Diversidad y estructura genética de Pinus johannis
Genetic diversity and genetic structure in Pinus johannis
Verónica García-Gómez1, Carlos Ramírez-Herrera1*, Celestino Flores-López2, Javier López-Upton1
1 Colegio de Postgraduados, km 36.5 Carretera México-Texcoco. 56230. Montecillo, Estado de México. *Autor responsable (kmcram@colpos.mx).
]]> 2 Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Calzada Antonio Narro 1923, Buenavista. 25084. Saltillo, Coahuila de Zaragoza.
Recibido: mayo, 2014.
Aprobado: noviembre, 2014.
Resumen
Pinus johannis M.-F. Robert-Passini es un pino piñonero endémico de México que crece en poblaciones pequeñas. El objetivo del presente estudio fue estimar el nivel de la diversidad genética y el grado de diferenciación entre poblaciones en la distribución natural de P. johannis. Se recolectaron estróbilos maduros de 130 árboles de cuatro poblaciones. El genotipo de cada árbol se determinó en una muestra de seis megagametofitos y se analizaron nueve sistemas enzimáticos con 16 loci. En las cuatro poblaciones el número de alelos varió de 31 a 35. El número promedio de alelos por locus fue 2.1 y el porcentaje promedio de loci polimórficos 88. La heterocigosidad promedio fue 0.231, y la heterocigosidad promedio esperada fue 0.245. Un déficit de individuos heterocigóticos (FIS = 0.116 y FIT = 0.176) se encontró en las cuatro poblaciones juntas y en cada una de ellas. La diferenciación genética entre poblaciones fue moderada (FST = 0.062).La diversidad genética en P. johannis fue alta con un nivel moderado de diferenciación entre poblaciones.
Palabras clave: endémico, loci, heterocigosidad, isoenzimas, distancias genéticas.
Abstract
]]> Pinus johannis M.-F. Robert-Passini is an endemic pinion nut pine of Mexico that grows in small populations. The objective of this study was to estimate the level of genetic diversity and degree of differentiation among populations in the natural distribution of P. johannis. Mature strobili were collected from 130 tree of four populations. The genotype of each tree was determined in a sample of six megagametophytes, and nine enzyme systems with 16 loci were analyzed. In the four populations the number of alleles varied from 31 to 35. The average number of alleles per locus was 2.1, and the average percentage of polymorphic loci was 88 %. Average heterozygosity was 0.231, and expected average heterozygosity was 0.245. A deficit of heterozygous individuals (FIS = 0.116 and FIT = 0.176) was found in the four populations together and in each of them. The genetic differentiation among populations was moderate (FST = 0.062).Genetic diversity of P. johannis was high with a moderate level of differentiation among populations.Key words: endemic, loci, heterozygosity, isoenzymes, genetic distance.
Introducción
En México el número reconocido de especies descritas del género Pinus es variable y, por ejemplo, Perry (1991) reportó 54 especies del género Pinus, y Farjon et al. (1997) reconoció solo 43 especies del mismo género. Pinus johannis M.-F. Robert-Passini es una especie endémica de México que crece en poblaciones aisladas en los estados de Zacatecas, Coahuila, Nuevo León, San Luis Potosí y Querétaro a altitudes entre 2400 y 2800 msnm, donde la precipitación promedio anual varía de 300 a 400 mm (Perry, 1991; García y Passini, 1993; Romero et al., 2000). Además esta especie se encuentra enlistada en la categoría de protección especial en la NOM-059-SEMARNAT-2010 (SEMARNAT, 2010).
Los árboles de P. johannis se pueden plantar en las ciudades como árboles ornamentales y en sitios con precipitación baja (Perry, 1991). Los troncos y ramas de este pino se usan en construcciones rurales y como leña. Las semillas, llamadas piñones, se recolectan para consumo humano (Robert, 1978; Perry, 1991). Los bosques formados por P. johannis proveen alimento y hábitat a la fauna local; además, las copas de estos árboles proporcionan sombra a especies herbáceas y arbustivas las cuales tienen más probabilidad de sobrevivir por la mayor disponibilidad de humedad (Romero-Manzanares y García-Moya, 2002).
La información sobre la magnitud y distribución de la diversidad genética entre poblaciones de las especies es fundamental para proponer estrategias de conservación y programas de manejo sustentable a largo plazo (Frankham et al., 2002). En estos programas se deben incluir poblaciones con componentes genéticos representativos y únicos para disminuir problemas relacionados con los efectos de endogamia, exogamia, flujo génico reducido y mutaciones deletéreas que influyen en la habilidad de las especies para su evolución (Frankham et al., 2002). Estos efectos pueden conducir a la extinción de especies que crecen en poblaciones pequeñas y aisladas, y en las cuales se esperaría una diversidad genética baja por la acción de la deriva genética y la endogamia, como puede ser el caso de P. johannis que además tiene pocas poblaciones. Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue estimar el nivel y la distribución de la diversidad genética de cuatro poblaciones P. johannis.
