aplicación de dos tipos de herbicidas comerciales, un organoclorado y otro organofosforado, se estableció el presente experimento en la Ecozona de la Universidad de las Américas-Puebla, México, en condiciones de invernadero en 2009. Las semillas se inocularon antes de la siembra con Azospirillum brasilense y los herbicidas se aplicaron 40 días después. Se establecieron los tratamientos: 1) plantas sin inocular (testigo absoluto); 2) inoculación con Azospirillun (testigo inoculado); 3) inoculación con Azospirillum más aplicación de herbicida 2, 4, D, (organoclorado): 4) inoculación con Azospirillum más aplicación de herbicida glifosato (organofosforado); 5) sin inoculación y aplicación de herbicida 2, 4, D; y 6) sin inoculación y aplicación de glifosato, en un diseño completamente al azar con diez repeticiones. Se registró la sobrevivencia de la bacteria en el sistema radical mediante la técnica número más probable y en la planta se registró su altura y peso. Los resultados indican que los dos herbicidas (2, 4, D y glifosato), no afectaron de manera significativa la población de Azospirillum presente en la raíz. Las plantas inoculadas con la bacteria, con o sin tratamiento de herbicida registraron mayor biomasa en comparación con las plantas sin inocular. La biomasa se incrementó con la aplicación 2, 4, D.

Palabras clave: Azospirillum, Triticum, herbicidas, sobrevivencia.

Herbicides are widely used in agriculture and are applied in various amounts that may directly or indirectly influence on soil microorganisms and their processes. In order to evaluate the survival of inoculated Azospirillum brasilense in the Altiplano variety of wheat to the application of two types of commercial herbicides, an organochlorine and, the other organophosphorus, the present experiment was established in the Ecozone, of the University of the Americas-Puebla, Mexico, under greenhouse conditions in 2009. The seeds were inoculated before planting with Azospirillum brasilense and, the herbicides were applied 40 days after. The treatments were applied: 1) uninoculated plants (absolute control); 2) inoculation with Azospirillun (inoculated control); 3) inoculated with Azospirillum plus herbicide application 2, 4, D, (organochlorine); 4) inoculated with Azospirillum plus glyphosate herbicide application (organophosphate); 5) without inoculation and applying herbicide 2, 4, D; and 6) without inoculation and application of glyphosate, in a completely randomized design with ten replicates. The survival of the bacteria in the root system was recorded through the use of the most probable number technique, recording the plant height and weight. The results indicated that, the two herbicides (2, 4, D and glyphosate), did not significantly affected the population of Azospirillum in the root. Plants inoculated with the bacteria, with or without herbicide treatment showed increased in biomass compared to the non-inoculated plants. Biomass increased with application 2, 4, D.

Keywords: Azospirillum, Triticum, herbicides, survival.

Numerosos estudios destacan la capacidad de la bacteria Azospirillum para estimular el crecimiento vegetal, el rendimiento, el contenido de nitrógeno en las plantas (Díaz-Zorita y Fernandez-Canigia, 2009), la fijación de nitrógeno, la proliferación radical y el desarrollo de actividades hormonales (Bashan y de-Bashan, 2010). La utilización de Azospirillum por los productores ha estado acompañada con aplicaciones de agroquímicos, y los más comunes, son los herbicidas. Al respecto, no se han evaluado las cepas contenidas en los biofertilizantes más utilizados por los productores en interacción con los herbicidas y otros agroquímicos. El efecto de algunos herbicidas, como el glifosato (Wardle y Parkinson, 1990; Haney et al., 2002) y 2, 4, D (Wardle y Parkinson, 1990) demuestran cambios temporales en la actividad microbiana.

