Diversidad genética entre variedades de papa (Solanum tuberosum L.) cultivadas en México usando marcadores RAPD e ISSR*

Genetic diversity among potato varieties (Solanum tuberosum L.) grown in Mexico, using RAPD and ISSR markers

Rose Onamu¹ y Juan Porfirio Legaria Solano^1§

¹ Universidad Autónoma Chapingo-Departamento de Fitotecnia, Texcoco, Mexico. Carretera México-Texcoco, km 38.5, 56230. Chapingo, Estado de México. Tel: 01(595)952-1500. §Autor para correspondencia: legarias.juan@yahoo.com.

Resumen

Un análisis de datos consenso de RAPD e ISSR se utilizó para estudiar la diversidad genética en quince cultivares de papa (9 cultivares mejorados de Europa, N. América y México, y 6 cultivares criollos mexicanos) sembrados en México. Las amplificaciones usando cinco iniciadores decámeros al azar y cinco iniciadores ISSRgeneraron 138 bandas de las que 116 (84.4%) fueron polimórficas. El coeficiente de similitud más alto (0.89) se detectó entre los cultivares Fianna y Armada. En contraste, el coeficiente de similitud más bajo (0.55) se obtuvo entre Tollocan y Cambray Rosa Morelos. El alto nivel de diferenciación genética entre cultivares (G_ST= 0.71) y bajos valores de fluj o genético (N_m= 0.19) a través de todos los loci indicaron que el nivel de divergencia genética entre los 15 cultivares es alta. El análisis de varianza molecular (AMOVA) reveló una contribución significativa de las diferencias entre regiones, entre cultivares, entre y dentro de las poblaciones a la diversidad genética total de los cultivares de papa estudiados. Datos consenso usando marcadores RAPD e ISSR fueron muy útiles para el estudio de la diversidad genética y estructura de poblaciones en cultivares de papa.

Palabras clave: AMOVA, estructura de poblaciones, variabilidad genética.

Abstract

A consensus analysis of RAPD and ISSR was used to study genetic diversity in fifteen potato cultivars (9 cultivars bred in Europe, N. America and Mexico, and 6 Mexican creole cultivars) grown in Mexico. Amplifications using five decamer primers randomly generated and five ISSR primers produced 138 bands, from which 116 (84.4%) were polymorphic. Cultivars Fianna and Armada showed the highest similarity coefficient ( 0 . 8 9 ) . In co ntras t, C ambray Ros e To llo can and Morelos had the lowest similarity coefficient (0.55). High genetic differentiation among cultivars (GST= 0.71) and low gene flow (N_m= 0.19) across all loci, indicated high genetic divergence among the 15 cultivars. Analysis of molecular variance (AMOVA) revealed a significant contribution of differences among regions, among cultivars, among and within populations to the overall diversity of potato cultivars studied. Consensus data on RAPD and ISSR markers were very useful to study genetic diversity and population structure in potato cultivars.

Keywords: AMOVA, population structure, genetic variability.

Introducción

La papa (Solanum tuberosum L.) es uno de los cultivos más importantes a nivel mundial (Gopal y Khurana, 2006). Ocupa el cuarto lugar en producción para consumo humano, superado solamente por el trigo, arroz y maíz (Ross, 1986). Clasificaciones recientes reconocen alrededor de 100 especies silvestres y cuatro cultivadas (incluyendo a Solanum tuberosum) (Ovchinnikova etal, 2011). En México, la papa se cultiva anualmente en una superficie de 69 054 ha, con una producción de 1 433 239 millones de toneladas y un rendimiento promedio de 26 t ha (SAGARPA, 2011). La papa se cultiva principalmente en los estados de Sinaloa, Sonora, Chihuahua, Coahuila, Guanajuato, Nuevo León, Jalisco, Michoacán, Veracruz y México (SAGARPA, 2011).

