Actividad antimicobacteriana y antiprotozoaria de Moussonia deppeana (Schldl and Cham) Hanst

Antimycobacterial and antiprotozoal activities from Moussonia deppeana (Schldl and Cham) Hanst

María Adelina Jiménez-Arellanes,¹ Lilián Yépez-Mulia,² Julieta Luna-Herrera,³ Gabriel Alfonso Gutiérrez-Rebolledo,¹ Rosa Virginia García-Rodríguez⁴

¹ Unidad de Investigación Médica en Farmacología, Hospital de Especialidades, Instituto Mexicano del Seguro Social

³ Lab. Inmunoquímica II. Depto de Inmunoquímica, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional

⁴ Unidad de Servicios de Apoyo en Resolución Analítica, Universidad Veracruzana

Correspondencia:    

Dra. María Adelina Jiménez Arellanes
UIM Farmacología
Hospital de Especialidades
Ed. CORSE, 2° piso, CMN Siglo XXI.
Av. Cuauhtémoc 330, Col. Doctores 06720, México D.F. ]]> Tel. 55 56276900 ext 21367
E mail: adelinajim08@prodigy.net.mx

Fecha de recepción: 31 de octubre de 2012.
Fecha de recepción de modificaciones: 09 de abril de 2013.
Fecha de aceptación: 09 de mayo de 2013.

Resumen

Moussonia deppeana es conocida como tlachichinole, clachichinole, etc. En la medicina tradicional de México se utiliza para tratar: padecimientos gastrointestinales, tos, úlceras estomacales y/o duodenales, infecciones renales y vaginales. Los extractos orgánicos fueron evaluados contra once cepas de micobacterias y tres parásitos. El extracto AcOEt resultó activo contra Mycobacterium tuberculosis H37Rv, H37Rv resistente a etambutol y contra el aislado clínico SIN4 (CMI = 12.5 μg/mL), contra MMDO mostró una CMI=25 μg/mL. El extracto Hex resultó moderadamente activo contra H37Rv resistente a etambutol y contra los aislados clínicos SIN4 y MMDO (CMI=25 μg/mL). Los extractos de Hex, AcOEt y EtOH resultaron inactivos contras las micobacterias no tuberculosas (CMI > 50 μg/mL) y contra Giardia lamblia, Entamoeba histolytica y Trichomona vaginalis mostrando IC₅₀ >200 μg/mL. M. deppeana biosintetiza compuestos con actividad antimicobacteriana.

Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis, actividad antiprotozoaria, Moussonia deppeana, planta medicinal.

Abstract

Moussonia deppeana is known as tlachichinole, clachichinole, etc. In Mexican traditional medicine is used to treat gastrointestinal disorders, cough, stomach and duodenal ulcers, kidney and vaginal infections. The organic extracts prepared by maceration were evaluated against 11 mycobacterial strains and three protozoal. The AcOEt extract was active against Mycobacterium tuberculosis H37Rv, etambutol-resistant of H37Rv, and the clinical isolate SIN4 showed MIC=12.5 μg/mL, and against MMDO showed an MIC = 25 μg/mL. The Hex extract resulted moderately active against ethambutol-resistant of H37Rv and clinical isolates SIN4 and MMDO (MIC = 25 μg/mL). The Hex, AcOEt, and EtOH extracts were inactive against non-tuberculous mycobacterium strains showed MIC >50 μg/mL and against Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, and Trichomona vaginalis showed IC₅₀ >200 μg/mL. M. deppeana biosynthesized compounds with antimycobacterial activity.

Key words: Mycobacterium tuberculosis, antiprotozoal activity, Moussonia deppeana, medicinal plant.

