Diversidad de frijoles nativos de diferentes regiones del estado de Puebla*

Native beans diversity of different regions from state of Puebla

Ana Rosa Ramírez-Pérez¹, Ramón Díaz-Ruiz^1§, Carmen Jacinto-Hernández², Juan Alberto Paredes-Sánchez¹ y Ramón Garza García³

¹ Colegio de Postgraduados, Campus Puebla, Carretera Federal México-Puebla, km 125.5. 72760, Puebla, Puebla. México. Tel: 01 (22) 2 85 00 13. (anarosa_rmz@yahoo.com.mx), (paredes52@colpos.mx). ^§Autor para correspondencia: dramon@colpos.mx.

³ Ex-investigador del Campo Experimental Valle de México, INIFAP. (rgarzagarcia@yahoo.com.mx).

* Recibido: julio de 2011
Aceptado: enero de 2012

Resumen

El frijol común representa un cultivo básico en México con una gran variabilidad en sus características morfológicas. En estudios sobre la diversidad genética se han usado marcadores moleculares, entre los que se encuentran los RAPD. El presente trabajo tuvo como objetivo caracterizar mediante caracteres morfológicos, agronómicos, de calidad y marcadores RAPD, variedades de frijoles nativos cultivadas en diferentes comunidades del estado de Puebla. La extracción de ADN se realizó en una muestra de hojas jóvenes de las variedades sembradas bajo invernadero. Se utilizaron 7 iniciadores RAPDs de la serie OPERON Technologies. Las bandas polimórficas se codificaron por presencia y ausencia. Con el programa NTSYS pc 2.2 se generó un dendograma empleando el índice de similitud de Dice, con nivel de corte a un valor de 0.48, donde se definieron 13 grupos. Seis grupos estuvieron integrados por una variedad, 4 grupos por 2 variedades, 2 grupos por 3 variedades y un grupo formado por 7 variedades. Los grupos definidos se integraron por colores de grano distintos y coincidieron en otras características morfológicas como días a floración, tiempo de cocción y contenido de proteína.

Palabras clave: Phaseolus vulgaris L., calidad culinaria, marcadores moleculares, variedades nativas.

Common bean is basic crop in Mexico with great variability in its morphological characteristics. RAPD is among molecular markers, which have been used in studies about genetic diversity. The aim of this work was to characterize by morphological, agronomical, quality characters and RAPD markers the varieties harvested in different localities from state of Puebla. DNA extraction was made from sample of young leaves of varieties planted under greenhouse. 7 RAPDs starters from OPERON Technologies were used. Polymorphical bands were coded by presence and absence. With NTSYS pc 2.2 software dendrogram was created using Dice's similarity index, with cut level at value of 0.48 where 13 groups were defined. Six groups were comprised by single variety, 4 groups by 2 varieties, 2 groups by 3 varieties and one group by 7 varieties. The defined groups were comprised by different grain colors and coincided in other morphological characteristics like days to flowering, cooking time and protein content.

Key words: Phaseolus vulgaris L., food quality, molecular markers, native varieties.

Introducción

La conservación y utilización de los recursos genéticos es de importancia estratégica para la humanidad. Las regiones centro y sudamérica son consideradas como los centros de mayor diversidad biológica del mundo; de hecho varias especies de importancia agrícola, agroindustrial, medicinal y farmacológica se han originado en estas regiones En las últimas décadas esta diversidad se ha visto severamente reducida por las exigencias del mercado y la disminución de los suelos cultivados. Ante esta situación, uno de los desafíos actuales es buscar la manera de incentivar la conservación y uso racional de los recursos genéticos (Becerra y Paredes, 2000).

En nuestro país la diversidad de frijoles es amplia y este cultivo es básico en la alimentación de los mexicanos. Puebla es uno de los estados con mayor diversidad (Cárdenas, 1989), la cual requiere ser caracterizada con el fin de aprovecharla para satisfacer las necesidades de los productores y consumidores. Recientemente, la caracterización morfológica se ha reforzado con la utilización de marcadores moleculares. La descripción de las variedades a nivel de ADN proporciona información al fitomejorador para que seleccione progenitores que contengan genes de interés. Los marcadores moleculares tienen ventajas sobre los marcadores morfológicos tales como la abundancia en una población segregante, son neutros y no son afectados por el ambiente (Nuez et al., 2000).

