Actividad antituberculosa del extracto de Carya illinoensis

Antituberculosis activity of a Carya illinoensis extract

Sáenz Esqueda María de los Angeles,¹ Álvarez Román Rocío,² Castro Ríos Rocío,² Gómez Flores Ricardo,³ Nuñez Rodríguez María Adriana,¹ Galindo Rodríguez Sergio A.,¹ Chávez Montes Abelardo¹

¹ Departamento de Química, Cuerpo Académico de Químico Biológica, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León.

² Departamento de Química Analítica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Nuevo León.

Correspondencia:

M. en C. María de los Angeles Sáenz Esqueda
Departamento de Química, Cuerpo Académico de
Químico-Biológica
Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Autónoma de Nuevo León
Pedro de Alba y M.L. Barragán s/n. Cd. Universitaria, San
Nicolás de los Garza, N.L. CP. 66450. ]]> e-mail: saenz_00@hotmall.com

Fecha de recepción: 20 de diciembre de 2011
Fecha de recepción de modificaciones: 3 de mayo de 2012
Fecha de aceptación: 1 de junio de 2012

Resumen

Se evaluó la actividad antituberculosa del extracto hexánico de Carya illinoensis (CIH) y dos de sustracciones, metanólica (CIFM) y no metanólica (CIFNM), identificando las moléculas responsables de esta actividad. Tanto CIH, como CIFM y CIFNM presentaron actividad antituberculosa a una concentración de 125 μg mL^-1, con 80,50 y 70 % de inhibición, respectivamente. Se encontró que los principales componentes del extracto y sus fracciones son tres fitoesteroles y un triterpenoide pentacíclico: β-sitosterol, α-amirina, sitostenona y ácido betulínico. La presencia de estos compuestos ofrece un nuevo panorama de las moléculas responsables de la actividad antituberculosa en la corteza de CIH y la posibilidad de explorar otras aplicaciones farmacéuticas para esta planta.

Palabras clave: Tuberculosis, β-sitosterol, ácido betulínico Carya illinoensis.

Antituberculosis activity was assessed for a hexanic extract of Carya illinoensis (CIH) and its methanolic (CIFM) and non-methanolic (CIFNM) fractions. CIH, CIFM and CIFNM presented antimycobacterial activity at a concentration of 125 μg mL^-1 with inhibitions of 80, 50 and 70%, respectively. The main components in the extract and fractions were found to be three phytosterols and a pentacyclic triterpenoid: sitosterol, amyrin, sitostenone and betulinic acid. The presence of these compounds offers a new view on the kind of molecules responsible for the antituberculosis activity in the cortex of C. illinoensis and the possibility of exploring pharmaceutical applications for this plant.

Key words: Tuberculosis, β-sitosterol, betulinic acid, Carya illinoensis.

Introducción

La tuberculosis (TB) es una Infección del sistema respiratorio que puede llegar a ser mortal y representa uno de los principales retos de salud pública debido a su alta incidencia.¹ Más de 2000 millones de personas, es decir un tercio de la población mundial, están infectadas con el bacilo de la TB: esta enfermedad es una de las principales causas de muerte en las personas infectadas con VIH.²

A pesar de que el tratamiento farmacológico para la TB ha estado disponible desde hace 50 años, esta enfermedad sigue siendo la primera causa de muerte por infecciones prevenibles.³ Anualmente aparecen 9 millones de casos nuevos y cerca de 3 millones de personas mueren por esta causa.^4,5

Actualmente, el tratamiento más efectivo es una combinación de cuatro fármacos antituberculosis de primera línea: isoniazida, rifampicina, etambutol y pirazinamida.⁶⁷ Sin embargo, la prolongada farmacoterapia y las altas dosis de ésta afectan la calidad de vida del paciente y dificultan el seguimiento estricto del tratamiento, lo cual contribuye al desarrollo de cepas farmacorresistentes (TB-MDR).⁸