Introducción

Moussonia deppeana (Schldl and Cham) Hanst (sin. Kholeria deppeana) pertenece a la familia Gesneriaceae y la infusión es emplea en la medicina tradicional de México para tratar padecimientos gastrointestinales, tos, úlceras estomacales y/o duodenales, enfermedades renales, infecciones vaginales y algunos tumores.^1-3 Comúnmente es conocida como tlachichinole, tlalchichinolli, cacahuatillo, clachichinole, tochomi-tillo o valletilla, campanita.^4-6

Se distribuye desde México (Chiapas, Hidalgo, Oaxaca, Puebla y Veracruz) hasta Pánama.^5,7 En investigaciones fitoquímicas previas de las partes aéreas aislaron β-sitosterol, β-D-glucosilsitoste-rol, ácido ursólico, ácido oleanólico, ácido 2β,3 β-dihidroxiolean-12-en-28-oico, ácido 2α,3α-dihidroxi-olean-12-en-28-oico, 2-metil-antraquinona, cromanona y estigmasterol.^8,9 Además, Domínguez-Ortiz et al.⁵ al realizar un análisis fitoquímico preliminar de las partes aéreas reporta que el extracto hexánico (Hex) resulto positivo para la prueba de quinonas y esteroles, el extracto de acetato de etilo (AcOEt) dio positivo a flavonoides, cumarinas, quinonas y esteroles, y el etanólico (EtOH) resultó positivo para flavonoides, saponinas y cumarinas.

Respecto a la actividad biológica, se ha descrito que el extracto metanólico (MeOH) de las hojas/tallo resulto activo contra Helicobacter pylori mostrando una concentración mínima inhibitoria (CMI) =15.6 μg/mL y el extracto acuoso fue inactivo (CMI ≥1000 μg/mL).² Por otro lado, el extracto MeOH de las partes aéreas resultó poco activo contra tripomastigotes de Trypanosoma cruzi (CM₁₀₀ = 250-500 μg/mL).¹⁰

En un estudio posterior, se describe que el extracto de AcOEt de las partes aéreas mostró un importante actividad antioxidante in vitro con la prueba de inhibición del radical 2, 2- dipicrilhi-drazina (DPPH), así como en la prueba de poder reductor del ión férrico (FRAP). El extracto Hex presentó una mejor actividad antiinflamatoria en el modelo de inflamación inducida con 13 acetato de tetradecanoilforbol (TPA) en la oreja del ratón y sólo el extracto de AcOEt generó un efecto antiinflamatorio parcial en el modelo de edema subplantar inducido con carragenina en ratón.⁵ Los autores atribuyen la actividad antiinflamatoria y antioxidante a la presencia de polifenoles.

En las últimas décadas y como resultado de la constante migración de países en vías de desarrollo donde la presencia de enfermedades tropicales es endémica, se está ocasionando que estas enfermedades aparezcan en los países del primer mundo, siendo las infecciones parasitarias las principales patalogías.^12,13 En México, en el año 2010 la Secretaria de Salud reportó que las infecciones gastrointestinales ocasionadas por parásitos se encuentran dentro de las 20 principales causas de enfermedades transmisibles, siendo los grupos más vulnerables los niños en edad escolar y los ancianos.¹⁴ Es bien conocido que las fármacos disponibles para tratar estos padecimientos producen diversos efectos secundarios y existe un incremento alarmante de casos ocasionados por parásitos que son resistentes a los fármacos actuales. G. lamblia y E. histolytica son dos de los parásitos clínicamente más importantes que causan la diarrea y recientemente, se ha descrito que aprox. 280 millones de personas están infectadas.¹⁵ Por otro lado, al año aparecen aprox. 10 millones de casos nuevos de tuberculosis (TB), mueren cerca de 2 millones de personas y una tercera parte de la población mundial está infectada con Mycobacterium tuberculosis. Los casos multifarmacoresistentes (MFR) y de resistencia extendida (XFR) van en aumento por lo que se requiere de nuevas alternativas de tratamiento que muestren mecanismos de acción diferente a los fármacos existentes, con menos efectos secundarios y que acorten el periodo de tratamiento. Datos epidemiológicos describen que de todos los casos MFR sólo se curan entre el 50 y 70% y entre el 5 y 6% de los casos MFR son XFR. Para el tratamiento de esta enfermedad se cuenta con fármacos de primera y segunda línea; sin embargo, los tratamientos son a base de multiterapia (de 4 a 8 fármacos) lo que ocasionan diversos y severos efectos secundarios, son prolongados (hasta de 30 meses en casos de MFR), de elevado costo, lo cual incide en el poco apego y abandono de los mismos.^16-18

