Propagación in vitro de Laelia halbingeriana*

In vitro propagation of Laelia halbingeriana

Yurixhi Atenea Raya-Montaño^1§, Guillermo Carrillo-Castañeda¹, Martha Elena Pedraza-Santos², Tarsicio Corona-Torres¹, José Alfredo Carrillo-Salazar¹ y Gabriel Alcantar-González³

¹ Genética. Colegio de Posgraduados. Carretera México-Texcoco, km 36.5. Montecillo, Texcoco, Estado de México. C. P. 56230. Tel. 01 452 5233858 y 01 595 9520200. Ext. 1541, 1569 y 1593. (carrillo@colpos.mx), (tcoronat@colpos.mx), (asalazar@colpos.mx). ^§Autora para correspondencia: atenea@colpos.mx.

³ Edafologia. Colegio de Posgraduados. Carretera México-Texcoco, km 36.5. Montecillo, Texcoco, Estado de México. C. P. 56230. Tel. 01 595 9520200. Ext. 1188.

* Recibido: abril de 2011
Aceptado: agosto de 2011

Resumen

Laelia halbingeriana (Orchidaceae) es una planta epífita endémica de la cañada de Oaxaca, amenazada por la reducción de su hábitat debido a deforestación, cambios de uso de suelo, extracción ilegal de plantas. Se desarrolló una metodología en el Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas en 2010, para su propagación in vitro como estrategia de conservación usando el medio Murashige Skoog (MS) suplementado con 6-benciladenina (BA) (0, 2.22 y 4.43 µM L^-1) y 3-ácido naftalenacético (ANA) (0, 2.6, 5.2 y 10.4 µM L^-1). Con estos medios fueron cultivadas plántulas de 2.5 cm con tres concentraciones de sacarosa (58.43, 87.64 y 116.85 mM L^-1) y cinco de sales minerales del medio MS (50, 75, 100, 125 y 150%). Para el enraizamiento, las plántulas fueron cultivadas en medio MS suplementado con cinco concentraciones de ANA (0, 2.6, 7.8, 10.4 y 13 µM L^-1) y cinco de ácido 3-indolbutirico (AIB) (0,4.92, 7.38, 9.84 y 12.3 µML¹). Se utilizó el diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial y diez repeticiones. En la multiplicación, el BA (2.22 µM L^-1) incrementó el número promedio de hojas por planta (3.93), mientras que la mayor longitud (1.11 cm) se logró al adicionar ANA (5.2 µM L^-1). La concentración de azúcar y las sales minerales no influyeron en la organogénesis in vitro de L. halbingeriana. El enraizamiento presento mayor número de raíces por planta (2.62), se obtuvo reduciendo las sales minerales a 75%, la adición de 7.8 µM L^-1de ANA incrementó el número de raíces (2.86).

Palabras clave: Orchidaceae, fitoreguladores, sales minerales.

Laelia halbingeriana (Orchidaceae) is an epiphytic plant, endemic from Oaxaca's glen, threatened by its habitat shrinking due to deforestation, land-use changes and, illegal plant extraction. A methodology was developed in the Graduated College in Agricultural Sciences in 2010, for its in vitro propagation as a conservation strategy using Murashige and Skoog medium (MS) supplemented with 6-benzyladenine (BA) (0, 2.22 and 4.43 µM L^-1) and 3-naphthaleneacetic acid (NAA) (0, 2.6, 5.2 and 10.4 µM L^-1). With these media, seedlings of 2.5 cm with three concentrations of sucrose were grown (58.43, 87.64 and 116.85 µM L^-1) and five mineral salts of MS medium (50, 75, 100, 125 and 150%). For rooting, the seedlings were grown on MS medium supplemented with five concentrations of NAA (0, 2.6, 7.8, 10.4 and 13 µM L^-1) and five 3-indole butyric acid (IBA) (0, 4.92, 7.38, 9.84 and 12.3 µML¹). A completely randomized design with factorial arrangement and ten repetitions was used. In the multiplication, BA (2.22 µM L^-1) increased the average number of leaves per plant (3.93), while the longest (1.11 cm) was achieved by adding NAA (5.2 µM L-¹). The sugar and mineral salts concentration did not influenced the in vitro organogenesis of L. halbingeriana. Rooting showed higher number of roots per plant (2.62), obtained by reducing 75% of mineral salts, the addition of 7.8 µM L^-1 of NAA increased the number of roots (2.86).

