Actinomicetos antagónicos contra hongos fitopatógenos de importancia agrícola*

Antagonistic actinomycetes against phytopathogenic fungi of agricultural importance

Miriam Desireé Dávila Medina¹, Gabriel Gallegos Morales¹, Francisco Daniel Hernández Castillo¹, Yisa María Ochoa Fuente¹ y Alberto Flores Olivas¹

¹Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro-Departamento de Parasitología. Buenavista, Saltillo, Coahuila. Bosques de Echegaray Núm. 2139, Fracc. El Olmo, Saltillo Coahuila C. P. 25280 (mdesiree77@hotmail.com.; ggalmor@uaaan.mx.; yisa8a@yahoo.com.; fdanielhc@hotmail.com.; afloli@.uaaan). Tel. 8444155875. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Buenavista, Saltillo, Coahuila. Tel. 8444 11 03 26. Autora para correspondiente: ggalmor@uaaan.mx.

* Recibido: diciembre de 2012
Aceptado: mayo de 2013

Resumen

El trabajo se realizó durante 2008 en Saltillo, Coahuila con el objetivo de aislar actinomicetos en diferentes medios de cultivo y evaluar su efecto antagonista in vitro contra hongos fitopatógenos de importancia económica. Para el aislamiento de los actinomicetos se realizaron muestreos de rizósfera de plantas, suelo, larvas y adultos de hormiga; las muestras se trataron con agua fenolizada y se sembraron por difusión en medios de cultivo artificial: Agar Dextrosa Papa (PDA), Agar Caseína Almidón (ACA),Agar de Actinomicetos (AA) y Agar Czapek Dox (ACD). Los aislamientos obtenidos se evaluaron preliminarmente por confrontación y observación. Se obtuvieron 70 aislamientos de actinomicetos en su mayoría de suelo; 25 presentaron efectos antagonistas, cuatro de ellos APA2, AASH48, AAH53 y APC70 se seleccionaron por su actividad inhibitoria y permanencia a través del tiempo. En los bioensayos de antibiosis in vitro contra hongos fitopatógenos como Alternaria sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp. y Colletotrichumsp. en los medios PDA y ACD, los efectos antagonistas (% -de inhibición) fueron diferentes estadísticamente (p= 0.05). Los mejores resultados de inhibición se obtuvieron con Streptomyces spp., APC70 contra Alternaria (57.6%); mientras que Streptomyces spp., AAH5 3 lo fue para Rhizoctonia, Fusarium y Colletotrichum en 53.08%, 49.36% y 61.57%, respectivamente. Los actinomicetos saprofitos mostraron potencial antagónico y actividad inhibitoria contra hongos fitopatógenos.

Palabras clave: antibiosis, antagonismo, confrontación, control biológico.

Abstract

The work was carried out during 2008 in Saltillo, Coahuila with the aim of isolating actinomycetes in different culture media and assess their in vitro antagonistic effect against plant pathogenic fungi of economic importance. For the isolation of actinomycetes we sampled rhizosphere of plants, soil, ant larvae and adults, the samples were treated with water and seeded phenolized diffusion in artificial culture media: Potato Dextrose Agar (PDA), Starch Casein Agar (ACA), Actinomycetes agar (AA) and Czapek Dox Agar (CDA). The isolates obtained were evaluated preliminarily by confrontation and observation. 70 isolates were obtained mainly from actinomycetes in soil; 25 showed antagonistic effects, four of them APA2, AASH48, AAH53 and APC70 were selected for their inhibitory activity and permanence over time. In vitro bioassays antibiosis against phytopathogenic fungi such as Alternaria sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp. and Colletotrichum sp. on PDA and ACD mediums, the antagonistic effects (%-inhibition) were statistically different (p= 0.05). The best results were obtained with inhibition of Streptomyces spp., APC70 against (57.6%); while Streptomyces spp., AAH53 was for Rhizoctonia, Fusarium and Colletotrichum in 53.08%, 49.36% and 61.57%, respectively. The saprophytic actinomycetes showed antagonistic potential and inhibitory activity against phytopathogenic fungi.

Introducción

En suelos agrícolas se encuentran hongos fitopatógenos tales como Alternaria spp., Fusarium spp., Rhizoctonia spp. y Colletotrichum spp., entre otros que atacan cultivos de importancia económica a nivel mundial, causando grandes pérdidas económicas (Gohelet al., 2006). Con las nuevas regulaciones y restricciones en el uso de plaguicidas y la demanda de productos orgánicos, crece el interés por el uso de tácticas alternativas a los fungicidas para el manejo de enfermedades, particularmente el uso de microorganismos benéficos, y sus metabolitos primarios y secundarios (Ezziyyani et al, 2004).