Tomando en cuenta el grave problema de salud que representa la TB y las parasitosis, aunado al problema de farmacoresistencia, en la actualidad se realizan investigaciones sobre la flora medicinal mexicana con miras a encontrar fuentes alternas de moléculas bioactivas, las cuales pueden constituir prototipos estructurales para el desarrollo de nuevos fármacos. Continuando con la investigación de los extractos Hex, AcOEt y EtOH de M. deppeana, en este trabajo reportamos su actividad antimicobacteriana y antiprotozoaria in vitro.

Material y métodos

Colecta del material vegetal

M. deppeana fue colectada en Rancho Viejo-Cinco Palos, Municipio de Coatepec, Veracruz, México en Noviembre del 2010. La identificación taxonómica de la especie vegetal fue realizada por el Taxónomo Luis Hermann Bojórquez Galván y un ejemplar de herbario (CIB8987) fue depositado en el Herbario del Instituto de Investigaciones Biológicas de la Universidad Veracruzana.

Preparación de los extractos crudos

Las hojas de M. deppeana (198.7 g) se secaron a temperatura ambiente, se cortaron en trozos pequeños y fueron sometidas a un proceso de maceración exhaustiva en la oscuridad con solventes de creciente polaridad (Sigma-Aldrich), de esta forma se obtuvieron tres extractos: Hex, AcOEt y EtOH, los cuales fueron concentrados en un rotaevaporador (Heidolph LABOROTA 4000) acoplado a una bomba de vacío (ShelLab). Los extractos crudos fueron almacenados en frascos ámbar a temperatura ambiente hasta su utilización.

Evaluación de la actividad antiprotozoaria

Evaluación de la actividad antimicobacteriana

Se emplearon las siguientes cepa de micobacterias: M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294), cuatro cepas monoresistentes de M. tuberculosis H3Rv [resistente a isoniazida -INH- (ATCC 35822), resistente a estreptomicina -STR- (ATCC 35820), resistente a rifampicina -RIF- (ATCC 35838) y resistente a etambutol -EMB- (ATCC 35798)], dos aislados clínicos MFR de M. tuberculosis (SIN 4 y MMDO) y contra cinco cepas de micobacterias no tuberculosas: M. avium, M. abscesus, M. fotuitum y M. smegmatis. M. tuberculosis H37Rv es sensible a los cinco fármacos de primera línea (INH, RIF, EMB, STR y pirazinamida -PZ-), el aislado SIN4 es resistente a INH, RIF, EMB, STR, PZ, rifabutina, etionamida y ofloxacina y el aislado MMDO es resistente a INH y EMB.

La evaluación se determinó por el micrométodo colorimétrico de alamar azul (MABA) descrito previamente.^19,20

Las micobacterias se hicieron crecer en medio Middlebrook 7H9 enriquecido con 0.2% de glicerol y 10% de OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa). La suspensión bacteriana ajustada al tubo No 1 del nefelómetro de McFarland, se diluyó 1:50 con el mismo medio para obtener 6x10⁶ unidades formadoras de colonias (UFC)/mL. El ensayo se realizó en microplacas estériles de 96 pozos estériles y se incluyeron controles de microorganismo, de disolvente y de fármacos: rifampicina e isonizida (para cepas sensibles); rifampicina, isonizida, etambutol, estreptomicina y ofloxacina (para cepas MFR). La actividad antimicobacteriana se reporta como CMI y son activas las muestras que muestran una CMI ≤50 μg/mL.