Chakravarty y Chatarpaul (1990) señalan que el glifosato reduce inicialmente las poblaciones de bacterias y hongos seguido de un estímulo notable. Si la aplicación de un tratamiento de herbicida ejerce un efecto inhibidor significativo sobre la colonización de raíz por las bacterias promotoras del crecimiento vegetal, podría haber un efecto perjudicial sobre la productividad de los cultivos, reduciendo así, las ventajas derivadas de control de las plantas no deseables asociadas a los cultivos. En este trabajo se planteó determinar la sobrevivencia de Azospirillum aplicado a plantas de trigo tratadas con dos herbicidas, uno de ellos sin afectar la planta huésped y el otro induciendo el deterioro o muerte de la misma. Con estas acciones, se espera comparar si la sobrevivencia de la bacteria se incrementa o disminuye cuando se afecta o no, el desarrollo vegetal de la planta huésped.

La presente investigación se desarrolló en el invernadero de la Ecozona en la Universidad de las Américas, Cholula Puebla. Se localiza geográficamente en el paralelo 19° 03' 12'' de latitud norte y en el meridiano 98° 17' 00'' longitud oeste de Greenwich a 2 300 msnm. El sustrato fue una mezcla de suelo más residuos orgánicos sin esterilizar con textura Franco-arenosa (Bouyoucus), pH de 7.5 (proporción 2:1 potenciómetro), nitrógeno total, 0.13 ppm (Kjeldhal), fósforo total 7.5 mg kg^-1 (olsen/Espectrofotómetro) y con el mismo se llenaron macetas de 1 kg perforadas en la base para favorecer el drenaje. La siembra se realizó el 13 de agosto de 2009 a una profundidad de 4 a 5 cm. Azospirillum brasilense fue adquirido en la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (laboratorio de microbiología) con un contenido de bacterias de 5 x 10⁸ por gramo de turba. Se utilizaron plantas de trigo de la variedad altiplano, proporcionada por la red de investigación en trigo del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) con 95% de germinación.

El glifosato se utilizó en la dosis recomendada para el uso en campo de (0.54 kg i.a. ha^-l) y el 2, 4, D a razón de 250 g ha^-1 (de 0.5 a 1 L ha^-1). Las soluciones se aplicaron a la base de las plantas. Las semillas se impregnaron con carboximetil celulosa al 70% y sobre éste, fue adherido el Azospirillum a una dosis de 4% del peso de la semilla. En total se tuvieron seis tratamientos; 1) testigo sin inocular y sin aplicación de herbicidas; 2) inoculación con Azospirillum; 3) inoculación con Azospirillum más aplicación de 2, 4, D, amina; 4) inoculación con Azospirillum más aplicación de glifosato; 5) sin inocular y con aplicación de 2, 4, D, amina; y 6) sin inocular y con aplicación de glifosato. Cada tratamiento se repitió 10 veces. Los herbicidas se aplicaron 40 días después de la siembra y cinco días después se realizó el conteo de bacteria presente en el suelo. Las macetas se regaron con agua destilada cada tercer día y fueron distribuidas en un diseño completamente al azar.

Los resultados se analizaron estadísticamente por el mismo método y las comparaciones entre tratamientos mediante Tukey (p≤ 0.05). Para tal fin se utilizó el paquete SAS ver 8.0 para Windows y el graficador Sigma Plot (Jandel Scientific, ver 7.0) para Windows. En todos los casos se verificó que se cumpliera con el supuesto de normalidad y homocedasticidad; en los casos que no se cumplían se realizó una transformación Box Cox, para normalizar los datos, como en el caso del peso seco. Se utilizó la transformación de rangos para cubrir los supuestos de normalidad. En este caso los valores de las alturas son reemplazados por sus rangos. Este tipo de transformación permite realizar una prueba paramétrica en lugar de una no paramétrica, en este caso un Anova de dos vías y genera información acerca de la significancia de la interacción entre factores.