Si bien México no es centro de origen de las papas, se le considera un centro de diversidad secundario. Las variedades de papa cultivadas en México se diferencian en tres grupos: genotipos provenientes de Europa, de EE UU, y aquellos mejorados por organismos nacionales como el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) (Ferroni, 1981). El primer grupo representa el 50% de las variedades cultivadas (Alpha), el segundo 38% y el último alrededor de 8%. Los centros principales de diversidad y producción de papas nativas en México son las zonas aledañas al Nevado de Toluca y al Pico de Orizaba (Ugent, 1968).

Los cultivares europeos han sido fuertemente seleccionados para características deseables de modo que son menos diversos comparados con el 'pool' genético de Norteamérica y probablemente con el de México, especialmente las variedades criollas. En México existen fuertes diferencias entre los tipos de papas que cultivan diferentes agricultores. En el norte del país existen grandes unidades de producción donde predominan estándares tecnológicos avanzados, mientras que en el centro y sur predominan pequeñas unidades con pocos recursos.

Sólo 23% de la tierra dedicada al cultivo de la papa se cultiva con semilla certificada, que se compra por productores a gran escala. Los pequeños productores casi no utilizan semilla certificada o material sano. La mayoría de los productores pequeños utilizan semilla de la cosecha anterior o compran tubérculos destinados al mercado en fresco por los productores grandes. Los productores pequeños o intermedios siembran cultivares nativos coloridos que no tienen un sistema de distribución formal (Qaim, 1998). Las papas cultivadas se propagan como clones para mantener su pureza, sin embargo, la diversidad genética se mantiene a través de cruzas amplias y desarrollando nuevos cultivares. En México existe gran diversidad de papas; sin embargo, este rico recurso genético no se utiliza como debiera debido a la escasa información genética existente (Becerra y Paredes, 2000) y al aislamiento sexual resultante de incompatibilidad entre especies 1EBN en México y especies 2EBN y 4 EBN de Suramérica (Jansky y Hamernik, 2009). El conocimiento de la diversidad genética del germoplasma y los patrones de estructura poblacional entre materiales a mejorar y cultivares es importante para el desarrollo de estrategias de conservación adecuadas, para el mejoramiento genético y para la utilización de las plantas cultivadas. Información previa acerca de la diversidad genética ha sido obtenida usando marcadores morfológicos (Hijmans y Spooner, 2001) e isoenzimas (Douches y Ludlam, 1991).

Éstas técnicas aunque han sido útiles, presentan algunas limitantes como el ser altamente influenciadas por las condiciones ambientales y el bajo número de marcadores que presentan (Semagn, 2006). El desarrollo de marcadores más simples, más económicos y más fáciles de obtener, basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), han mejorado en gran medida la información genética disponible (Powell et al, 1995). Tales marcadores incluyen a los RAPD e ISSR, que se han utilizado extensivamente para caracterizar genotipos de papa (Milbourne et al, 1997; Prevost et al., 1999; McGregor et al, 2000; Bornet et al, 2002; Orona-Castro et al., 2006; Yasmin et al., 2006).

Los RAPD (polimorfismos en elADN amplificados al azar) e ISSR (inter-secuencias simples repetidas) han llegado a ser muy populares en estudios de poblaciones de plantas (Bartish et al, 1999; Bussell, 1999; Nybom y Bartish, 2000). En el presente estudio se caracterizó la diversidad genética entre cultivares de papa usando datos consenso de marcadores RAPD e ISSR.

Materiales y métodos

Quince cultivares de papa se obtuvieron en varios estados de la República Mexicana de fuentes de semilla certificada, del Banco de Germoplasma del Departamento de Fitotecnia de la Universidad Autónoma Chapingo (UACH), y de productores locales (Cuadro 1). Se obtuvieron secciones de cinco tubérculos seleccionados al azar por cultivar para tener un total de 75 individuos para su análisis. Las muestras incluyeron nueve cultivares mejorados y seis variedades criollas.