Actualmente, diversas investigaciones se han centrado en la búsqueda de nuevos antimicrobianos, principalmente de origen en actinomicetos, por su prolífica producción de antibióticos naturales y metabolitos secundarios (Oskay et al., 2004; Prashith et al, 2010).

Los actinomicetos son bacterias Gram-positivas y no ácido alcohol resistente, que se caracterizan por formar filamentos ramificados semejantes a los hongos, son saprofitos y sus células son procarióticas ; son quimioautótrofos que realizan respiración aeróbica o en algunos casos fermentativa (Bergey et al., 2000). Se caracterizan por no producir mucopolisacáridos, de ahí que se observen en placas de agar como colonias secas y no cremosas. Dentro de sus características particulares presentan un olor típico a suelo húmedo por la producción de un metabolito llamado "geosmina" (Ben-Omar et al, 1997). Los actinomicetos son abundantes y cosmopolitas en el ambiente, lagos, ríos, suelo y estiércol de animales; son aerobios y se ubican en la superficie del suelo, aunque también viven en los horizontes inferiores, en especial en suelos alcalinos (Betina, 1994).

Los productos de actinomicetos incluyen principalmente: antibióticos, antifúngicos, metabolitos, enzimas extracelulares (quitinasas, peroxidasas, glucanasas), inhibidores enzimáticos, neurotransmisores, terpenoides, pigmentos, anticancerígenos y pesticidas entre otros; presentan una alta actividad metabólica y son capaces de degradar la materia orgánica vegetal y animal, producen sideróforos, sustancias promotoras del crecimiento vegetal in vitro, ayudan a la asimilación del hierro en la fijación de nitrógeno, lo cual contribuye indirectamente a la promoción de crecimiento vegetal. El orden de los Actinomycetales constituye 63 géneros, constituyendo aproximadamente de 20-60% de la población microbiana del suelo (Crawford et al., 1993; Tokala et al, 2002; Ezziyyani et al, 2004; Franco-Correa et al, 2010).

El uso de estos organismos como agentes de control biológico de enfermedades radiculares es de gran interés en la actualidad, la presencia endofítica de Streptomyces sp., puede jugar importantes roles en el desarrollo y salud de plantas, ya que ellos pueden afectar el crecimiento de las mismas por la asimilación de nutrientes o por la producción de metabolitos secundarios (Behal, 2000; Tokala et al, 2002; Sánchez-Yáñez, et al., 2007).

Los actinomicetos producen diferentes tipos de metabolitos, por lo cual surgen como una prometedora fuente de controladores biológicos; de ahí la importancia de los objetivos de éste trabajo:

]]> a) aislamiento de actinomicetos de diversas fuentes naturales y en diferentes medios de cultivo artificial.

b) evaluación del antagonismo de éstos contra los hongos fitopatógenos Alternaria sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp. y Colletotrichum sp. El control microbiológico se plantea como una alternativa ecológica sin repercusión tóxica en el ser humano y con grandes perspectivas en el control de éstos patógenos.

Materiales y métodos

Aislamiento de actinomicetos: Se realizó un muestreo de suelo al azar de diferentes hortalizas, frutales y plantas silvestres (Cuadro 1), recolectando 30 g de muestra de la rizósfera, a una profundidad de 10 a 20 cm; también se recolectaron muestras de suelo de hormigueros, así como de adultos y larvas de hormigas, estas últimas como una fuente de actinomicetos antagónicos.

Las muestras de suelo se trataron con agua fenolizada por 30 min y posteriormente se difundió 1 mL en placas de Petri con diferentes medios de aislamiento como Agar Dextrosa Papa (PDA), Agar Caseína Almidón (ACA), Agar de Actinomicetos (AA) y Agar Czapek Dox (ACD). En el caso de hormigas adultos y larvas se colocaron directamente sobre los medios de cultivo. Las cajas se incubaron a 28 ± 2 °C durante 5 a 7 d. Se aislaron y purificaron actinomicetos en PDA de acuerdo a sus características morfológicas macroscópicas, colonias polvosas, secas que presenten halos de inhibición y en cuya observación microscópica mostraban filamentos característicos (Hayakawa et al, 2004).

