Hongos asociados a pudrición del pedúnculo y muerte descendente del mango (Mangifera indica L.)

Fungi associated to stem-end rot and dieback of mango (Mangifera indica L.)

Maricarmen Sandoval-Sánchez¹, Daniel Nieto-Ángel¹*, J. Sergio Sandoval-Islas¹, Daniel Téliz-Ortiz¹, Mario Orozco-Santos², H. Victoria Silva-Rojas³

¹ Fitosanidad-Fitopatología. *Autor responsable: (dnieto@colpos.mx).

³ Genética y Productividad-Producción de Semillas. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

Recibido: mayo, 2012.
Aprobado: noviembre, 2012.

Resumen

Las pudriciones del pedúnculo de frutos y muerte descendente de ramas de mango (Mangifera indica L.) son asociadas con hongos de la familia Botryosphaeriaceae. Los objetivos de este estudio fueron identificar morfológica y filogenéticamente diferentes cepas de hongos aisladas de frutos con pudrición del pedúnculo y ramas con muerte descendente de los cultivares Ataulfo, Kent y Tommy Atkins, de cinco estados productores de México, y determinar su asociación con ambas enfermedades. Las muestras se recolectaron entre marzo del 2010 y junio del 2011. Los hongos asociados con la pudrición del pedúnculo correspondieron a Lasiodiplodia theobromae y Neofusicoccum parvum, y se detectó también a Neofusicoccum sp.; los hongos asociados con la muerte descendente de ramas correspondieron a L. pseudotheobromae y N. parvum. Se identificó la posible asociación de pudrición del pedúnculo con muerte descendente, ya que los hongos asociados fueron patogénicos al inocularlos en los pedúnculos de frutos de Ataulfo, Kent y Tommy Atkins. Este sería el primer estudio que identifica pudrición del pedúnculo o muerte descendente de ramas de mango en México por L. pseudotheobromae, L. theobromae y N. parvum.

Palabras clave: hongos postcosecha, Lasiodiplodia pseudotheobromae, Lasiodiplodia theobromae, Neofusicoccum parvum, Neofusicoccum sp., Mangifera indica.

Stem-end rot of fruits and dieback of branches in mango (Mangifera indica L.) are associated with fungi of the family Botryosphaeriaceae. The objectives of the present study were to identify morphologically and phylogenetically different strains of fungi isolated from fruits with stem-end rot and branches with dieback of the cultivars Ataulfo, Kent and Tommy Atkins, of five producing states of México, and to determine their association with both diseases. The samples were collected between March of 2010 and June of 2011. The fungi associated with stem-end rot corresponded to Lasiodiplodia theobromae and Neofusicoccum parvum, and Neofusicoccum sp. was also detected; the fungi associated with dieback of branches corresponded to L. pseudotheobromae and N. parvum. The possible association of stem-end rot with dieback was identified, given that the associated fungi were pathogenic when inoculated in the stems of fruits of Ataulfo, Kent and Tommy Atkins. This would be the first study that identifies stem-end rot or dieback in branches of mango in Mexico from L. pseudotheobromae, L. theobromae and N. parvum.

Key words: postharvest fungi, Lasiodiplodia pseudotheobromae, Lasiodiplodia theobromae, Neofusicoccum parvum, Neofusicoccum sp., Mangifera indica.

INTRODUCCIÓN

La pudrición del pedúnculo de frutos de mango (Mangifera indica L.) causa pérdidas severas después de la cosecha y son más importantes durante el almacenamiento prolongado, porque reducen la calidad de los frutos y limitan su comercialización (Johnson et al., 1991). La pudrición es ocasionada por los hongos Dothiorella dominicana Petr. & Cif. (Johnson et al., 1991), Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff. & Maubl. (Johnson et al., 1991; Mirzaee et al., 2002), Neofusicoccum mangiferae (Syd. & P. Syd.) Crous, Slippers & A. J. L. Phillips (Ni et al, 2010), N. parvum (Pennycook & Samuels) Crous, Slippers & A. J. L. Phillips (Costa et al., 2010), Phomopsis mangiferae (Sacc.) Bubák y Pestalotiopsis mangiferae (Henn.) Steyaert (Johnson et al., 1991; Ko et al., 2009). Los desórdenes de declinación que comprenden síntomas como tizón, cancrosis, gomosis y muerte descendente de ramas comparten etiologías similares con las pudriciones del pedúnculo (Khanzada et al., 2004; Javier-Alva et al., 2009). En México no existen reportes que precisen los agentes causales de la pudrición del pedúnculo, ni su asociación con la muerte descendente de ramas que proporcionen información para el manejo de la enfermedad desde la etapa de crecimiento de la planta hasta la época de desarrollo del fruto y cosecha. Los objetivos del presente estudio fueron identificar morfológica y mole-cularmente los hongos aislados de frutos de mango, de las regiones productoras de la Costa del Pacífico, con síntomas de pudrición del pedúnculo y de muerte descendente en ramas y determinar la asociación de ambas patologías.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección de frutos y ramas