MATERIALES Y MÉTODOS
La semilla utilizada en el presente estudio se recolectó de 130 árboles en cuatro poblaciones de P. johannis localizadas en los estados de Nuevo León, Coahuila y Zacatecas (Cuadro 1; Figura 1). En cada población la distancia mínima entre árboles muestreados fue 30 m, para disminuir la probabilidad de incluir individuos emparentados. Los estróbilos maduros recolectados de cada árbol se colocaron en bolsas de papel identificadas para su transporte al laboratorio de semillas de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN) donde la semilla se benefició. Las semillas llenas se separaron de las vanas por flotación en agua y se colocaron en bolsas de plástico, las cuales se mantuvieron en una cámara fría a -7 °C en el laboratorio del Postgrado en Ciencias Forestales del Colegio de Postgraduados hasta el análisis electroforético.
]]> Seis semillas llenas de cada árbol de P. johannis se acomodaron sobre papel en el interior de cajas de plástico de 21X27 cm, a las cuales se agregó 200 mL de agua potable. Las cajas se taparon y se colocaron en una estufa a 25 °C durante una semana. La testa de cada semilla se rompió antes de que las semillas germinaran para separar el embrión y megagametofito. El embrión de las coníferas es tejido diploide, que hereda los genes de la madre y del padre; mientras que el megagametofito es tejido haploide que solo contiene el genotipo de la madre (Singh et al., 2010). Al analizar seis megagametofitos de un árbol la probabilidad de error en identificar correctamente el genotipo de una madre heterocigótica como homocigótica es igual a 0.03 (Ledig et al., 2000). El megagametofito de cada una de las seis semillas por árbol se colocó en una gradilla de plástico con 96 pozos, previamente etiquetada, y se molió en 50 mL de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M con pH de 7.0 (NFGEL, 2003). Las gradillas con las muestras se almacenaron en un congelador a -20 °C hasta su uso para electroforesis.Las muestras se descongelaron y en cada pozo de la gradilla se introdujeron tiras de papel Whatman No. 5 de 12X1 mm. Las tiras de papel empapadas con la muestra se colocaron en un gel de almidón al 10 %. Seis muestras de Pinus resinosa Aiton, una especie sin diversidad isoenzimática (Fowler y Morris, 1977), se distribuyeron de manera uniforme a lo largo del gel como testigo.
En el presente estudio se analizaron nueve sistemas enzimáticos: diaforasa (DIA, EC 1.6.99.1), isocitrato deshidrogenasa (IDH, EC.1.1.1.41), malato deshidrogenasa (MDH, EC.1.1.1.37), 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-PGD, EC.1.1.44) y shikimato deshidrogenasa (SKD, EC.1.1.1.25) se analizaron con amortiguador para gel y electrodo de ácido cítrico 0.04 M y N-(3-aminopropil)-morfolina 0.068 M, con pH 6.1 (Wendel y Weeden, 1989; NFGEL, 2003). Fosfoglucoisomerasa (PGI, EC.5.3.1.9), enzima málica (ME, EC.1.1.1.40), fosfoglucomutasa (PGM, EC.5.4.2.2) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH, EC 1.1.1.49) se analizaron con amortiguador para gel de L-histidina 0.005 M, con pH 7.0, y amortiguador para electrodo de ácido cítrico 0.410 M, con pH 7.0 (Wendel y Weeden, 1989; NFGEL, 2003).
Los loci se nombraron con la abreviatura del sistema enzimático. Cuando se identificó más de un locus se enumeraron consecutivamente a partir del que se desplazó a mayor distancia en el gel. La numeración de los alelos dentro de cada locus se realizó de acuerdo con el alelo de mayor frecuencia. Cuando solo un alelo se detectó, el locus se clasificó como monomórfico (Hartl y Clark, 2007). Los alelos se determinaron como raros cuando su frecuencia fue menor a 0.05, y como comunes cuando fue igual o mayor a 0.05 (Marshall y Brown, 1975).