El análisis de la rizósfera, a las dos, tres y cuatro semanas de la aplicación en las plantas no inoculadas con Azospirillum presentó pequeña población de Azospirillum en el sustrato, con valores promedio de 1.5 * 10² UFC g^-1. Esta población no inoculada de Azospirillum indica la posible adaptación de la misma en estos suelos del Altiplano. En otros ambientes, se ha consignado su presencia en condiciones naturales en la rizosfera de diversos pastos y cereales (Cárdenas et al., 2010). Al inocular Azospirillum sin aplicar herbicidas la población encontrada fue alta, de 1 * 10¹² (Cuadro 1). Este mismo hecho se presentó con el tratamiento inoculado más la aplicación de 2-4-D amina y la población de Azospirillum no se modificó a través del tiempo. Los cambios se presentaron con la aplicación del glifosato; se incrementó la población de Azospirillum desde el primer muestreo. A los 7 días después de la aplicación, Azospirillum aumentó en 0.5 * 10¹² UFC g^-1. Posteriormente, a los 14 días, la población de la bacteria fue inferior a la inicial, y en los muestreos siguientes, se incrementó nuevamente a los 21 y 28 dds (Cuadro 1).

Resultados semejantes citan Wardle y Parkinson (1990) y Zabaloy et al. (2008). La población de Azospirillum más glifosato en el último muestreo fue la más alta y representó un incremento de 100% en comparación el tratamiento aplicado con 2, 4, D. Ratcliff et al. (2006), citan también estimulación de la actividad microbiana después de la aplicación de glifosato, medida por la mineralización de C y N, pero sin afectar la biomasa microbiana del suelo. En nuestro caso, el número de bacterias de Azospirillum en el tratamiento inoculado y sin herbicidas, no varió significativamente a lo largo del tiempo, y se mantuvo el orden de 1 * 10¹² UFC g^-1.

Algunos autores advierten sobre inhibición del crecimiento diferencial entre cepas de Azospirillum a otros herbicidas (Atanassova-Altimirska y Bakalivanov, 2009) y efectos perjudiciales de glifosato en bacterias fijadoras de nitrógeno libres y en la infección y el número de nódulos formados (Newiadomska, 2004). El glifosato es un organofosfonato que se puede utilizar como fuente de P, C o N por cualquiera de las bacterias gram-positivos o gram-negativas (van Eerd et al., 2003). El poco efecto en la disminución de las poblaciones de Azospirillum asociadas al trigo beneficia su desarrollo vegetal y permite reducir o controlar las plantas no deseadas asociadas al cultivo, especialmente las dicotiledóneas.

Las plantas inoculadas con Azospirillum más glifosato presentaron 15 cm menor tamaño en comparación con el resto de los tratamientos (Figura 1). Se encontró efecto significativo de la interacción entre el factor bacteria y el herbicida aplicado (F_2,90= 9.35, p≤ 0.001). La combinación de la inoculación del trigo con Azospirillum conjuntamente a la aplicación de glifosato resulta en una disminución significativa en el tamaño de la plantas. La misma tendencia se observó en las plantas no inoculadas, aunque esta diferencia no es significativa (Tukey HSD, p> 0.06). Sin embargo, la altura de las plantas no inoculadas y con aplicación de glifosato, sí fueron significativamente de menor tamaño en comparación con las plantas inoculadas y tratadas con 2, 4, D o sin herbicida (Tukey HSD, p≤ 0.008).

Se confirma el efecto negativo del glifosato en el crecimiento del trigo. El glifosato es un herbicida de amplio espectro con acción sistémica, que ejerce su acción sobre el crecimiento de las plantas inhibiendo la biosíntesis de aminoácidos aromáticos esenciales, que son la base para la síntesis de proteínas y genera inhibición del crecimiento (Schuette, 1998). No hubo diferencia significativa entre plantas inoculadas y no inoculadas con Azospirillum sin herbicida o con el herbicida 2, 4, D (Tukey HSD, p> 0.94). La falta de respuesta en altura de la planta a la inoculación de Azospirillum en comparación con las plantas sin inocular, puede estar relacionada con la presencia naturalizada de la población de Azospirillum encontrada en el sustrato. Asimismo, sin la aplicación de herbicidas y con la aplicación del 2, 4, D, las plantas presentaron la misma altura.