Entre los marcadores genéticos moleculares utilizados en los estudios de caracterización se encuentran los RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) los cuales son marcadores dominantes y el polimorfismo entre los individuos resulta de los cambios en las secuencias en uno o ambos lados del genoma reconocidos por un iniciador lo cual se traduce en la presencia o ausencia de bandas (Rafalski et al., 1994). Uno de los usos de los RAPDs es estimar el grado de similitud entre genotipos, con lo cual se pueden estimar relaciones genéticas (Beebe et al., 1995; Skroch et al., 1998; Beebe et al., 2000; Emygdio et al., 2003; Guachambala y Rosas, 2010); lo anterior resulta de gran utilidad para conocer la diversidad que existe aún entre genotipos con caracteres morfológicos semejantes, así como también se ha buscado asociarlo con otros atributos de interés para una posible selección asistida (Kelly y Miklas, 1998; Jacinto et al., 2003) y que podría ser aprovechada en los programas de mejoramiento.

Otro parámetro importante en la caracterización del germoplasma de frijol es la calidad del grano para consumo. Se prefieren variedades de rápida cocción, con caldo espeso. Asimismo, es necesario considerar el contenido de proteína de los genotipos, pues aunque en general las leguminosas son buenas fuentes de proteína, el contar con variedades de alto contenido permite mejorar el aporte diario a los consumidores(as) de este grano básico. La importancia del frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en tiempos precortesianos era tal que, de acuerdo con el Códice Mendocino, los aztecas lo incluían en los tributos exigidos a otros pueblos y nunca desapareció de la dieta nacional durante los 500 años que siguieron. De ese modo ha sido, junto con el maíz, el alimento básico de México y, además de su importante contenido de carbohidratos y minerales, se considera la principal fuente de proteínas vegetales en la dieta. Su papel es aún más significativo para las clases de menores recursos que, al no tener acceso a proteínas de origen animal, hallan en el frijol esos nutrimentos esenciales (Muñoz, 2010)

En el pasado, los programas de mejoramiento genético del frijol enfocaban sus esfuerzos a la obtención de materiales con buenas características agronómicas, como alto rendimiento por hectárea, resistencia a condiciones ambientales adversas y patógenos, de ciclo vegetativo corto y uniformidad de planta y grano (Navarro, 1983). Sin embargo, la demanda de los consumidores ha motivado el desarrollo de variedades con mejor calidad nutrimental y de cocción (Jacinto et al., 2002).Las características físico-químicas del grano, como tamaño, color y uniformidad, sabor, tiempo de cocción, y contenido de proteína, se relacionan con mejor calidad culinaria y nutricional del frijol y son importantes para los consumidores en México (Castellanos et al., 1997).

Materiales y métodos

De cien variedades previamente evaluadas en campo, se seleccionaron 36 que expresaron mejor rendimiento de grano (mayor a 1 t ha-¹). Estas variedades se sembraron bajo condiciones de invernadero; de 27 de ellas se obtuvo tejido vegetal para el estudio de marcadores RAPD y 25 se desarrollaron satisfactoriamente y se obtuvo grano para el estudio.

Vivero establecido en campo

El arreglo experimental se realizó bajo un diseño de látice 10 x10 con tres repeticiones. La unidad experimental se integró por cuatro surcos de cinco metros de largo separados a 0.70 m. Cada ensayo abarcó 3 000 m² de superficie. La fertilización se hizo con la fórmula 40-40-00 en dos partes, la primera fue en la siembra tirando todo el fósforo y la mitad del nitrógeno y la segunda se realizó en la primera labor agregando el resto de nitrógeno. Se sembraron las 100 variedades colectadas, en las cuales se eligieron las semillas más comunes en tamaño, forma y color de cada una de las colectas para evitar un efecto de tales caracteres en el desarrollo de las plantas.

Variables de estudio

Las variables que se cuantificaron fueron: número de vainas, longitud de las vainas: ancho y grosor de vainas, peso de vainas totales y peso de grano.