Purificación del DNA

La purificación del DNA se hizo de acuerdo al protocolo de Dellaporta et al. (1983) con algunas modificaciones. Secciones de tubérculos pesando 0.3 g se maceraron en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo muy fino. La muestra se colocó en un microtubo (Eppendorf) de 1.5 mL que contenía 600 μL de amortiguador de extracción (20 mL Tris-HCL 1 M, pH 8.0; 20 mL EDTA 0.5 M, pH 8.0; 20 mL NaCl 5 M; 35 μL β-mercaptoetanol; 40 mL dodecil sulfato de sodio 20%) y se incubó a 65 °C por 10 min, con inversión ocasional de los tubos.

Después, se adicionó 200 (L de acetato de potasio 5M, se mezcló por inversión y se incubó en hielo por 30 min. Se centrifugó a 8 000 x g durante 10 min atemperatura ambiente, y el sobrenadante se transfirió a otro tubo que contenía 700 (L de isopropanol frío (-20 °C). Se mezcló por inversión e incubó a -20 °C por 30 min y centrifugó por 5 min a 8 000 x g a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó, se recobró el precipitado y se disolvió en 200 (L de solución para diluir (Tris-HCl 50 mM, EDTA-Na₂ 10 mM, pH 8.0). Para eliminar el RNA se añadió 2 μL de RNAasaA y se incubó a 37 °C por 1 h.

Después se adicionó 20 μL de acetato de sodio 3M más 200 (L de isopropanol, se mezcló por inversión y se dejó precipitar a -20 °C por 2 h. Se centrifugó a 8000 x g_n por 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó y el precipitado se lavó con 300 μL de etanol al 70%. La pastilla se secó y se disolvió en amortiguador TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA-Na₂ 1 mM, pH 8.0) a 4 °C. La concentración del ADN se cuantificó usando un espectrofotómetro Genesys 10 uv Scanning® (Thermo Scientific) y se verificó la calidad mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% (w/v). El DNA se utilizó en posteriores reacciones de PCR.

Condiciones de reacción para RAPD

Cinco iniciadores RAPD de las seriesA y D Operon® (Operon Technologies Inc, Alameda, CA, USA) se seleccionaron de un total de 25 (Cuadro 2). Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador Techne® TC-512. La mezcla de reacción se realizó en un volumen de 25 μL, que incluyó 4.2 μL de agua doble destilada estéril, 10 μL de dNTPs (500 μM), 2.5 μL de amortiguador 10X (Tris-HCl 750 mM, pH 8.8; (MD2S04 200 mM; Tween 20 a 1% (v/v)); 1.0 μL de MgCl₂ (50 mM); 3.0 uL de iniciador a una concentración de 10 pM; 0.3 μL de enzima Taq DNA polimerasa a una concentración de 5U μL^-1; y 4 μL de DNA genómico a una concentración de 10 ng μL^-1 .

Condiciones de reacción para ISSR

Para las reacciones ISSR, se usaron 5 iniciadores de un total de 10 probados (Cuadro 2). Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen y con reactivos semejantes a los RAPD excepto para las condiciones de reacción: 94 °C por 5 min, 35 ciclos a 94 °C por 30 s, temperatura especifica de alineamiento por 45 s y 72 °C por 2 min y un ciclo de extensión final a 72 °C por 10 min. La temperatura de alineamiento estuvo en un rango de 40 a 58 °C y los ciclos se redujeron a 30. Los fragmentos amplificados se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1.5 % (p/v) con amortiguador TAE (40 mM Tris-acetato, pH 7.6; 1 mM Na₂ EDTA), por 1 h a 120 V. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (0.5 mg mL^-1) por 15 min y el exceso de colorante se eliminó enjuagando en agua destilada por 15 min y documentados bajo luz UV. Las reacciones de amplificación se repitieron al menos dos veces.