Para el tratamiento de las cepas TB-MDR se emplean fármacos de segunda línea como la capreomicina, la kanamicina, la amikacina y las fluoroquinolonas, que tienen la desventaja de ser poco específicos, provocar severos efectos secundarios, inducir fácilmente resistencia y ser de elevado costo. Además, los tratamientos son aun más prolongados que los disponibles para las cepas no resistentes y en consecuencia de escaso apego.^9-11

Recientemente la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha reportado la aparición de cepas de resistencia extendida (TB-XDR), para las cuales no existe alternativa de tratamiento y responden precariamente ante fármacos de primera y segunda linea, por lo cual la necesidad de descubrir nuevos compuestos para la terapia de la TB se ha tornado urgente.^10,12,13

Estos productos naturales exhiben un amplio rango de actividad in vitro contra M. tuberculosis con concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) que van desde 0.2 μg mL'¹ para la rifampicina, 0.5 μg mL^-1 para estreptomicina, 1 μg mL⁴ para la amikacina, 4 μg mL¹ para la viomicina, 5 μg mL¹ para las capreomicinas hasta 6 μg mL-1 para la kanamicina.²²

Los productos naturales representan una ruta alterna en la búsqueda de nuevos agentes antituberculosos, la caracterización de los compuestos presentes en los extractos naturales es el primer paso para encontrar nuevos fltoquímicos.^23-27 La actividad farmacológica de las plantas reside principalmente en los metabolitos secundarios, que han llegada a un primer plano de interés debido a su variada actividad biológica. Estas sustancias comprenden más de 30,000 compuestos diferentes identificados hasta ahora, que se han clasificado como: triterpenos, saponinas, fitoesteroies y/o sus precursores.^28-30

Investigaciones previas han reportado que las especies de bacterias pertenecientes al género Mycobacterium son sensibles a algunos triterpenos, como el ácido betulfnico.³¹ La principal fuente del ácido betulínieo son las plantas pertenecientes a las familias Betulaceae, Ebenceae y Poniaceae. El Interés en este compuesto ha crecido en los últimos diez años, debido a sus propiedades farmacológicas, como la actividad anticancerígena, anti-VIH y antituberculosa.^32-34

Otras sustancias pertenecientes al grupo de los triterpenos son los fitoesteroles, los cuales se encuentran en aceites esenciales, frutas y verduras. Los fitoesteroles se sintetizan por la vía del ácido mevalónico y están presentes en casi todas las partes de las plantas, pero sobre todo en las semillas y retoños. Debido a las propiedades benéficas que presentan sobre la salud su estudio se ha incrementado en los últimos años.^35-37

El β-sitosterol es uno de los fitoesteroles más abundantes en las plantas y su efectividad biológica ha sido demostrada en estudios preclínicos para tratamientos de enfermedades como el cáncer de estómago,³⁸ colon,³⁹ próstata⁴⁰ y mama,⁴¹ así como en úlceras⁴² y en estudios clínicos para VIH^43-45 y tuberculosis,⁴⁶ Además, se han encontrado evidencias del efecto inmunomodulador de los esteróles, usando una mezcla de beta-sitostero¹/sitosterina. En dicho estudio se plantea que el mecanismo de acción posiblemente está relacionado con un efecto sobre el control de las citocinas inflamatorias. Esta modulación en la producción y actividad de citocinas, ejerce efectos beneficiosos en pacientes con enfermedades infecciosas.^47-48

En el nogal se encuentran sustancias fitoquímicas, como los fitoesteroles, a los cuales se les han atribuido diversas propiedades biológicas como son protección frente a estrés oxidativo, disminución en el riesgo de padecer enfermedades coronarias, disminución del colesterol LDL, efectos antiinflamatorios y protección frente a algunos tipos de cáncer.^{49 51} Además algunos estudios han demostrado la actividad antimicrobiana de las hojas y frutos del nogal, atribuyendo esta actividad hasta ahora a la juglona.^52-54 Sin embargo, existen pocos estudios acerca de la actividad biológica de la corteza.^55-58