Vivero establecido en invernadero

De las 100 variedades evaluadas en campo se seleccionaron las que expresaron mejor los caracteres agronómicos de interés para los agricultores como son la precocidad y el rendimiento de grano y sus componentes. Así también, se consideraron los caracteres culinarios de los frijoles mayor y menor contenido de proteína, menor y mayor tiempo de cocción del grano, alta y baja cantidad de proteínas. Estos análisis fueron realizados a las colectas previamente. La descripción morfológica de las variedades se realizó en invernadero cubierto por una malla antiáfidos con el objeto de tener mayor control del experimento y un registro continuo de las variables de estudio.

Las variables de estudio consideradas fueron las siguientes:

Días a emergencia, longitud del hipocótilo y epicótilo, diámetro del hipocótilo, altura total de la planta, hábito de crecimiento. Se registró por observación de acuerdo a los cuatro hábitos de crecimiento presentados en la guía de descriptores para frijol, IPGRI, 2001, edad a la aparición del primer botón floral, apertura de la primera flor, edad a la formación del primer fruto, tamaño de las flores, longitud, grosor y ancho de vainas -el ancho y grosor fue tomado en la parte central del fruto- número de vainas, número de granos por vaina y por planta, número de ramas, número de nudos y entrenudos, peso seco de las vainas y de granos, color de flores, intensidad del color en flores y vainas, forma de la vaina, color del grano y forma del grano.

Caracteres culinarios

Tiempo de cocción. Se determinó colocando muestras de 25 granos, las cuales fueron previamente remojadas durante 18 h en 70 ml de agua destilada. La cocción se realizó en vasos tipo Berzelius con agua destilada hirviendo. El tiempo se registró a partir del reinicio de la ebullición, después de haber colocado los frijoles y hasta que el grano alcanzó una textura granular suave percibida a través de una prueba sensorial entre los dedos índice y pulgar. La determinación se realizó por duplicado.

Porcentaje de sólidos en el caldo de cocción. Se determinó por duplicado, colocando una alícuota de 10 ml de caldo en vasos de precipitado con capacidad para 50 ml, los cuales fueron llevados previamente a peso constante. Una vez pesado el vaso con la alícuota, se colocó en un horno a 60 °C, en donde se evaporó el líquido y se pesó el vaso con los sólidos, ya secos. El porcentaje de sólidos se estimó por diferencia de peso mediante la siguiente fórmula propuesta por Guzmán-Maldonado et al. (1995).

Contenido de proteína. Se determinó de acuerdo al método Kjeldahl (AOAC 1984), utilizando el equipo semiautomatizado Kjeltec-1030. A las muestras de 400 mg de frijol molido se les agregó ácido sulfúrico y como catalizador, mezcla reactiva de selenio. Se colocaron en tubos de 250 ml, los cuales se acomodaron en el módulo de digestión del equipo Kjeltec, el cual consta de un block de aluminio y un sistema de extracción de vapores. El tiempo de digestión fue de una hora a 360 °C. Las muestras digeridas se diluyeron con agua y posteriormente, en el módulo de destilación del equipo, fueron tituladas con ácido clorhídrico 0.1 N. El porcentaje de proteína se calculó con la siguiente fórmula.

Amplificación de ADN

Se utilizaron 13 iniciadores RAPDs de la serie OPERON Technologies (Alameda Calif.) con longitud de 10 pares de bases. Las condiciones de amplificación se basaron en la metodología propuesta por Williams et al. (1990).

Las reacciones de PCR se hicieron en un volumen final de 20µL. La mezcla de reacción para RAPD consistió de 32 ng de ADN genómico, 0.9 U de enzima Taq DNA polimerasa (Amplificasa®) y buffer IX, 0.8µM de iniciador, 200uM de dNTPs (Invitrogen) y 1. 8mM de MgCl₂. La amplificación se realizó en un termociclador Techne TC-520 con el programa presentado en el Cuadro 1.

La separación de los fragmentos amplificados se hizo por electroforesis en geles de agarosa al 1.4%. El revelado de las bandas se hizo con bromuro de etidio y se observaron bajo luz ultravioleta en un transiluminador Upland modelo TS-20. La imagen se capturó con un fotodocumentador Gel Logic de Kodak®.