Key words: Orchidaceae, mineral salts, phytoregulators.

INTRODUCCIÓN

Laelia halbingeriana es una planta epifita endémica de la cañada de Oaxaca, en la reserva de la biosfera Tehuacán-Cuicatlán, amenazada por la reducción de su hábitat debido a factores como la deforestación, cambios de uso del suelo y extracción ilegal de plantas (Hángsater et al., 2005) que aumenta el riesgo de la desaparición. Existen muy pocos estudios acerca de su reproducción. En este tipo de plantas, la reproducción sexual de forma natural es limitada, debido a la naturaleza de la semilla (tamaño pequeño con poca o nula materia de reserva), por lo que la germinación así como los estados de desarrollo subsecuentes dependen de la relación simbiótica con un hongo micorrízico (Rhizoctonia solani) (Suárez et al., 2006; Otero et al., 2007; Mosquera et al., 2010). Porras-Alfaro y Bayman et al. (2007) señalan que cada especie tiene una especificidad por el hongo micorrizico.

La germinación de semillas in vitro es una alternativa de reproducción viable, pues es posible sustituir la acción de los hongos micorrízicos con el medio de cultivo (Gil et al., 2007; Otero y Bayman, 2009). Mediante este método se logra incrementar la variabilidad genética de la especie. Para la propagación de orquídeas, se han estudiado los medios de cultivo mínimos, la constitución de reguladores de crecimiento así como la acción benéfica de la peptona y el carbón activo entre otros aditivos (Ouyang et al., 2006); sin embargo, la respuesta morfogénica de los tejidos dependen del tipo y concentración de los reguladores de crecimiento.

Para la propagación de orquídeas se han empleado citocininas naturales 2-isopenteniladenina (2iP), zeatina, citocininas sintéticas N6-benciladenina (BA) y la cinetina (6-furfuril-aminopurina), en concentraciones de 0.01 a 10 mg L^-1; donde esta última es la menos eficiente de las cuatro. También se ha postulado que la concentración de sales minerales y de sacarosa, son factores determinantes en el proceso de organogénesis in vitro de estas plantas (Sorace et al., 2008). La mayor formación de plántulas in vitro de L. speciosa fue lograda por Sarabia et al. (2010), al adicionar al medio de cultivo ANA (0.5 mg L^-1) y ácido giberélico (AG₃) (0.1 mg L^-1) quienes obtuvieron 70% de supervivencia al ser aclimatadas.

Aunque ya se han establecido metodologías para la propagación in vitro de orquídea de diferentes géneros, existen pocos estudios en L. halbingeriana, por lo que es factible modificar las condiciones conocidas, para mejorar los resultados de la micropropagación como una estrategia inicial, para asegurar posteriormente la conservación en su ambiente natural. Basados en lo expuesto previamente, el objetivo de la presente investigación fue establecer un método práctico y competitivo para propagar in vitro L. halbingeriana.

Multiplicación de plántulas

Plántulas de L. halbingeriana cultivadas in vitro fueron proporcionadas por el Dr. Raymundo Enríquez del Valle, provenientes del laboratorio de cultivo de tejidos del Instituto Tecnológico Agropecuario de Oaxaca (ITAO).

Medios de cultivo

El medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962) fue utilizado como base de los medios preparados; todos los medios de cultivo contenían 2.96 µM de tiamina, 5.55 µM de mio-inositol, 6 g L^-1 de agar (Merck®) y el pH fue ajustado a 5.7 ±0.1 antes de agregar el agar. El medio se esterilizó a 121 °C (1.05 kg cm^-2) durante 17 min. Todas las cantidades expresadas en la composición de los medios están dadas por litro de medio, a menos que otra cosa sea indicada.