En el estudio realizado por Cruz-Vega y col. en el 2008⁵⁹ se reportó la actividad antituberculosa de extractos hexánicos de Juglans mollis y C. illinoensis. El presente trabajo presenta la evaluación de la actividad contra M. tuberculosis del extracto hexánico de corteza C. illinoensis y de dos fracciones. Adicionalmente, las muestras fueron caracterizadas por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), identificando los componentes principales.

Materiales y métodos

El ácido ursólico (L Al. la clofazimina (CLF), el ácido betulínico (AB) y el β-sitosterol fueron adquiridos en Sigma-Aldrich (EUA).

Recolección y preparación del extracto

La corteza de Carya illinoensis fue recolectada en el mes de septiembre del 2009 en el municipio de General Terán, Nuevo León, México. El material vegetal fue depositado en el herbario de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UANL para su identificación (Voucher No. 025528). La corteza se limpió y se secó a temperatura ambiente por espacio de cinco días, para después ser molida en un molino manual. De éste material se pesaron 60 g y se adicionaron 500 mL de hexano (JT Baker, México). La mezcla se colocó en reflujo continuo en un sistema soxhlet por 20 h. Una vez obtenido el extracto, se eliminó el solvente a presión reducida (Rotavapor Laborata 4003, Heidolph Instruments, Alemania). Los extractos se almacenaron en frascos de vidrio protegidos de la luz y la humedad hasta su uso.

Partición del extracto

A partir del extracto hexánico de C. illinoensis (CU I) se extrajo la parte soluble en metanol, para lo cual se pesaron 500 mg de extracto y se adicionaron 25 mL de metanol (CTR Scientific, México). Una vez realizada la partición, la fracción recuperada se llevó a sequedad y se guardó en frascos ámbar cerrados herméticamente en refrigeración hasta su uso. La fracción insoluble también fue pesada y almacenada en las condiciones mencionadas anteriormente.

Análisis cromatográfíco por HPLC

La caracterización del extracto y sus fracciones se realizó utilizando un cromatógrafo de líquidos (Varian, E.U.A) equipado con un sistema de bombeo ternario 9012, automuestreador 9100, detector de arreglo de diodos Polychrom 9065 y una columna Microsorb C₁₈ (150 x 4.6 mm, 5 µm; Varian, E.U.A.). La fase móvil consistió en una mezcla de metanol (grado HPLC; J.T. Baker, México) y una solución acuosa de ácido fórmico (100 mM. pH 3.0) 55:45 v/v; con un flujo de 0.8 mL min^-1. El volumen de inyección fue de 20 µL y la longitud de onda utilizada fue de 254 nm. El extracto hexánico de C. illinoensis (CIH) y las dos fracciones obtenidas de éste, fracción metanólica (CIFM) y fracción no metanólica (CIFNM) fueron disueltas en cloroformo (CTR Scientific, México) y filtradas usando membranas de filtración Durapore® de 0.45 µm (Millipore, E.U.A). Para el análisis de AU y CIFM, la fase móvil consistió en una mezcla metanol- ácido fórmico (100 mM, pH3.0) 65:35 v/v; con un flujo de 1.0 mL min^-1. Las variables modificadas para optimizar la separación fueron el pH y la proporción de buffer en la fase móvil.