Resultados y discusión

Características agronómicas y culinarias

Al agrupar las accesiones por color de grano el intervalo de días a floración fue de 44 a 49 días, los frijoles amarillos y crema fueron más precoces y las mezclas las más tardías, seguidas del color castaño y rosa (Cuadro 2). Los frijoles negros fueron intermedios por presentar un valor de 45 días. El intervalo de floración de todas las accesiones fluctuó entre 41 y 5 7 días, donde la variedad V93, de color de grano castaño, fue la más tardía y las variedades V8 y V62, de color amarillo, fueron las más precoces.

Las accesiones de grano negro, amarillo, crema y rosa mostraron hábito de crecimiento tipo 2, indeterminado arbustivo; mientras que las accesiones de color castaño y las mezclas de color mostraron hábito tipo 3, de crecimiento indeterminado postrado. Los frijoles de hábito tipo 3 fueron los que presentaron un mayor peso de 100 granos.

El intervalo en tiempo de cocción fluctuó entre 51 y 107 min, los de mayor tiempo de cocción fueron los frijoles castaños y los más rápidos los color crema (Cuadro 3). El 83% de las accesiones presentó suavidad a la cocción de acuerdo a la escala mostrada por Jacinto et al. (2002); es decir, tiempo de cocción menor a 70 min, sólo los de color castaño presentaron dureza a la cocción (107 min). Las variedades de la población más suaves al cocimiento fueron la V52 de color amarillo y V100, que es una mezcla, con un tiempo de 50 min. Asimismo, las de mayor dureza fueron la V93 (141 min) y V91 (13 2 min) ambas de color castaño.

La cantidad de sólidos en el caldo fue diferente en cada color de grano. Sobresalieron los castaños con 0.61% y los de menor cantidad fueron los frijoles rosa (0.30%) y crema (0.33%) (Cuadro 3). En la población de frijoles, las variedades con mayor cantidad de sólidos pertenecen al color castaño identificadas como V91 (0.91%) y V93 (0.78%). Estas variedades presentaron también mayor dureza a la cocción, aparentemente en las accesiones de color castaño el mayor tiempo de cocción permite al frijol liberar más sólidos al caldo, dando por resultado un caldo más espeso. Las variedades con menor contenido de sólidos fueron la V77 (0.22%) y la V13 (0.24%) de color amarillo, con tiempos de cocción de 61 y 59 min respectivamente.

En contenido de proteína, el intervalo fue de 17.9 a 25% por color de grano. Los frijoles negros presentaron mayor cantidad (25%), seguidos del color amarillo (Cuadro 3). El menor contenido se registró en el color rosa (17.9%). En general, los demás colores contienen más de 20%, lo que significa que están en el promedio reportado para frijol (Nadal et al., 2004). En la población de frijoles, las variedades con mayor contenido de proteína fueron la V90 (29.3%) de color negro y la V8 (27.2%) de color amarillo, mientras que las de menor contenido fueron la V3 (16.3%) que es una mezcla y V118 (17.7%) de color amarillo.

Correlaciones entre características agronómicas y culinarias

En las correlaciones obtenidas con el paquete estadístico SAS, el color de grano no presentó correlación significativa con ninguna característica agronómica o culinaria (Cuadro 4). Los días a inicio de floración tuvieron correlación negativa altamente significativa con el rendimiento de grano por planta (r= -0.59* *), con el hábito de crecimiento la correlación fue positiva altamente significativa (r= 0.5 6* *), al igual que con el tiempo de cocción (r= 0.54**). Esto indica que las variedades precoces tendieron a presentar rendimiento mayor que las tardías y la tendencia a consumir menos tiempo en el cocimiento del grano.

El peso de 100 granos expresó correlación significativa y positiva con el hábito de crecimiento (r= 0.43*) y el tiempo de cocción (r= 0.45*) y con el contenido de sólidos fue altamente significativa y positiva (r= 0.83**). El tiempo de cocción del grano expresó correlación positiva con la cantidad de sólidos en el grano la cual fue altamente significativa (r= 0.70* *) (Cuadro 4), esto significa que los granos más grandes requieren más tiempo para que el agua penetre al interior y cueza el grano. Asimismo el permanecer más tiempo en el agua en ebullición les permite liberar una mayor concentración de sólidos en el caldo de cocción (Jacinto et al., 2002).

El rendimiento de grano se correlacionó con el hábito de crecimiento con una tendencia negativa altamente significativa (r= -0.67**) (Cuadro 4). Entre el rendimiento de grano y el contenido de proteína no existió asociación, aun cuando existen estudios que señalan que a mayor rendimiento menor contenido de proteína (Osborne, 1988 y Bollini et al., 1999).