Las plántulas fueron originalmente cultivadas en una serie de 12 medios (Cuadro 1), para determinar la condición más favorable en la multiplicación del número de plantas. Todos los cultivos fueron conservados durante 60 días en un cuarto de incubación a 25 ±2 °C, 16 h de fotoperiodo con intensidad lumínica de 76 µmol m^-2 s^-1 producida por lámparas de luz blanca fría fluorescente. Se determinó el desarrollo de las plántulas durante un periodo de 60 días.

Para evaluar el efecto de la concentración de sales minerales y sacarosa en el desarrollo de las plántulas in vitro de L. halbingeriana, fueron seleccionados nuevos explantes de aproximadamente 2.5 cm de longitud y se sometieron a 15 tratamientos conformados por tres concentraciones de sacarosa (5 8.43, 87.64 y 116.85 mM), combinadas con cinco concentraciones de las sales minerales totales del medio MS (50, 75, 100, 125 y 150%) como se indica en el Cuadro 2.

En el tercer ensayo, brotes vigorosos de aproximadamente 3 cm de longitud, se seleccionaron para cultivarlos en una serie de 25 medios que contenían 87.64 mM de sacarosa. En este caso fue evaluada la combinación de ANA (0, 5.2, 7.8, 10.4 y 12.3 µM) con AIB (0, 4.94, 7.38, 9.84 y 12.3 µM), para inducir el enraizamiento in vitro de las plántulas (Cuadro 3). A cada frasco de 100 ml de capacidad sé adicionaron 25 mL de medio de cultivo, fueron sembrados 10 explantes para generar un total de 30 explantes por tratamiento. Los explantes se mantuvieron por 60 días en el cuarto de incubación a 25 ±2 °C, 16 h de fotoperiodo con intensidad lumínica de 76 umol m^-2 s^-1, producida por lámparas de luz blanca fría fluorescente. El diseño experimental utilizado fue completamente al azar con arreglo factorial 3*4, 5*3 y 55 en el primero segundo y tercer experimento, respectivamente.

Variables evaluadas y análisis estadístico

Las variables evaluadas en todos los casos fueron: número y longitud de hojas, altura de plántula, número de raíces, longitud de raíces. Con los datos obtenidos se hizo un análisis de varianza y se llevó a cabo una prueba de comparación de medias Tukey a una p < 0.05 con el paquete estadístico SAS versión 9.1 (SAS, 2003).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efecto del tipo y concentración de fitohormonas en la etapa de multiplicación in vitro de plántulas de L.halbingeriana

Se observaron diferencias estadísticas significativas en la respuesta de las plantas, respecto a los tratamientos. Con la adición de 2.22 µM de B A se obtuvieron hasta 3.93 hojas en promedio, mientras que al duplicar dicha concentración, la formación de hojas se redujo 13% (Figura 1A). El número de hojas no se vio afectado por la presencia de ANA en el medio de cultivo (Figura 1B). En cuanto a la longitud de las hojas se encontró, que con la adición de BA no se observaron diferencias entre los tratamientos para esta variable (Figura 1C). En el hibrido de Brassocattleya 'Pastoral' x Laeliocattleya 'Amber Glow' Araujo et al. (2006), encontraron en esta especie que la adición de bajas concentraciones de BA incrementaron el número de brotes.

Estos resultados coinciden con los encontrados por Sarabia et al. (2010), quienes con la adición de BA obtuvieron la mayor formación de callo, así como la mejor calidad del mismo en L. speciosa; sin embargo, se logró estimular la longitud de hojas al utilizar ANA en el medio de cultivo, pues con 5.2 µM L^-1 de ANA se incrementó la longitud de las hojas hasta 1.45 cm y al reducir su concentración a 2.6 µM L^-1 la longitud se redujo 31% (Figura 1D). Estos datos contrastan con los registrados por Coello et al. (2010), quienes en Guarianthe skinneri (Bateman) Dressier & W. E. Higgins, obtuvieron el mayor número de brotes (10.6) al utilizar concentraciones de 16.1 y 0,0023 µM de BA. En el estudio realizado por Suárez et al. (2007), encontraron que la adición de BA tiene mayor influencia que el ANA en la propagación in vitro de Euchile mariae.