Caracterización del extracto por GC-MS

Se llevó a cabo empleando un cromatógrafo de gases 6890N con inyector spli/splitless y detector selectivo de masas 5973 (Agilent Technologies, Alemania) con fuente de ionización de impacto electrónico y analizador cuadrupolar. La separación se realizó con una columna HP 5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm; Agilent Technologies, Alemania). El gas acarreador fue helio con un flujo de 0.9 mL min^-1. El programa de temperatura del horno consitió en una etapa inicial a 70 °C por 2 min, subiendo 15 °C min^-1 hasta 200 °C manteniendo 5 min a esta temperatura, finalmente la temperatura se incrementó a una velocidad de 10 °C min^-1 hasta llegar a 320 °C y se mantuvo por 10 min. La temperatura del inyector fue de 270 °C y la de la línea de transferencia de 270 °C.

Activación de la cepa Mycobacteríum tuberculosis H37Rv

La cepa de M tuberculosis H37Rv fue proporcionada por el Instituto de Investigaciones Biomédicas del Noroeste, en Monterrey, N.L. y se mantuvieron en tubos con medio Lowenstein-Jensen (Remel, Lenexa, Kansas City, MO). Las suspensiones bacterianas se prepararon cultivando un inoculo inicial en agar Middlebrook 7H10 (BBL, Becton-Dickinson; E.U.A.) y subcultivando en caldo Middlebrook 7H9 (Difco Laboratories, E.U.A.) conteniendo 0.5 % de glicerol (Boehringer Mannheim Biochemicals, E.U.A), 10 % de enriquecimiento OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa; Becton Dickinson and Company, E.U.A) y 0.05% de Tween 80 (Polisorbato 80, Sorbitan-Oleato y Poli-Oxietileno; Materiales y Abastos Especializados, México) por 72 h a 37 °C. Las suspensiones celulares se agitaron y sonicaron por 10 min en baño de ultrasonidos (Laboratory Supplies Co., E.U.A.) hasta que los agregados visibles se disgregaron. La solución de bacterias se centrifugó a 500 rpm por 10 min y se recuperó el sobrenadante. Posteriormente, el cultivo se diluyó en el mismo caldo a la concentración de 1x10⁶ bacterias mL^-1 utilizando una cámara de Neubauer (100X).⁶⁰

Esta suspensión se congeló a -80 °C hasta su uso.

Evaluación de la actividad antituberculosa

La evaluación de la actividad antituberculosa se realizó en placas de 96 pozos estériles de fondo plano con tapa. Las concentraciones ensayadas del extracto y sus fracciones estuvieron en un rango de 62 a 500 μg mL¹, mientras que la CLF, utilizada como control positivo se trabajó a una concentración de 0.5 μg mL¹. Para cada concentración de las muestras y del control se asignaron tres pozos por fila. A cada pozo, conteniendo la muestra o el control, se agregaron 50 μL de medio Middlebrook 7H9 suplementado con OADC. Posteriormente se añadieron 50 μL de la suspensión de M tuberculosis (1x105 bacterias mL^-1). Se dejaron 2 pozos como control de crecimiento de la bacteria. Los pozos del perímetro fueron llenados con agua estéril para minimizar la evaporación en la placa. Las placas fueron selladas con cinta adhesiva e incubadas a 37 °C por 10 días en una atmósfera húmeda. Al décimo día se añadieron 15 μL de una mezcla de Azul de Alamar^61-62 (Trek Sistemas Diagnóstico Ltd, Reino Unido) 1:1 con Tween 80 al 10 % a cada uno de los pozos. El ingrediente activo del Azul de Alamar es la resarzurina, la cual es un compuesto no tóxico, permeable a las células que es de color azul y no fluorescente; la resarzurina se convierte en resofurina de color rojo brillante a través de las reacciones de reducción de las células metabólicament activas. Las placas se incubaron por 16 h y después se leyeron a una longitud de onda de excitación de 535 nm y a 595 nm de emisión.