En campo, Arregui et al. (2009) citan menor tamaño del trigo sin inocular y con dosis altas de 250 0 500 g ha^-1 de 2, 4, D. Se encontró efecto significativo de la interacción entre el factor bacteria y el herbicida aplicado. El efecto del 2, 4, D, afectó menos el desarrollo de la planta y sobrepasando el posible efecto positivo que pudiera tener la presencia de Azospirillum. Para la biomasa se realizó una transformación logarítmica para cubrir los supuestos de normalidad. Se encontró un efecto significativo de la interacción entre el herbicida y la bacteria (F_2,126= 4.198, p= 0.02, Figura 2).

Conclusión

La contribución de la inoculación del trigo con Azospirillum brasilense es una alternativa factible para mejorar su desarrollo. La interacción de A. brasilense con los dos herbicidas (2, 4, D y glifosato), no afectó de manera significativa a la población de Azospirillum presente en la raíz. La inoculación del trigo con Azospirillum, con o sin tratamiento con herbicida, registraron mayor biomasa en comparación con las plantas sin inocular y cuando fueron tratadas con el herbicida 2, 4, D, se incrementó su producción de biomasa.

Literatura citada

Arregui, M. C.; Scotta, R. R. y Sánchez, D. E. 2009. Fitotoxicidad del barbecho químico en trigo y maíz. Agrociencia. 43:595-601.         [ Links ]

Atanassova-Altimirska, R. and Bakalivanov, D. 2009. Gardian and pivot herbicide effect on some non-symbiotic nitrogen fixing bacteria. Biotechnol. 351-353.         [ Links ]

Bashan, Y. and de-Bashan Luz, E. 2010. How the plant growth-promoting bacterium Azospirillum promotes plant growth- a critical assessment. Adv. Agron. 108:77-136.         [ Links ]

Cárdenas, D. M.; Garrido, M. F.; Bonilla, R. R. y Baldani, V. L. 2010. Aislamiento e identificación de cepas de Azospirillum sp. En pasto guinea (Panicum maximum Jacq.) del Valle del Cesar. Pastos y Forrajes. 33(3):285-300.         [ Links ]

Chakravarty, P. and Chatarpaul, L. 1990. Non-target effect of herbicides. I. Effect of glyphosate and hexazinone on soil microbial activity. Microbial population, and in-vitro growth of ectomycorrhizal fungi. Pestic. Sci. 28, 233-241.         [ Links ]

Díaz-Zorita, M. and Fernandez-Canigia, M. V. 2009. Field performance of a liquid formulation of Azospirillum brasilense on dryland wheat productivity. Eur. J. Soil Biol. 45:3-11.         [ Links ]

Haney, R. L.; Senseman, S. A. and Hons, F. M. 2002. Effect of roundup ultra on microbial activity and biomass from selected soils. J. Environ. Qual. 31(3):730-735.         [ Links ]

Niewiadomska, A. 2004. Effect of carbendazim, imazetapir and thiram on nitrogenase activity, the number of microorganisms in soil and yield of red clover (Trifolium pratense L.) Polish J. Environ. Studies. 13(4):403-410.         [ Links ]

Ratcliff, W. A.; Busse, D. M. and Shestak, J. C. 2006. Changes in microbial community structure following herbicide (glyphosate) additions to forest soils. Appl. Soil Ecol. 34:114-124.         [ Links ]

Schuette J. 1998. Environmental fate of glyphosate. Environmental monitoring and pest management. Department of pesticides regulation. Sacramento, CA. 13 p.         [ Links ]

van Eerd, L. L.; Hoagland, R. E.; Zablotowicz, R. M. and Hall, J. C. 2003. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Sci. 51:472-495.         [ Links ]

Wardle, D. A. and Parkinson, D. 1990. Influence of the herbicide glyphosate on soil microbial community structure. Plant Soil. 122:29-37.         [ Links ]

Zabaloy, C. M.; Garland, L. J. and Gómez, M. A. 2008. An integrated approach to evaluate the impacts of the herbicides glyphosate, 2, 4-D and metsulfuron-methyl on soil microbial communities in the Pampas region, Argentina. Appl. Soil Ecol. 40:1-12.         [ Links ]