Detección de la proteína CP4 EPSPS en plantas arvenses en cultivos de algodón (Gossypium hirsutum) transgénico en la Comarca Lagunera, México

Detection of CP4 EPSPS protein in weed flora in transgenic cotton (Gossypium birsutum) crops in Comarca Lagunera, México

Cándido Márquez-Hernández^1*, C. Omar Puente-Valenzuela¹, Gisela Muro-Perez¹, J. Luis García-Hernández², E. Omar Rueda-Puente³, A. Noé Moreno-Hernández²

¹ Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Juárez del Estado de Durango (UJED). Avenida Universidad s/n. Fraccionamiento Filadelfia. Gómez Palacio, Durango. México. * Autor responsable. (canomh2@yahoo.com.mx).

³ Domicilio Conocido. Venecia, Durango. México. Universidad de Sonora. Bulevard. Luis Encinas y Rosales s/n. Colonia Centro. Hermosillo, Sonora.

Recibido: abril, 2015.
Aprobado: julio, 2015.

Resumen

El flujo génico se puede presentar entre especies de plantas silvestres y cultivadas. Las interacciones entre el algodón (Gossypium hirsutum), plantas arvenses y la familia Malvacea no son excepciones. Hay evidencias de flujo génico entre cultivos genéticamente modificados y plantas silvestres. La probabilidad del aumento de flujo de genes en el algodón transgénico ha aumentado porque se ha sembrado en el área durante 18 años. El objetivo de este estudio fue detectar la presencia de la proteína CP4 EPSPS en plantas arvenses en cultivos de algodón transgénico en Coahuila y Durango, México. En Durango y Coahuila se obtuvieron 15 y 20 especies de arvenses de 10 familias botánicas: Amaranthaceae, Asteraceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Euphorbiaceae, Fabacea, Malvaceae, Nyctaginaceae, Poaceae y Solanaceae; ocho de ellas se encontraron en ambos estados. Malvastrum coromandelianu, Sphaeralcea angustifolia, Anoda cristata y Sida hederacea son especies de la familia Malvaceae y se identificaron en la Comarca Lagunera. La proteína CP4 EPSPS no se detectó en las plantas arvenses presentes en el agroecosistema de algodón transgénico en la Comarca Lagunera.

Palabras claves: Organismos genéticamente modificados, proteínas transgénicas, biodiversidad, listados florísticos, contaminación cruzada, flujo génico.

Gene flow can appear among wild and cultivated plant species. The interactions among cotton (Gossypium birsutum), weed flora and the Malvacea family are not exceptions. There are evidences of gene flow among genetically modified crops and wild plants. The probability of greater gene flow in transgenic cotton has increased, given that it has been sown in the area during 18 years. The objective of the present study was to detect the presence of the CP4 EPSPS protein in weed flora in transgenic cotton crops in Coahuila and Durango, Mexico. In Durango and Coahuila 15 and 20 weed species of 10 botanical families were obtained: Amaranthaceae, Asteraceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nyctaginaceae, Poaceae and Solanaceae; eight of these were found in both states. Malvastrum coromandelianu, Sphaeralcea angustifolia, Anoda cristata and Sida hederaceae are species of the Malvaceae family and were identified in the Comarca Lagunera. The CP4 EPSPS protein was not detected in weed plants present in the agrosystem of transgenic cotton in the Comarca Lagunera.

Key words: Genetically modified organisms, transgenic proteins, biodiversity, floristic lists, cross contamination, gene flow.

INTRODUCCIÓN

Las arvenses son las plantas de la flora completa de un agroecosistema (Zamorano, 2006) y las malezas son plantas no deseadas presentes en los cultivos, que pueden causar un daño económico. La mayoría de las investigaciones florísticas en agroecosistemas se limitan al análisis de malezas (Molina et al. 2008), pero también se han estudiado las plantas arvenses en diversos agroecosistemas (Masalles, 2004; Blanco y Leyva, 2007; Sánchez y Guevara, 2013), como el cultivo de algodón (Bükün, 2005; Economou et al., 2005).