El porcentaje de loci polimórficos (P), el número promedio de alelos por locus (A), la heterocigosidad observada (Ho) y la heterocigosidad esperada (He), parámetros que describen la diversidad genética, se estimaron usando el programa POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1997). También se calculó el índice de fijación (F ) (Wright, 1951). La estructura genética se analizó a través de los estadísticos F de Wright (1 — FIT ) = (1 — FIS) (1 — FST) (Wright, 1951), donde FIT es el índice de fijación o coeficiente de endogamia considerando las cuatro poblaciones de P. johannis como una población, FST es el índice de fijación o coeficiente de endogamia dentro de cada una de las poblaciones, y FIS es el índice de fijación o coeficiente de endogamia entre poblaciones (Wright, 1951). El número de migrantes por generación (Nm) se calculó con la ecuación propuesta por Wright (1951): Nm = (1 — FST)/ (4FST). Las distancias genéticas de Nei se calcularon entre las cuatro poblaciones estudiadas de P. johannis (Nei, 1972), y se construyó un dendrograma utilizando el método de agrupamiento de pares no ponderado con promedios aritméticos (UPGMA) (Sneath y Sokal, 1973).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La totalidad de los loci registrados en la población de Salaverna fueron polimórficos, quince loci polimórficos se identificaron en Laguna de Sánchez, mientras que en El Coahuilón fueron trece loci polimórficos de un total de 16 en ambas poblaciones. El menor número de loci polimórficos (12) se registró en La Siberia. La mayoría de los alelos fueron comunes con una frecuencia mayor a 0.05. El número mayor de alelos totales se encontró en Laguna de Sánchez y Salaverna (Cuadro 2). El número menor de alelos raros se encontró en El Coahuilón.
El porcentaje de loci polimórficos de P. johannis varió de 75 a 100 %. Estos valores son altos con respecto a otras especies de pinos que crecen en una distribución restringida; por ejemplo, el porcentaje de loci polimórficos fue 0 en Pinus torreyana Parry ex Carr., una especie que crece en dos poblaciones en California, y 30 % en P. maximartinezii Rzedowski que crece en dos poblaciones del norte de México (Ledig y Conkle, 1983; Ledig et al., 1999). Pinus pinceana, otra especie endémica de la sierra Madre Oriental y que se encuentra en lista como en peligro de extinción, tuvo 57 % de loci polimórficos (Ledig et al., 2001). También el porcentaje de loci polimórficos en P. johannis fue mayor que los encontrados en P. greggii Engelm. (32 %) y P. hartwegii Lindl. (58 %) (Parraguirre et al., 2002; Viveros-Viveros et al., 2010). El porcentaje de loci polimórficos encontrados en P. johannis fue mayor al promedio en otras especies de gimnospermas (71 %) (Hamrick et al., 1992).
La heterocigosidad mayor observada (Ho) y heterocigosidad esperada (He) se encontraron en Salaverna, en el estado de Zacatecas, mientras que la menor heterocigosidad observada y heterocigosidad esperada se observó en La Siberia en el estado de Nuevo León (Cuadro 3). La heterocigosidad esperada en P. johannis fue alta comparada con el promedio de la heterocigosidad esperada reportada para varias especies del género Pinus (Ledig et al., 2001; Parraguirre et al., 2002; Viveros-Viveros et al., 2010); sin embargo, la heterocigosidad esperada en P. johannis fue menor que las reportadas para P. lagunae M. F. Passani (0.386) y P. muricata D. Don (0.346) (Molina-Freaner et al., 2001), aunque debe aclararse que la estimación de la heterocigosidad esperada promedio en estas últimas especies se realizó solamente con base en loci polimórficos. A pesar de que P. johannis crece en poblaciones aisladas y reducidas, los niveles de diversidad encontrados en el presente estudio fueron altos. Lo anterior se puede deber a una posible hibridación histórica o iterativa entre P. johannis y P. cembroides, porque se ha observado un traslapo (o bien, una coincidencia) en la época de maduración de las estructuras reproductivas de ambas especies en algunas áreas donde coexisten (Romero et al., 2000). Además, P. johannis tiene un comportamiento casi dioico donde la mayoría de los estróbilos femeninos y masculinos se producen en individuos diferentes (Flores-Rentería et al., 2011), lo cual puede favorecer un nivel de diversidad alto por el cruzamiento entre árboles diferentes.
El índice de fijación promedio (F) fue positivo en las poblaciones de P. johannis con valores entre 0.020 a 0.277 (Cuadro 3), indicando deficiencia de heterocigotos lo cual es común en poblaciones pequeñas (Hart y Clark, 2007). El valor de F en P. johannis fue ligeramente superior al de 0.116 reportado para P. pinceana (Ledig et al., 2001). El valor de F en P. johannis fue inferior al encontrado en Tsuga canadensis (L.) Carr. (F = 0.443), una conífera con amplia distribución en el este de América del Norte (Potter et al., 2008).