La ausencia de BA en el medio de cultivo influyó negativamente en el crecimiento de las plántulas desarrolladas in vitro, ya que sólo alcanzaron 1.96 cm de altura (Figura 2 A); sin embargo, al adicionar 4.43 µM L^-1 de BA, se incrementó la altura de planta (2.19 cm). Se encontró una respuesta similar al adicionar ANA al medio de cultivo, ya que a 5.2 µML^-1 se obtuvo la mayor altura por explante (2.24 cm), y cuando se redujo hasta 2.6 µM L^-1, la altura de las plántulas disminuyó en promedio (1.97 cm), además se observó que tanto la ausencia de ANA en el medio como la concentración de 10.4 µM L^-1, presentaron el mismo efecto inhibitorio en la altura promedio de las plántulas.

El proceso de rizogénesis también fue afectado por los dos tipos de fitohormonas utilizadas (Figura 3). La presencia de BA influyó en el número de raíces ya que al adicionar 2.22 y 4.43 µM L^-1 se obtuvieron 1.82 raíces en promedio sin ser estadísticamente diferente al testigo sin BA en el cual únicamente se obtuvieron 1.55 raíces en promedio por plántula. En cuanto a la longitud promedio de las plántulas, la adición de 4.43 µM L^-1 de BA numéricamente fue mejor al obtener una longitud de 1.14 cm sin ser estadísticamente diferentes a las plantas de los otros tratamientos utilizados.

Con el regulador de crecimiento ANA la respuesta de las plántulas fue negativa, ya que al no adicionar esta fitohormona el número de raíces fue mayor (1.89) y al adicionar 10.4 µM L^-1 se inhibe la formación en 20%; la longitud de raíces tuvo un efecto similar al encontrarse que numéricamente es mejor en ausencia de ANA en el medio (1.12 cm), mientras que la adición de 10.4 µM L^-1 sólo se obtuvo un incremento promedio de 1.02 cm.

Efecto de la concentración de sacarosa y sales minerales en la propagación de plántulas de L. halbingeriana

La concentración de sacarosa no afectó la organogénesis in vitro de L. halbingeriana (Cuadro 4). Sin embargo, la concentración de 87.64 mM L^-1 favoreció su crecimiento, debido que el potencial osmótico que generó esta cantidad de sacarosa permitió a la plántula absorber agua y nutrientes. En cambio, el adicionar 116.85 mM L^-1 de sacarosa al medio de cultivo, disminuyó considerablemente el potencial osmótico, lo que dificulta la absorción de agua y nutrientes hacia el interior de las plántulas, por lo que el crecimiento de las hojas fue limitado.

Se observaron diferencias en el promedio de formación de hojas, por efecto de la interacción entre concentraciones de sacarosa y sales minerales contenidas en el medio de cultivo. En la Figura 4A se muestra que el medio con 15 0% de sales minerales y 116.85 mM L^-1 de sacarosa, favoreció la formación de hojas por planta (4.03); mientras que al disminuir el porcentaje de sales minerales a 50% de concentración, con la misma cantidad de sacarosa, se observó una disminución del promedio de producción de hojas por plántula a 3.13. Estos datos contrastan con los resultados obtenidos por Sorace et al. (2008), quienes señalan que al adicionar 116.85 mM L^-1 de sacarosa y 50% de la concentración de sales minerales en el medio MS, se obtiene mayor desarrollo de plántulas de Oncidium baueri.

El tratamiento que contenía 50% de sales minerales y 87.64 mM L^-1 de sacarosa favoreció la longitud de las hojas (1.12 cm de longitud); mientras que 58.43 mM L^-1 de sacarosa y 75% de sales minerales disminuyeron la longitud de las hojas (0.84 cm) (Figura 4 B). Estos resultados coinciden con los de Tirado et al. (2005), quienes al adicionar 58.43 mM L^-1 de sacarosa propiciaron un mayor crecimiento foliar en híbridos de Phalaenopsis.