El flujo génico es el cambio en la frecuencia de alelos por el movimiento de gametos de una población a otra (Slatkin, 1987; Snow, 2002), y existe evidencia del flujo génico en ecosistemas naturales (Ellstrand et al, 1999; Belanger et al, 2003; Ellstrand 2003) y en distintos agroecosistemas (Hall et al., 2000; Hegde y Waines, 2004; Downey, 2006).

El flujo de genes de cultivos genéticamente modificados a especies silvestres fue estudiado (Rieseberg et al., 2003; Stewart et al., 2003; Warwick et al., 2003), así como la posible persistencia de los transgenes en la naturaleza (Warwick et al., 2008). Bjerknes et al. (2007) realizaron estudios de polinización entre plantas cultivadas y plantas nativas; otros autores estudiaron polinización en especies transgénicas (Rieger et al., 2002; Hoyle y Cresswell, 2007) y en México (Quist y Chapela, 2001).

El algodón y las plantas arvenses pueden ser específicas para uno o varios polinizadores (Gómez, 2002); el polen del algodón debe ser transportado por insectos, presentes en el algodón (Márquez et al., 2014; Santana et al., 2015), hacia las plantas arvenses, fomentando la polinización. Según Freire (2002), es posible la cruza de algodón transgénico con el convencional y con los nativos.

La familia de enzimas 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) se encuentra en las plantas y los microorganismos. Las proteínas EPSPS (5-enol-piruvil shikimato-3-fosfato sintasa) catalizan la transferencia del grupo enolpiruvil desde el fosfenol piruvato (PEP) al 5-hidroxil de shikimato-3-fosfato (S3P) y producen fosfato inorgánico y 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato. En las plantas sin tolerancia al glifosato, se une la enzima endógena EPSPS con el glifosato y bloquea la biosíntesis de 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato y, por ende, priva a las plantas de aminoácidos esenciales y de metabolitos secundarios. La proteína CP4 EPSPS expresada en las plantas GM con tolerancia al glifosato es equivalente funcionalmente a las enzimas EPSPS endógenas, con la excepción de que la CP4 EPSPS presenta afinidad reducida con el glifosato, prefiriendo PEP, por lo que la enzima CP4 EPSPS continua funcionando en presencia del glifosato y produce los aminoácidos aromáticos y demás metabolitos necesarios para el crecimiento y el desarrollo normal de la planta (Steinrucken y Amrhein, 1980; Franz et al. 1997; Alibhai y Stallings, 2001; Center Environmental Risk Assessment, 2010; Zhang, 2015).

Para el agroecosistema algodón en México, se han registrado 118 especies de malezas (Villaseñor y Espinoza, 1998), mientras que en la Comarca Lagunera hay 20 malezas de nueve familias botánicas (Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, 1970; García y Acosta, 1975; Campo Agrícola Experimental La Laguna, 1984; Castro, 1992). Según Villaseñor y Espinoza (1998), hay una flora de 76 especies asociadas al algodón en Coahuila y85 en Durango.

Lo anterior se agudiza ya que el algodón transgénico se cultiva en México desde en 1996 y al existir cruzamientos entre cultivos y plantas silvestres, es posible que las plantas arvenses contengan la proteína CP4 EPSPS. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar si las plantas arvenses de la Comarca Lagunera, asociadas al algodón transgénico contienen la proteína CP4 EPSPS.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio

Este estudio se realizó en la Comarca Lagunera que incluye partes de los estados de Coahuila y Durango. En el estado de Durango, la parcela experimental se ubicó en el municipio de Gómez Palacio, el ejido Gregorio García (25° 45' 51.65" N y 103° 20' 34.68" O); para el estado de Coahuila, la parcela experimental se estableció en el ejido La Fe (25° 49' 1.74" N y 103° 12' 36.25" O) (Figura 1).

Dos hectáreas en cada ejido se cultivaron durante el ciclo agrícola 2011 y se utilizó el genotipo de algodón transgénico Bollgard II^® con resistencia a insectos y tolerante a herbicidas.

La recolecta consistió en tomar un ejemplar de cada una de las especies de plantas presentes en la parcela experimental de algodón transgénico en cada uno de los ejidos de la Comarca Lagunera. Los ejemplares se trasladaron al Laboratorio de Biología Agrícola de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Juárez del Estado de Durango, donde se realizó la identificación botánica usando claves especializadas (Villareal, 1983; Lot y Chiang, 1986; Villaseñor y Espinosa, 1998; Elpel, 2000).