En 10 de 16 loci polimórficos el índice de fijación a nivel población (FIS) presentó valores positivos, lo cual indica deficiencia de heterocigotos para estos loci, mientras los otros seis con valor negativo indican exceso de heterocigotos. El índice de fijación total (FIT ) obtenido indica una deficiencia de individuos heterocigóticos en 13 de los 16 loci polimórficos (Cuadro 4). En otras especies mexicanas del género Pinus los índices de fijación fueron mayores que los encontrados en P. johannis. Por ejemplo, los índices FIs y FIT registrados en este pino fueron menores a los de P. pinceana (FIS = 0.140 y FIT = 0.271) (Ledig et al., 2001). El índice de fijación en P. johannis indicó una deficiencia de heterocigotos menor a la reportada para Abies hickeli Flous et Gausen (FIS = 0.121 , A. guatemalensis Rehder (FIS = 0.235 y FIT = 0.122) y A. religiosa (H.B.K.) Schltdl. et Cham. (FIS = 0.216 y FTT = 0.250), especies que crecen en poblaciones aisladas en áreas montañosas de México (Aguirre-Planter et al., 2000).
La mayoría (93.8 %) de la diversidad genética promedio en P. johannis se encontró dentro de poblaciones y sólo 6.2 % (FST = 0.062) entre poblaciones (Cuadro 4), por lo cual el nivel de diferenciación fue moderado. La diferenciación entre poblaciones de P. johannis fue menor a la reportada entre poblaciones de P. flexilis James (FST = 0.094 ,una especie de amplia distribución en América del Norte (Jørgensen et al., 2002). También, el nivel de diferenciación fue inferior al reportado entre poblaciones de otras especies mexicanas del género Pinus, tales como P. pinceana (FST = 0.152), P. greggii (FST = 0.379) y P. hartwegii (FST = 0.111) (Ledig et al., 2001; Parraguirre et al., 2002; Viveros-Viveros et al., 2010).
En promedio, cuatro migrantes por generación (Nm) se registraron en P. johannis, cantidad mayor a la determinada en P. pinceana (Nm= 1) y P. greggii (Nm = 1) (Ledig et al., 2001; Parraguirre et al., 2002). Al menos un migrante por generación puede evitar la diferenciación de las poblaciones por el efecto de la deriva genética (Hartl y Clark, 2007). El número elevado de migrantes en P. johannis es, con alta probabilidad, una causa del nivel moderado de diferenciación entre las poblaciones de esta especie; sin embargo, el número de migrantes encontrado para esta especie puede reflejar también el flujo génico ocurrido en el pasado y sobreestimar el número de migrantes en la generación presente, como se encontró en Picea mexicana Martínez y Fagus grandifolia Ehrh. subsp. mexicana (Martínez) E. Murray (Ledig et al., 2002; Montiel-Oscura et al., 2013). Probablemente, P. johannis cubrió una mayor superficie en el pasado, al igual que otras especies productoras de piñones del género Pinus (Malusa, 1992), por lo cual la migración entre poblaciones de P. johannis pudo ser mayor que en el presente, lo cual se reflejó en los resultados encontrados en el presente estudio.
La distancia genética promedio entre las cuatro poblaciones de P. johannis fue 0.03, lo cual representa una diferenciación moderada entre poblaciones. Las distancias genéticas entre poblaciones variaron de 0.014 entre La Siberia y El Coahuilón a 0.043 entre La Siberia y Salaverna (Cuadro 5; Figura 2). Valores de distancia genéticas entre 0.018 y 0.150 reflejan una diferenciación moderada entre poblaciones de una especie (Nei, 1978). La diferenciación entre poblaciones es influenciada por el flujo génico entre poblaciones (Hartl y Clark, 2007). Las distancias genéticas entre las poblaciones de P. johannis fueron menores que las distancias que se reportaron para P. pinceana y P. hartwegii, que crecen en localidades aisladas (Ledig et al., 2001; Viveros-Viveros et al., 2010).
]]>CONCLUSIONES
El porcentaje de loci polimórficos, heterocigosidad observada y heterocigosidad esperada indicaron alta diversidad genética en las cuatro poblaciones muestreadas de Pinus johannis, por lo cual la especie posee la diversidad necesaria para poder evolucionar. Los índices de fijación (FIT y FIS) mostraron un déficit de individuos heterocigóticos en P. johannis indicando que el cruzamiento entre individuos emparentados es común. El FST indicó una diferenciación moderada por lo que conservar una de las poblaciones sería suficiente para conservar la mayoría de la diversidad genética; sin embargo, es recomendable conservar las cuatro poblaciones de P. johannis incluidas en el presente estudio.
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