De marzo del 2010 a junio del 2011 se recolectaron 110 frutos de los cultivares Ataulfo, Kent y Tommy Atkins con síntomas de pudrición de pedúnculo y muerte descendente en ramas, en huertos de mango en cinco estados productores de la Costa del Pacífico de México. De esos frutos únicamente 58 presentaban síntoma de pudrición de pedúnculo. Las recolectas se hicieron en huertos ubicados en los estados de Colima (Coquimatlán y Tecomán: 16 Tommy Atkins y cuatro Ataulfo), Guerrero (Acapulco de Juárez: siete Tommy Atkins y 13 'Ataulfo), Jalisco (Tomatlán: 10 Tommy Atkins) y Nayarit (Jalcocotán: ocho Kent). Además, se seleccionaron 60 ramas con síntomas de muerte descendente en 10 huertos ubicados en Guerrero (Atoyac de Álvarez y San Jerónimo de Juárez: Tommy Atkins; San Luis de la Loma, Tecpan de Galeana y Zacualpan: Ataulfo) y Michoacán (Nueva Italia: Ataulfo).

Se obtuvieron segmentos de aproximadamente 125 mm³ de la zona de avance de la pudrición en frutos y de la necrosis en ramas. Los tejidos de frutos y ramas se desinfestaron por inmersión en hipoclorito de sodio al 2 % durante 3 min y al 3 % durante 4 min. Se lavaron con agua destilada esterilizada, se secaron con papel filtro esterilizado y se colocaron cuatro trozos por caja petri con medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar (PDA). Las cajas se incubaron bajo luz negra continua y a 25 ±1 °C durante el día. Se realizaron cultivos monospóricos y se transfirieron a cajas petri nuevas con PDA.

Pruebas de patogenicidad y de asociación entre hongos aislados de frutos y ramas

Se inocularon pedúnculos de frutos de mango con los hongos aislados de la pudrición de frutos y de la muerte de ramas para tener evidencia de la etiología de la pudrición del pedúnculo, caracterizar las pudriciones y establecer su posible relación con la muerte descendente. Tres aislados de frutos y cuatro de ramas se seleccionaron, según su prevalencia, localidad, cultivar y procedencia. Se usaron frutos sanos en madurez fisiológica, con tamaño uniforme y sin daños físicos de los tres cultivares, se lavaron con agua jabonosa, se desinfestaron durante 3 min por inmersión en hipoclorito de sodio al 2 % y se enjuagaron con agua destilada esterilizada. Se inocularon cinco frutos por cultivar y se evaluó el porcentaje de frutos que produjeron síntomas con cada uno de los siete aislamientos, para lo cual se observaron diariamente registrando sólo los síntomas y signos externos. Hubo dos tratamientos: 1) bajo condiciones asépticas se realizó una herida de aproximadamente 5 mm de profundidad sobre el pedúnculo de cada fruto, mediante punción con un palillo de madera esterilizado; sobre cada herida se colocó un disco de PDA de 5 mm de diámetro con crecimiento micelial de seis días de edad y se sostuvo con una cinta Parafilm*; hubo frutos testigo con herida y disco de PDA sin inóculo; 2) se realizó el mismo procedimiento, pero sin herida, los frutos se colocaron en charolas de unicel con toallas estériles de papel, humedecidas con agua destilada esterilizada, dentro de bolsas plásticas, a 24 ± 2 °C; los hongos se reaislaron en cultivos puros a partir de los frutos inoculados en cada tratamiento y sus colonias y estructuras reproductivas se compararon con las de los aislamientos inoculados originalmente.

Caracterización morfológica

Se registró el crecimiento micelial, pigmentación y formación de estructuras reproductivas de 10 colonias por aislamiento de los hongos sembrados en cajas petri. Las colonias fueron incubadas bajo luz negra continua a 25 ± 1 °C durante el día. Los aislamientos se identificaron morfológicamente con base en el color, forma de la colonia, crecimiento del micelio, esporulación, forma de conidios y dimensiones. Se usaron las claves y descripciones taxonómicas de Sutton (1980) y Barnett y Hunter (1998) para géneros, de Punithalingam (1976), Burgess et al. (2006) y Alves et al. (2008) para especies de Lasiodiplodia y de Pennycook y Samuels (1985) y Crous et al. (2006) para especies de Neofusicoccum. Las cepas identificadas se conservaron en tubos de ensaye con aceite mineral esterilizado para estudios posteriores.