El proceso de rizogénesis en L. halbingeriana no fue afectado por la combinación de sales minerales y sacarosa en el medio de cultivo; Moreno y Menchaca (2007) observaron que al adicionar pulpa de plátano al medio de cultivo, se aumenta el número de raíces formadas in vitro, así como la formación de pseudobulbos en Stanhopea tigrina Bateman.

La concentración de sales minerales de 150, 125, 100, 75% en interacción con 116.85 mM L^-1 de sacarosa, indujeron mayor altura de planta (0.95 cm de altura) (Figura 4 C), este mismo resultado se observó en la interacción de 100% de sales minerales y 87.64 mM L^-1. Por el contrario, la reducción de las sales minerales a 50% con 116.85 mM L^-1 de sacarosa afectó negativamente el crecimiento de las plántulas de L. halbingeriana, ya que sólo se obtuvo 0.65 cm de altura de planta. Estos resultados contrastan con los de Sorace et al. (2008), quienes utilizaron la concentración de sales minerales al 100% del medio Knudson C, para crecer in vitro el híbrido de Dendrobium nobile; esta concentración favoreció el crecimiento de la parte aérea del híbrido.

Efecto de la fuente y concentración de auxina en la rizogénesis invitro de L. halbingeriana

En la Figura 5A se observa que en ausencia de ANA, disminuye el número de raíces y su aplicación lo incrementa, aunque no se encontraron diferencias significativas con dosis entre 5.2 y 13 µM L ^-1 de ANA.

Se observó que tanto la ausencia como la concentración alta de ANA (13.00 µM L^-1), produjeron plántulas con raíces de menor longitud, 0.67 y 0.75 cm respectivamente (Figura 5C); en contraste, Pardo et al. (2008) encontraron que el número de raíces de brotes en Billbergia rosea, se incrementan (8.95) con una concentración de ANA 1 mg L^-1.

El AIB afectó marginalmente la rizogénesis, ya que tanto su ausencia como la adición de 7.38 µM L^-1 promovieron la formación de raíces, en concentraciones de 2.98 y 2.86 µM L^-1 respectivamente. Sin embargo, con 9.84 µM L^-1 de AIB disminuyó 22% la formación de raíces (Figura 5 B). En la Figura 5D se observa el efecto de la concentración de AIB en la longitud de las raíces. Los resultados mostraron, que para una mayor longitud de raíces la adición de7.38 y 12.3 µM L^-1 de AIB, así como la ausencia de ella, promovieron el tamaño de las raíces (0.9 cm), esto se puede deber al contenido endógeno de auxinas de los explantes; sin embargo, al adicionar 12.3 µM L^-1 de AIB la longitud de las raíces disminuye 41 %. Al adicionar 13 µM L^-1 de ANA al medio, se obtuvo el máximo número de hojas (3.8 hojas por planta); sin embargo, con 5.2 µM L^-1 de ANA se obtuvo la mayor longitud de 1.25 cm. En la Figura 6A y 6C se observa que la ausencia de la hormona produjo menor número de hojas por planta (3.1) y longitud (1.07 cm) de hojas.

Por otro lado, la concentración de 7.3 8 µM L^-1 de AIB fue más favorable, ya que se obtuvieron en promedio 3.67 hojas por planta, y al incrementar la concentración hasta 9.84 (µM L-¹, disminuyó el número de hojas 10%. Con respecto a la longitud de las hojas, 0 y 7.38 µM L^-1 produjeron hojas más largas en 1.25 y 1.31 cm respectivamente. Sin embargo, se afectó negativamente hasta 20% la longitud de las hojas cuando la concentración de AIB fue de 12.3 µM L^-1 (Figuras 6B y 6D).

CONCLUSIONES

Con base en los resultados de este trabajo, para la propagación in vitro de Laelia halbingeriana se logró establecer un método práctico.

Para la formación de hojas el mejor promotor fue BA en una concentración de 2.22 µM L^-1 en el medio de cultivo Murashige y Skoog.

De manera general la concentración de sales minerales en el medio y la concentración de azúcar, no influyeron en la formación de hojas y raíces generadas in vitro de Laelia halbingeriana.

En la fase de enraizamiento in vitro la adición de ANA al medio de cultivo promovió el enraizamiento.

LITERATURA CITADA

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