Hongos fitopatógenos: los hongos fitopatógenos seleccionados por su importancia agrícola para los diferentes bioensayos de antibiosis fueron Alternaria sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp., y Colletotrichum sp., obtenidos de la colección de hongos fitopatógenos del Laboratorio de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Antonio Narro; los cuales fueron resembrados en PDA y conservados a 5 °C.

Pruebas preliminares de antibiosis in vitro: se realizaron pruebas preliminares de antibiosis de los actinomicetos contra dos hongos fitopatógenos seleccionados al azar, Alternaria sp., y Colletotrichum sp., con el fin de elegir aquellos que mostraran actividad antagónica. Para ello, una azada de cada actinomiceto se sembró en los cuatro puntos cardinales de una placa de Petri con PDA, colocando al centro un explante de 4mm de diámetro de crecimiento del hongo fitopatógeno. Las placas fueron incubadas a 28 ºC durante 5-10 d. Las pruebas preliminares fueron cualitativas por observación y duplicado, descartando los actinomicetos sin presentar halos de inhibición.

Bioensayos de antibiosis: con base en los resultados preliminares se seleccionaron cuatro actinomicetos que presentaron actividad antagonista y permanencia antibiótica a través del tiempo;APA2 (aislado de aire), AASH48 (aislado de suelo de hormiguero),AAH5 3 (aislado de adulto de hormiga) y APC70 (aislado de caña de azúcar). Éstos aislamientos se evaluaron por confrontación contra Alternaria sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp., y Colletotrichumsp. en PDA y ACD. Se sembró una azada de cada actinomiceto en los cuatro puntos cardinales de cada placa con cada medio de cultivo, colocando al centro un explante de 4mm de diámetro del hongo fitopatógeno para su ensayo de inhibición. Las placas se incubaron a 28 °C durante 5-10 d. Cada actinomiceto se tomó como un tratamiento con seis repeticiones (placas de Petri), con un testigo negativo para cada hongo. La antibiosis se cuantificó midiendo el diámetro del crecimiento fúngico con un Vernier digital (PlasticCaliper Modelo 700-130B) en los dos puntos cardinales referentes a la inhibición, reportándose el promedio por placa como una repetición.

Caracterización morfológica y bioquímica de actinomicetos: los aislamientos seleccionados se sembraron por triplicado en PDA y se incubaron a 28 °C por 8-15 d. Se identificaron teniendo en cuenta características macroscópicas de la colonia, coloración del micelio aéreo y sustrato, superficie, forma, tamaño, así como la producción de pigmentos. Para la identificación microscópica de género según Franco-Correa et al. (2009), se colocaron cubre-objetos estériles con una inclinación de 45 ° con respecto a la superficie del agar. Las placas se incubaron a 28 °C durante 8-15 d, al cabo de los cuales se tomaron las laminillas y se colocaron en un porta objetos con cristal violeta para la observación al microscopio compuesto. Se tuvieron en cuenta características observadas por tinción de Gram, como micelio aéreo y vegetativo, fragmentación del micelio en diferentes formas, agrupación de esporas, presencia de espirales, esporas terminales, en pares o grupos en el micelio y se compararon con las descritas en el Manual de Determinación Bacteriológica de Bergey (Bergey etal., 2000).

Análisis de datos: se utilizó un diseño estadístico completamente al azar con arreglo bifactorial y seis repeticiones, con un nivel de significancia de 95%. La unidad experimental consistió en una placa de Petri y la variable fue el diámetro de crecimiento del hongo, el factor A fue el aislamiento de actinomiceto en diferente medio de cultivo y el factor B fueron los hongos fitopatógenos. Para estratificar los resultados se realizó un análisis de varianza (ANVA) y una prueba de separación de medias según Tukey (p= 0.05).

Resultados y discusión

Aislamiento de actinomicetos: se recuperaron 150 aislamientos con características morfológicas semejantes a actinomicetos que presentaron inhibición contra hongos. De éstas 70 se confirmaron como actinomicetos de acuerdo a su morfología microscópica (Figura 1). La mayoría de los actinomicetos fueron obtenidos en su mayoría de suelo de plantas y hormigueros, recuperados en los medios PDA (49%), seguido de ACD (26%), ACA (14%), así como medio comercial para aislamiento de actinomicetos (11%) (Cuadro 2).