Las accesiones de hábito 3 tendieron a mostrar mayor contenido de sólidos (r= 0.45*). No se detectó asociación entre el hábito de crecimiento con el contenido de proteína (Cuadro 4). La cantidad de proteína en el grano no presentó correlación alguna con las características agronómicas y culinarias estudiadas, a diferencia de Allende et al. (2006) quienes detectaron correlación negativa entre el contenido de proteína cruda y los días a floración en variedades mejoradas de frijol. La proteína es un carácter que amerita trabajo de selección genética, por su importancia en la nutrición para buscar o formar variedades con alto contenido de proteína.

De los 13 iniciadores que se ensayaron, solamente siete revelaron polimorfismo, lo cual representa 53.8%. Los iniciadores que detectaron polimorfismo fueron OPC-19, OPN-13, OPL-11, OPF-06, OPG-17, OPF-10 y OPAE-19. Se identificaron 21 bandas polimórficas distribuidas de la siguiente manera: seis bandas para OPL-11y OPF-10, tres bandas para OPN-13, dos bandas para OPC-19 y OPF-06, mientras que OPG-17 y OPAE-19 fueron monomórficos. Con los patrones electroforéticos obtenidos se construyó una matriz de presencia-ausencia con las bandas polimórficas.

Agrupamiento de variedades

Con el programa NTSYS pc 2. 2, empleando el coeficiente de Dice, con nivel de corte igual a 0.48, generó un dendograma donde se definieron 13 grupos (Figura 1).

El grupo I se integró por la V3 perteneciente a una mezcla de frijoles y la V118. Estas variedades son similares en bajo contenido de proteína (16.3 y 17.7% respectivamente), en tiempo de cocción rápido (55 y 67 min respectivamente) y en peso de 100 granos igual a 24.6 g en promedio. El grupo II se formó también con dos variedades similares en tiempo de cocción igual a 83 min en promedio, por lo que son considerados frijoles de cocción intermedia. El grupo III presentó el mayor número de variedades (7), las cuales fueron similares en los caracteres días a floración y tiempo de cocción. La diferencia en floración entre estas variedades fue de 2 días. Las variedades de este grupo mostraron corto tiempo de cocción; en promedio 61 min.

En el grupo IV se ubicó únicamente la V93 que sobresalió por mostrar el tiempo de cocción más prolongado (141 min); por lo que se considera un frijol duro al cocimiento (Jacinto et al, 2002). Asimismo, fue de los más tardíos en días a floración (57 días) pero sobresalió en un mayor peso de 100 granos (50.1 g). En el grupo V se registraron tres variedades la V52, V74 y V100 unidas por los caracteres como días a floración (de 43 a 50 días), peso de 100 granos (35.3 a 38.5 g), tiempo de cocción intermedia (50 a 70 min) y contenido de proteína promedio de (21.4 a 23.4 %). El grupo VI está conformado por las variedades V13 y V69 las cuales tienen similitud en días a floración (44 y 48 días respectivamente) y son suaves a la cocción con un tiempo de 6 1min en promedio. En el grupo VII se ubica únicamente a la V76, la cual presentó 42 días a floración, peso en cien semillas de 47.4 g, es suave a la cocción (en 67 min) y contiene 21.9% de proteína. En el grupo VIII se ubicaron las variedades V3 0, V91 y V116, con características similares en días a floración (de 44 a 45 días) y en contenido de proteína de (de 22.7 a 24.7%). El grupo IX únicamente lo integra la variedad V8, la cual llega a floración a los 41 días, el peso de cien semillas es 37.2 g, se incluye entre los frijoles blandos con tiempo de cocción igual a 61 min y contiene 27.1% de proteína. Es probable que su alto contenido de proteína la aisle como un grupo. La V 114 integra el grupo X, se caracteriza por llegar a floración a los 43 días, cien semillas pesan 36.7 g, es suave a la cocción (61 min) y tiene 24.3% de proteína.