Prueba inmunológica

En cada especie recolectada en la parcela experimental de cada estado, se realizó la prueba para detectar la proteína CP4 EPSPS, y el genotipo de algodón que sirvió como testigo.

La prueba tuvo tres pasos: obtener la muestra del tejido vegetal; aplicar la técnica DAS-ELISA con tiras de flujo lateral con el QuickStix TM Combo Kit for Bollgard ll R / Roundup Ready Rr. Leaff y sedd (EnviroLogix, Portland, ME, USA) usadas por Huang et al. (2007) y Yue et al. (2008); y lectura de los resultados.

Para obtener la muestra de tejido vegetal, se cortó una sección del tejido con el tubo eppendorf, se coloco el tejido entre la boca del tubo eppendorf y el broche de presión. Al cerrarlo el tejido quedó en el tubo eppendorf, y se empujó hacia la parte inferior cónica con un agitador.

La prueba inmunológica consistió en verter 0.5 mL de solución amortiguador a un tubo eppendorf que contenía la muestra, se insertó el agitador en el tubo eppendorf y se maceró el tejido hasta quedar completamente triturado. Después se aplicó la prueba DAS-ELISA con el QuickStix TM Combo Kit for Bollgard ll R / Roundup Ready Rr. Leaff y sedd: introducir la tira que detecta la presencia de la proteína CP4 EPSPS, al tubo eppendorf. La presencia de la proteína CP4 EPSPS en las muestras fue positiva solo si la tira presentara dos franjas reveladas; la primera como testigo de la reacción antígeno — anticuerpo, y la segunda como detección de la proteína CP4 EPSPS.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Listado de plantas arvenses

Las especies de plantas arvenses similares en ambos estados fueron 14; mientras que una y seis especies, respectivamente, para Durango y Coahuila no se encontraron en el otro estado (Cuadro 1 y 2). Las diferencias se deben a la variabilidad espacial y temporal de las comunidades, así como a la labranza, la rotación de cultivos y otras perturbaciones (Booth y Swanton, 2002; Perdomo et al., 2004). Según Dauber et al. (2003), la composición florística está estrechamente correlacionada con las condiciones ambientales, prácticas de cultivo y riqueza florística del entorno, es decir, las características del hábitat son un factor importante que determina la presencia de especies en un sitio.

Cuatro especies de la familia Malvaceae fueron encontradas: Malvastrum coromandelianu, Sphaeralcea angustifolia, Anoda cristata y Sida hederacea; y potencialmente son más susceptibles de presentar flujo génico con algodón CERA (2010).

Detección de la proteína CP4 EPSPS

Las pruebas con las tiras de flujo lateral detectaron la proteína CP4 EPSPS. Ninguna planta arvense fue positiva a la presencia de la proteína CP4 EPSPS, y solo fue positiva a la proteína el algodón transgénico. Esto indicó que aún no se ha presentado flujo de genes entre el algodón y las plantas arvenses, ya que las plantas arvenses no presentan la proteína CP4 EPSPS (Cuadro 1 y 2).

La no detección de la proteína CP4 EPSPS en plantas arvenses de la Comarca Lagunera probablemente se debe a un deficiente transporte de polen por los insectos (Gómez, 2002; Guzmán et al., 2008), o tal vez fue eficiente pero existió incompatibilidad sexual (Center Environmental Risk Assessment, 2010). Otras causas probables son: los dos tipos parentales no son sexualmente compatibles o bien, sus complementos cromosómicos; la no coincidencia entre las especies en cuanto a sus periodos de fertilidad; la descendencia no es fértil o ecológicamente no es apta para las condiciones ambientales en las cuales se encuentran (CERA, 2010; RASM, 2010; Mallory et al., 2015).

CONCLUSIONES

El número de especies vegetales asociadas al algodón fue mayor a las antes reportadas para la Comarca Lagunera; además hubo un número mayor de familias botánicas. La proteína CP4 EPSPS no se detectó en las plantas arvenses, a pesar de la presencia de las cuatro especies de la familia Malvaceae en la Comarca Lagunera.

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