Resultados y discusión

El método seleccionado para la obtención del CIH fue la extracción con soxhlet, debido a que en general este método tiene una eficiencia de extracción alta.⁶³ Con la utilización de este método, la eficiencia de la extracción fue de 1.32 %, coincidiendo con lo reportado por Salinas González (2004)⁶⁴ para esta especie. En general los componentes químicos de la corteza se dividen en lipofílicos e hidrofílicos, la fracción lipofílica está constituida por sustancias solubles en solventes poco polares (hexano, éter etílico, diclorometano) como terpeños, terpeno!des, ceras, grasas y alcoholes alifáticos superiores. La fracción hidrofílica está constituida por sustancias extraíbles en agua o por solventes de alta polaridad (acetona, alcohol etílico) y contiene gran cantidad de compuestos fenólicos. La acumulación de compuestos poco polares en la corteza es menor en comparación con los compuestos encontrados en la fracción hidrofílica.⁶⁵ Debido a lo descrito anteriormente se explica el bajo rendimiento del extracto CIH, en comparación con una extracción realizada a partir de un solvente de alta polaridad, como lo reporta Orea-Igarza y col., en el 2006.⁶⁶

Para su caracterización, el extracto y sus fracciones se analizaron por HPLC utilizando una columna de de fase inversa C₁₈ y un detector de arreglo de diodos. Las condiciones de separación fueron optimizadas con el fin de obtener el mayor número de señales posibles para el extracto hexánico. Se evaluaron distintas fases móviles, desde acetonitrilo puro hasta mezclas de metanol o acetonitrilo con soluciones acuosas de acetato de amonio y ácido fórmico a diferentes concentraciones y valores de pH. Los mejores resultados se obtuvieron con el uso de una mezcla de metanol-ácido fórmico (100 mM) 50:50 (Fig. 1). Con estas condiciones, fue posible identificar al AU, compuesto que ha sido encontrado en la corteza de otras especies de corteza como es el caso de Physocarpus intermedius.⁶⁵

Las fracciones CIFM y CIFNM fueron analizadas bajo las mismas condiciones que el extracto completo. Como puede observarse en la figura 1, el número las señales observadas para las fracciones fue menor que las obtenidas para el extracto completo y es reflejo de la partición realizada. En primera instancia, se pensó que la fracción CIFM contenía AU, ya que el cromatograma mostró un pico con tiempo de retención y espectro de absorción similar. Su presencia en CIFM podría explicarse por la naturaleza polar de éste fitoquímico, la cual permite que sea afín por el solvente utilizado en la partición Bankeu y col.⁶⁹ reportaron la presencia de AU en extractos metanólicos de la corteza de árboles de la familia Moraceae. Para confirmar la presencia de AU en CIFM, realizó un análisis por GC-MS. Para ello, todas las muestras fueron derivatizadas con trimeltilsilano debido a la baja volatilidad esperada de los compuestos en el extracto.⁷⁰ El análisis del extracto hexánico y de CIFM mostró un pico con tiempo de retención similar al AU pero con espectro de masas muy diferente, por lo que se descartó la presencia de este compuesto.

Al cotejar los espectros de masas de todos los picos obtenidos en el cromatograma de CIH con los de la biblioteca de espectros del equipo, fue posible identificar al ácido betulínico (AB) y al β-sitosterol.

La presencia de estos dos compuestos en CIH fue confirmada mediante el análisis de estándares puros, los cromatogramas obtenidos se muestran en la figura 2 mientras que los espectros de masas se muestran en las figuras 3 y 4.

Tanto el AB como el β-sitosterol fueron encontrados también en la fracción CIFM. Ambos compuestos han sido reportados en investigaciones previas por sus propiedades contra M. tuberculosis.^71,72 Por otro lado, el análisis por GC-MS de la fracción CIFNM permitió identificar al γ-sitosterol, α-amirina y sitostenona, de los cuales solamente la α-amirina cuenta con reportes sobre su acción biológica frente a M. tuberculosis.