El método utilizado para el pretratamiento de muestras, elimina en gran cantidad bacterias y hongos contaminantes; sin embargo, sobrevivieron especies de Bacillus filamentosos semejantes a los actinomicetos resistentes al fenol, tal como lo reportan Hayakawa et al. (2004). Se observó que el mejor medio de cultivo para el aislamiento de actinomicetos de suelo fue el PDA seguido del ACD, debido a las diferencias nutricionales entre los medios de cultivo.

Bioensayos de antibiosis: los cuatro actinomicetos seleccionados presentaron altos niveles de inhibición contra los hongos fitopatógenos evaluados (Cuadro 3), siendo los mejores APC70 para Alternaria sp., con 57.6% de inhibición en ACD; AAH53 para Rhizoctonia sp. con 53.08% en ACD; AAH53 para Fusarium sp., con 49.36% en PDA y AAH53 para Colletotrichum sp., 61.57% en ACD (Figura 2).

Colletotrichum sp., fue el fitopatógeno que presentó los niveles más altos de inhibición, siendo el aislamiento AAH53 el más eficiente para el control de éste hongo; sin embargo, la mayoría de los actinomicetos mostraron niveles de antagonismo para este Deuteromiceto (= 50%). Gomes et al. (2000) en estudios previos reafirman que Streptomyces sp. presenta actividad antagonista contra Fusarium sp., F. solani, F. oxysporum, F. graminearum, Aspergillus parasiticus y Colletotrichum gloeosporioides. Al respecto Iznaga et al. (2003), reportaron cepas de actinomicetos aisladas de suelo, que producen componentes con actividad antifúngica, resultados similares al de este estudio. Whipps (2001) encontró que el medio de crecimiento artificial empleado genera efectos significativos en la morfología y en el desarrollo de los patógenos; asimismo, en la producción de antibióticos volátiles y no volátiles por los agentes antagonista sen respuesta a los agentes patógenos. Ezziyyani et al. (2004) demostraron que el grado de inhibición varía por factores como: la temperatura, el pH y el medio de cultivo empleado, demostrando que el medio PDA intensifica la inhibición. Esto puede explicar el motivo por el cual no concuerdan los resultados de antagonismo obtenidos contra Fusarium sp., comparado con otros estudios en donde se presentaron altos porcentajes de inhibición contra este hongo. Los fenómenos de antagonismo en hongos pueden ser explicados por diversos mecanismos incluyendo antibiosis y parasitismo, la inhibición en el crecimiento diametral del hongo y puede ser atribuido a la presencia de algunas sustancias inhibitorias excretadas por los actinomicetos.

Identificación morfológica y bioquímica: las colonias de las cepas seleccionadas presentaron bordes irregulares, consistencia dura y compacta, con diferentes pigmentos como gris, café y amarillo principalmente. Se observó una apariencia pulverulenta como consecuencia de la formación de largas cadenas de esporas originada por la subdivisión de la hifa aérea (Sylvia, 2005).

Respecto a la tinción de Gram, se obtuvieron bacterias filamentosas Gram positivas, con micelio vegetativo aéreo, tortuoso no fragmentado formando cadenas de esporas en espiral (adornos miceliales) y cadenas rectas largas de esporas (Figura 1). Las características macroscópicas y microscópicas fueron comparadas con las descritas por Bergey et al. (2000), encontrándose que los actinomicetos seleccionados mostraron morfológica y microscópicamente características específicas del género Streptomyces sp., así como el metabolismo bioquímico idéntico al género (Cuadro 4) (Koneman et al., 2008). (Bergey et al, 2000; Koneman et al, 2008).

A) antagonismo del aislamiento APA2 contra Alternaria sp.en ACD; B) antagonismo del aislamiento AASH48 contra Alternaria sp., en PDA; C) antagonismo del aislamiento AAH53 contra Rhizoctonia sp., en PDA; D) antagonismo del aislamiento AAH53 contra Alternaria sp., en ACD; E) antagonismo del aislamiento AASH48 contra Colletotrichum sp. en ACD; y F) antagonismo del aislamiento AAH53 contra Fusarium sp., en PDA.

Conclusiones

Se encontraron altos niveles de antagonismo de actinomicetos contra los hongos fitopatógenos Alternaria sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp. y Colletotrichum sp., la actividad varió conforme el asilamiento del streptomyceto y dependiendo del hongo confrontado. El suelo es una fuente abundante de actinomicetos con un alto potencial para ser desarrollados e implementados en los programas de control biológico de patógenos de cultivos de importancia económica y que son factibles de aislarse e incrementarse en el medio de cultivo PDA con alto grado de eficiencia.

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