Análisis de los datos

Todos los geles fueron evaluados para visualizar y registrar el número de bandas mono y polimórficas. La evaluación se llevó a cabo en forma cuidadosa e independiente por dos miembros del laboratorio. Bandas difusas o dudosas no fueron consideradas para el análisis. Se asumió que bandas del mismo peso molecular en diferentes individuos son idénticas. La presencia de una banda se indicó con un uno (1) y la ausencia con un cero (0).

El análisis de los datos se realizó utilizando los paquetes estadísticos NTSYS-pc versión 2.1 (Rohlf, 2000) y POPGEN32 (Yeh et al, 1999). Para estimar parámetros de polimorfismo a nivel de poblaciones la matriz de datos de presencia/ausencia se analizó con el programa POPGEN32. Los parámetros genéticos evaluados al nivel de poblaciones fueron el porcentaje de loci polimórficos entre cultivares (P), el coeficiente de diferenciación genética entre poblaciones (GST), el número de individuos migrantes (Nm) y el índice de identidad genética de Nei (1973).

Para describir la estructura genética y la variabilidad entre las poblaciones se realizó un análisis de varianza molecular no-paramétrica (AMOVA), por sus siglas en inglés, utilizando el programa GenAlEx 6.2 (Peakall y Smouse, 2006) con 999 permutaciones, donde los componentes de varianza se dividieron entre individuos, dentro de poblaciones, entre poblaciones dentro de regiones y entre regiones o grupos.

Patrones de iniciadores

Diez iniciadores (5 RAPD y 5 ISSR) se utilizaron para amplificar el DNA de 5 individuos de cada una de las 15 variedades de papa cultivadas en México (Cuadros 1 y 2). Se estudiaron 138 loci. El número promedio de bandas revelado por un iniciador dado fue de 13.8, oscilando entre 9 y 18 (Cuadro 2). El análisis de las variedades basado en RAPD e ISSR permitió estimar la similitud genética y las diferencias existentes entre los genotipos estudiados.

Análisis de agrupamientos

El análisis de grupos usando el coeficiente de similitud de Jaccard (Jaccard, 1908) separó a los cultivares en siete grupos diferentes (Figura 1). El primer grupo lo formaron Tollocan y Montserrat y fue el más divergente del resto de los cultivares. Ambas variedades han sido obtenidas por el INIFAP (Toluca y Saltillo, respectivamente) y ésta puede ser una razón del porqué la alta similitud existente entre ellas y la divergencia con las demás. Gigant formó el segundo grupo, Cambray Rosa Morelos y Cambray Rosa DF el tercero, Mondial constituyó el cuarto grupo, mientras que Criolla Edo Mex y Papa Chica formaron el quinto.

El sexto grupo lo integraron tres cultivares europeos (Alfa Grande,Armada y Fianna), mientras que el séptimo grupo se formó con el cultivar mexicano mej orado Mochis, variedades criollas con tubérculos de piel blanca (Cambray Blanca Edo. Mex. y Criolla Blanca Puebla) y Atlantic de Norteamérica. Éste último grupo relaciona las papas mexicanas y la americana, lo que parece asociarse mejor con los resultados señalados más adelante respecto a la diversidad entre grupos (Americano, Europeo y Mexicano). Además la variedad Atlantic parece formar un grupo intermedio entre un grupo de papas mexicanas y un grupo de papas europeas.

El uso de datos consenso de RAPD e ISSR diferenció con éxito a los cultivares de papa sembrados en México. Sin embargo, el análisis no agrupó completamente a los materiales en base a su origen geográfico. Algunos caracteres como el color de piel de los tubérculos fueron claramente agrupados en grupos separados. Esto se demuestra al observar que las variedades criollas con piel de tubérculo color rojo como Cambray Rosa Morelos, Cambray Rosa DF, Criolla Edo. Mex. y Papa Chica pertenecen a grupos separados de los cultivares y variedades criollas que tienen tubérculos con color de piel blanca. El coeficiente de similitud de Jaccard osciló entre 0.55 (para Cambray Rosa Morelos y Tollocan) y 0.89 (para Armada y Fianna) (Cuadro 3), lo que sugiere que los materiales evaluados están genéticamente medianamente relacionados dado que la diferencia entre uno y otro valor de similitud es de aproximadamente 0.34.