Resultados y discusión

Mediante proceso de maceración de las hojas se obtuvieron los extractos de polaridad creciente por separado y libre de solvente orgánico: 1.68 gr de extracto Hex (con rendimiento de 0.84%), 2.01 gr de extracto de AcOEt (con rendimiento de 1.01%) y 10 g de extracto EtOH (con rendimiento de 5.03%), los rendimientos están reportados respecto a la planta seca. Los resultados de la evaluación antimicobacteriana de los extractos se describen en la Tabla 1. El extracto de AcOEt resultó más activo contra la cepa de referencia (H37Rv), la cepa H37Rv resistente a EMB y contra el aislado clínico SIN4, mostrando una CMI = 12.5 μg/mL; este extracto también inhibió moderadamente el crecimiento del aislado clínico MMDO (CMI = 25 μg/mL).

La actividad que el extracto de AcOEt mostró contra el aislado clínico MFR SIN 4 es de gran importancia debido a que este aislado clínico es resistente a fármacos de primera y segunda línea (resistente a INH, RIF, EMB, STR, rifabutina, etionamida y ofloxacina). Los casos provocados por cepas MFR y XFR van en aumento (5.3 % de todos los casos de TB son MFR), son de difícil tratamiento y sólo se curan aprox. el 70% de estos; aunado a que los tratamientos son prolongados (hasta de 30 meses), de alto costo y provocan severos efecto secundarios.^17,18 Por lo que es urgente encontrar fuentes alternas para la obtención de compuestos antituberculosos y una de estas fuentes lo constituyen las plantas medicinales de nuestro país.^19,20

Por otro lado, trabajos previos describen que esta especie biosintetiza ácido ursólico y ácido oleanólico,⁸ por lo que estos dos compuestos pueden ser responsables de la actividad antimicobacteriana mostrada por los extractos Hex y AcOEt. Estos compuestos presentan una CMI < 50 μg/mL contra M. tuberculosis H37Rv al ser evaluado por ensayo MABA.^21-27 Por análisis en cromatografía de capa fina de silica gel (ccf, Merck) de los extractos activos (Hex y AcOEt) se detectó la presencia de estos triterpenos, mostrando un factor de referencia (R_f) igual al estándar comercial del ácido ursólico y del ácido oleanólico (Sigma) cuyo valor fue de 0.76 empleando como sistema de elución CH₂Cl₂:MeOH 96:04, en estas mismas condiciones y en los mismos extractos se detectó también el β-sitosterol (R_f = 0.8) por comparación con un estándar comercial (Sigma). De manera adicional, por análisis en ccf del extracto EtOH se detectó un polifenol al revelar las placas con difenilboriloxietilamina en MeOH al 1% y polietilenglicol en etanol al 5% (NP/PEG, Sigma), presentando un R_f = 0.18 en el sistema AcOEt:EtOH:H₂O (100:13.5:10), está en proceso su aislamiento y posterior identificación. Por otro lado, se está realizando la investigación de tipo fitoquímico biodirigido para confirmar sí estos triterpenos (ácido ursólico y ácido oleanólico) son los responsables de la actividad antimicobacteriana observada en los extractos de Hex y de AcOEt y sí existen compuestos adicionales que contribuyen a la actividad biológica observada.

Los resultados obtenidos de la evaluación antiprotozoaria muestran que los tres extractos, resultaron inactivos contra G. lamblia, E. histolytica y T. vaginalis, mostrando una CI₅₀ > 200 μg/mL (Tabla 2). Cabe mencionar que el uso tradicional que se le atribuye a la especie para tratar padecimientos gastrointestinales,^1,3 puede estar relacionada con infecciones provocados por bacterias o virus y no por parásitos, por lo que se necesita evaluar el efecto antibacteriano y antiviral de estos extractos para confirmar el uso tradicional que se le atribuye a esta especie para padecimientos gastrointestinales. Cabe mencionar que el extracto MeOH de la partes aéreas de la especie fue activo contra H. pilory (CMI = 15.6 μg/mL),² por lo que es muy probable que los extractos evaluados en este trabajo muestren importante actividad antibacteriana.

Conclusiones

El extracto AcOEt y Hex de M. deppeana muestran principalmente actividad antimicobacteriana por lo que puede constituir una fuente importante de compuestos activos, sobre todo activos contra aislados clínicos de M. tuberculosis MFR. Ambos extractos resultaron inactivos contra los parásitos evaluados.

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