La actividad antituberculosa de las fracciones se evaluó con el método colorimétrico de azul de alamar a partir de diluciones seriadas. Se empleó CLF como control positivo y la concentración de trabajo se determinó evaluando un rango de concentraciones de entre 0.312 a 5 μg mL^-1. Se encontró una inhibición superior al 80 % en todos los niveles de concentración y la concentración utilizada para los ensayos de actividad antituberculosa fue de 0.5 μg mL¹. El uso de la CLF en todas las pruebas permitió controlar la variación intra e interensayo, con coeficientes de variación menores al 0.28 % en todos los casos.

En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos para el extracto CIH y sus dos fracciones. Como puede observarse CIH y sus dos fracciones resultaron activas de acuerdo a la evaluación microbio lógica que se realizó. El CIH mostró un rango de inhibición entre 80 y 95 % en las tres concentraciones más altas ensayadas 125, 250 y 500 μg mL^-1; mientras que ninguna de las concentraciones evaluadas para la fracción CIFM mostró una inhibición superior del 50 %. Por su parte la fracción CIFNM, exhibió un 70 % de inhibición a partir de 62 μg mL^-1. Sin embargo, las inhibiciones mostradas por CIH y CIFNM no presentaron una diferencia significativa (p < 0.05). Al analizar los cromatogramas obtenidos por HPLC se observó que la información proporcionada por los mismos no es suficiente para relacionar el perfil cromatografía) con la actividad antituberculosa exhibida por las fracciones; por esta razón se procedió a analizar las muestras por GC-MS.

El objetivo de haber realizado el fraccionamiento era incrementar la actividad, al concentrar la sustancias activas. Sin embargo, en este caso este proceso afectó la actividad antituberculosa de cada una de las muestras, provocando un decremento de la misma.

A pesar de la alta inhibición conseguida a una baja concentración por parte de CIFNM, se aprecia que el porcentaje de inhibición no guarda proporción con las diferentes concentraciones ensayadas ya que la inhibición alcanzada no tuvo variación; sugiriendo que los componentes activos se hayan presentes en una cantidad suficiente como para manifestar una inhibición parcial en el intervalo de concentraciones ensayado y que el mismo no es tan amplio para conseguir un efecto cuantal en una curva dosis respuesta. Asimismo, se observa que la actividad mostrada por CIFNM tiende a ser superada por la inhibición obtenida con CIH, razón por la dial se plantea que existe una sinergia entre los componentes del CIH lo que permite que esta muestra supere a la CIFNM. El análisis químico permitió determinar que en CIFM se observó la presencia de estigmasterol, β-sitosterol y sitostenona; y en la CIFNM β- sitosterol, α-amirina, sitostenona y a-amirenona. Si bien hay estudios que respaldan la actividad antituberculosa del ácido betulínico y β-sitosterol por separado, también encontramos literatura donde se corrobora la actividad con la sinergia de estos compuestos encontrados en los extractos de plantas. Un ejemplo de esta sinergismo es el trabajo desarrollado por Chen et al, en el 2005,⁷³ donde se evaluó la actividad antituberculosa de varios compuestos aislados de Cínnamomun kotoense, así como de mezclas de los mismos, los resultados mostraron que existe una mayor actividad cuando los componentes se presentaban en mezcla.

Finalmente, cabe resaltar que no existen reportes de la presencia de ácido betulínico en la especie C. illinoensis, como se había mencionado anteriormente la actividad farmacológica de esta especie se le atribuye ajuglona.^74-75

El extracto hexánico de corteza de C. illinoensis representa una potencial alternativa para el tratamiento quimiterapeutico de la tuberculosis debido a la actividad antituberculosa que posee. Se sugiere que la acción contra M Tuberculosis se presenta con la sinergia de sus componentes ya que el fraccionamiento disminuye su actividad. Finalmente una vez evaluada su actividad antituberculosa, éste se analizó por GC-MS y se identificó la presencia de ácido betulínico, no reportado en esta especie, y β-sitosterol, moléculas a las cuales se les atribuye la actvidad biológica que presenta el extracto.

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