Si bien algunos cultivares europeos agruparon a los genotipos (Fianna, Armada y Alfa Grande), indicando alta similitud entre los mismos, no se puede ignorar la existencia de algún grado de diversidad genética en el 'pool' europeo debido a que el resto de los cultivares formó parte de otros grupos diferentes (Gigant y Mondial) (Figura 1). Estas variedades europeas son muy antiguas y algunas han sido empleadas en la formación de nuevas variedades. Hay una alta similitud entre ellas de 0.83 a 0.89 (Cuadro 3).

Entre las variedades criollas de México existe diversidad genética, esto quedó demostrado en virtud de que los cultivares con tubérculos con cubiertas blancas formaron grupos separados en relación a los cultivares con tubérculos con color de piel roja (Figura 1). Ispizua et al. (2007), reportaron alta (0.55) diversidad genética entre variedades criollas del noroeste de Argentina usando marcadores SSR. Tollocan y Montserrat, cultivares mejorados mexicanos fueron los más divergentes del resto de cultivares sembrados en México, con un valor de remuestreo igual a 100 (Figura 1). Entre Tollocan y Montserrat hay una similitud intermedia (0.64), lo que indica también cierto nivel de divergencia entre ellos. Estos dos cultivares podrían ser utilizados individualmente como progenitores adecuados en programas de mejoramiento para mejorar la diversidad genética.

El coeficiente de similitud más alto se obtuvo entre Fianna y Armada con un valor de 0.89 (Cuadro 3). Bornet et al. (2002) y Rousselle et al. (1996) reportaron alta similitud entre cultivares europeos debido a que han sido mejorados fuertemente y tienden a mostrar variabilidad genética baja. Lunga'ho et al. (2011) reportaron variabilidad genética baja entre accesiones de papa europeas comparadas con accesiones de Suramérica procedentes del Centro Internacional de la Papa (CIP) en Kenya.

En contraste, un coeficiente de similitud bajo se obtuvo entre Tollocan y Cambray Rosa Morelos con un valor de 0.55 (Cuadro 3). Tollocan es un cultivar mej orado mexicano mientras que Cambray Rosa Morelos es una variedad criolla, esto puede explicar la amplia variabilidad detectada. Estos resultados demuestran la existencia de amplia variabilidad genética dentro del 'pool' genético mexicano.

Tollocan y Montserrat se reportan con resistencia a tizón tardío. Debido a que Tollocan y Cambray Rosa Morelos son muy divergentes se podría utilizar a estas dos variedades como progenitores para iniciar un programa de mej oramiento genético en el que se introducirían algunas características interesantes del cultivar criollo al mejorado.

Diversidad genética y diferenciación

El porcentaje de loci polimórficos (P) entre los cultivares fue de 86.23%. El coeficiente de diferenciación genética entre los cultivares fue alto (G_ST= 0.71), e indica que aproximadamente 71% de la variación detectada puede atribuirse a diferencias entre los cultivares. El resto (29 %) representa diversidad genética dentro de cultivares. En base al coeficiente de diferenciación genética total entre los cultivares (GST) el nivel de flujo génico estimado (Nm) fue de 0.19. Esto indica que hay menos de un individuo migrante por generación entre las poblaciones, lo que también explica el alto nivel de diferenciación. Las actividades humanas, la adaptación a zonas agroecológicas, la distribución, colonización, sistema de apareamiento, tamaño de las poblaciones y el método de propagación a través de tubérculos-semilla afectan el nivel de diversidad genética entre y dentro de poblaciones (Hamrick y Godt, 1989, 1996; Sun et al, 1996, 1997; Sun y Wong, 2001; Yasmin et al., 2006).