Integran el grupo XI las variedades V19 y V62, con similitud en las características edad a floración a los 46 y 41 días en promedio, 39.2 g en promedio de peso en cien semillas, ambas son suaves a la cocción (58 min en promedio), contenido de proteína de 25y 23.8% respectivamente y ambas son de color de semilla amarillo. Este grupo fue el que abarcó más características similares. El grupo XII está formado por la variedad V54, la cual a los 44 días está en floración, tiene un peso 26.8 g en cien semillas, es suave a la cocción (58 min) y su contenido de proteína es 25.2%. En el grupo XIII lo integra solamente la variedad Peruano, de color se semilla amarilla, floración a los 42 días y con contenido de proteína de 21.83%. La integración como un grupo se puede deber a que es una variedad comercial con características propias. En la conformación de los grupos de variedades de frijol mediante el coeficiente de Dice, no fue determinante el lugar geográfico donde se realizaron las colectas ni el color del grano. Las características que más influyeron en la integración de los grupos fueron la edad a floración, tiempo de cocción y contenido de proteína. Sin embargo en los grupos con mayor número de variedades hay un color de grano predominante. Esta tendencia ha sido reportada por Miranda et al. (2006) en frijoles criollos de Cuba. Sin embargo, también encontraron agrupamientos de frijoles de diferentes colores. En otras regiones de México, como Hidalgo se han registrado diferencias en los frijoles nativos en tiempo de cocción y contenido de proteínas principalmente (Muñoz et al., 2009). En los estados de México, Veracruz y Puebla se reporta mayor diversidad genética atribuida a la amplitud de nichos ecológicos y a la diversidad de condiciones climáticas y edáficas existentes (Avendaño et al., 2004). Por el contrario, Vidal et al. (2006) mostraron la existencia de poca variabilidad genética dentro de genotipos de frijol negro en Tabasco, de acuerdo con los autores se debe a que es una zona considerada con poca diversidad de frijol en el país.

Estudios realizados con isoenzimas en frijoles negros provenientes de regiones distintas de México determinaron 68.7% de polimorfismo (Avendaño et al., 2004), lo cual indica que el color de grano no es determinante en la similitud de una especie, sino que también hay otros caracteres implicados en la variabilidad genética de los genotipos. De igual forma, Vidal et al. (2006) encontraron agrupamientos de variedades de frijol realizados mediante RAPD-ISSR que no mostraron asociación con características morfológicas.

Guachambala y Rosas (2010), en el dendograma generado del análisis molecular de frijol en Honduras encontraron dos situaciones contrastantes en similitud genética y lugares de recolección, en un caso forman un grupo con un coeficiente de similitud de 0.95 donde las accesiones fueron colectadas de comunidades muy cercanas y que son muy similares y otro caso donde forman otro grupo accesiones que presentan alta similitud genética con un coeficiente de similitud de 0.96, pero son de origen distante.

En la presente investigación, el uso de marcadores RAPD permitió identificar grupos de frijoles con características culinarias que los productores de frijol desean encontrar en los frijoles que cultivan. De esta manera, se está en condiciones de seleccionar los frijoles con precocidad significativa, blandos al cocimiento y contenido de proteína alto. Se realizarán ensayos en diferentes localidades y se medirán los atributos de calidad para confirmar los resultados obtenidos en esta investigación y poder así seleccionar variedades nativas para iniciar un programa de mejoramiento que futuro pueda orientarse hacia la selección asistida con marcadores moleculares.

Conclusiones

La diversidad de las accesiones se registró en los días a floración, peso de 100 granos, y rendimiento por planta. Los frijoles castaños fueron los más tardíos (48 días), tuvieron el mayor peso de 100 granos (45.5 g) y el mayor rendimiento por planta (21 g). El frijol de color rosa mostró el menor peso de 100 granos.

Las accesiones estudiadas mostraron variación en el contenido de proteína, donde los frijoles de color negro mostraron mayor contenido (25%) y el color rosa la menor cantidad (17.9%). En tiempo de cocción los frijoles castaños fueron los más duros (107 min) y con mayor contenido de sólidos en el caldo de cocción, mientras que el de color rosa fue el más suave (51 min) y caldo menos espeso..

La técnica RAPD, resultó eficiente en la formación de grupos de variedades con caracteres morfológicos similares.

Se formaron en total 13 grupos con distinto número de variedades que fue desde una hasta siete. Los grupos tuvieron similitud en precocidad, tiempo de cocción, contenido de proteína y pe so de 100 granos.

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