El Análisis de varianza molecular (AMOVA), usando agrupamiento jerárquico en base a origen, poblaciones, e individuos dentro de poblaciones, reveló diferencias genéticas significativas (p<0.001) entre los tres grupos utilizados en este estudio (Cuadro 4). Una contribución de 7 % de la variabilidad genética total se puede atribuir a diferencias entre los grupos, la que puede acreditarse a los grupos 1 y 3, relacionados a 'pool' genéticos europeos y mexicanos, respectivamente (Cuadro 4). La contribución más alta a la variabilidad genética total (62%) puede atribuirse al componente de la variación entre poblaciones dentro de grupos. En todas las comparaciones de grupos la mayor variación se debe a la fuente entre poblaciones dentro de grupos (Cuadro 4), lo que significa que entre variedades hay diferencias y que en menor grado se obtuvieron diferencias entre individuos dentro de poblaciones y la situación es similar para todas las comparaciones entre todos los grupos y la comparación entre los tres grupos.

Los individuos dentro de las poblaciones contribuyeron con 31% de la variación genética total. Estos resultados sugieren que los 'pool' genéticos europeos y mexicanos pueden ser de gran importancia para proveer materiales superiores a programas de mejoramiento genético.

Esfahani et al. (2009) reportaron baja (5 %) pero significativa (p< 0.002) variabilidad genética atribuida a materiales de papa de origen americano y europeo cultivados en Irán. En adición, los mismos autores reportaron que la mayoría de la variabilidad genética puede acreditarse al componente entre poblaciones de papa. En contraste, Fu et al. (2009) demostraron la existencia de una reducida base genética en el germoplasma de papa de Canadá. Estos resultados realzan la importancia que tiene el analizar la estructura de las poblaciones para guiarse en la selección de materiales para el mejoramiento genético.

Al haber diferencias significativas entre grupos en los Cuadros 4 y 5 se detecta que existe variabilidad entre los grupos mexicano y europeo y sólo el grupo norteamericano no muestra tales diferencias, por lo tanto sí se presentan diferencias entre regiones, aunque también hay diferencias entre poblaciones.

El análisis de la diversidad genéticaAMOVA reveló diferencias significativas (p< 0.001) entre los tipos de cultivar. Estas diferencias contribuyeron con 6% de variabilidad genéticatotal (Cuadro 5). Las variedades criollas mexicanas mostraron un nivel relativamente alto (71 %) de diversidad genética entre los cultivares en comparación con los cultivares mejorados (64 %). Estos resultados sugieren que hay un alto nivel de diversidad genética entre las variedades criollas mexicanas que puede explotarse. La diversidad genética dentro de las poblaciones mexicanas fue más baja de lo esperado (29%) en comparación con los cultivares mejorados (36%). Probablemente las variedades criollas seleccionadas para este estudio pertenecen a aquellas más comúnmente cultivadas entre los agricultores locales, de tal modo que han sido sometidas a un proceso de selección a través de años que las ha hecho genéticamente más uniformes. Alternativamente, ello puede apuntar también a pérdida de genotipos debido a estrés biótico o abiótico, a actividades humanas, reemplazo por otros cultivos, migración de agricultores a otras zonas u otros factores.

Los cultivares mejorados de Europa fueronsignificativamente diferentes de los cultivares mejorados y variedades criollas mexicanos. El único cultivar de Norteamérica incluido en el presente estudio no fue significativamente diferente de los cultivares europeos y mexicanos (Cuadro 5). Tanto los cultivares mexicanos como los europeos han influido en gran proporción en la variabilidad genética atribuida al tipo de cultivar.

Debido a su rica diversidad, las variedades criollas necesitan conservarse y explotarse. Probablemente la conservación ex. situ es unabuena opción dado que en este estudio se encontró baja diversidad dentro de los genotipos (Han et al, 2007).

Conclusiones

Agradecimientos

El primer autor le agradece al Dr. Héctor Lozoya Saldaña del Departamento de Fitotecnia de la UniversidadAutónoma Chapingo (UACH), por proporcionar algunos materiales de papa.

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