Identificación molecular y análisis filogenético

El ADN se extrajo de cultivos monoconidiales crecidos en medio PDA, con la metodología descrita por Ahrens y Seemüller (1992). La calidad del ADN se verificó mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1 % (Ultrapure, Gibco, USA) y las bandas se visualizaron en un transiluminador (Gel Doc 2000, BIO RAD*, USA). La concentración de ADN se cuantificó con un espectrofotómetro Lambda BIO 10 (Perkin Elmer*), diluciones con 20 ng se usaron para la amplificación de los espaciadores transcritos internos ITS1 e ITS2, y el gen 5.8S ribosomal, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la combinación de los iniciadores universales ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC) e ITS5 (5'-GGAAGTA-AAAGTCGTAACAAGG).

El producto amplificado se purificó con el kit Wizard (Promega*, USA) y se secuenció con el Genetic Analyzer modelo 3730XL* (Applied Biosystem*, USA). Las secuencias consenso se ensamblaron, editaron con la opción CAP (Contig Assembly Program) del Software BioEdit v7.0.9.1 (Hall, 1999) y depositaron en el GenBank (NCBI, 2012). Para los análisis evolutivos, todas las secuencias consenso fueron alineadas con el ClustalW 1.8.1 (Thompson et al., 1994) incluido en el Software MEGA 4.0.2 (Tamura et al., 2007). Las reconstrucciones filogenéticas se realizaron para los conjuntos de datos de la región ITS1-5.8S-ITS2 con el método de máxima parsimonia. Este análisis se efectuó mediante el Close Neighbour Interchange (CNI), opción de búsqueda (nivel=1) con el árbol inicial por adición al azar (10 repeticiones), y los espacios o datos faltantes fueron considerados deleciones completas. Para conocer los valores de confianza para los clados del árbol, se realizó un análisis bootstrap con 1000 repeticiones (Felsenstein, 1985). Las secuencias de L. pseudotheobromae (no. de acceso EU101311, Namibia), L. theobromae (no. de acceso FJ150695, USA), N. parvum (no. de acceso EU080926, Uruguay), Neofusicoccum sp. (no. de acceso FJ900608, Camerún) y P. theae (no. de acceso HQ832793, China), depositadas en la base de datos del GenBank, fueron seleccionadas para incluirlas como especies de referencia junto con las obtenidas en este estudio. Phaeomoniella capensis (no. de acceso FJ372391) se designó como la especie fuera de grupo para la construcción del árbol evolutivo.

Descripción de síntomas de frutos y ramas recolectados

La pudrición en frutos, color café claro a oscuro, se originó alrededor del pedúnculo y se extendió a lo largo de él con márgenes ondulados. En los árboles muestreados se observaron ramas con secamiento descendente que iniciaba en el ápice y avanzaba hacia la base de la rama, contrastaban con ramas de aspecto normal, y mostraban haces vasculares necrosados y exudados gomosos rojizos. En un estado avanzado de muerte descendente, los árboles exhibían secamiento con defoliación parcial y ramas con hojas secas y verdes.

Frecuencias de aislamientos

De los frutos recolectados se aislaron Colletotrichum sp., L. theobromae, N. parvum, Neofusicoccum sp. y Pestalotiopsis sp. y de las ramas L. pseudotheobromae, N. parvum, Pestalotiopsis sp., P. theae y Phomopsis sp. (Cuadro 1).

Pruebas de asociación entre hongos aislados de frutos y ramas

Los siete aislamientos utilizados en las pruebas de asociación se nombraron según el hospedante (fruto o rama), especie de hongo y lugar de procedencia: FLaGr (Fruto Lasiodiplodia Guerrero), RLaGr (Rama Lasiodiplodia Guerrero), RLaMi (Rama Lasiodiplodia Michoacán), FNeJa (Fruto, Neofusicoccum Jalisco), FNeNa (Fruto Neofusicoccum Nayarit, RNeMi (Rama, Neofusicoccum Michoacán) y RPeMi (Rama Pestalotiopsis Michoacán). En todos los frutos del cultivar Ataulfo inoculados con los aislamientos de Lasiodiplodia y Neofusicoccum del tratamiento con herida, se observaron síntomas iniciales de pudrición del pedúnculo 7 d después de la inoculación (ddi). Los síntomas con ambos hongos fueron similares y consistieron de manchas negras, con crecimiento de micelio, alrededor de la base del pedúnculo. Luego de 10 ddi se observaron lesiones difusas, hundidas y húmedas, originadas en el pedúnculo, con forma de proyecciones radiales, las cuales oscurecieron rápidamente, coalescieron y presentaron márgenes negros ondulados; y 14 ddi las manchas oscuras se habían extendido a lo largo de la curvatura cóncava o convexa del fruto. También se observó micelio sobre la epidermis o emergente a través de rupturas de ella y un exudado acuoso, café que salía de las lenticelas o del pedúnculo. La pudrición total de los frutos ocurrió 20 ddi. El aislamiento RPeMi 20 ddi, sólo ocasionó una mancha negra limitada alrededor del pedúnculo y desarrolló crecimiento de micelio. En el tratamiento sin herida se registraron los mismos síntomas, aunque fueron visibles 9 ddi. En todos los frutos de los cultivares Kent y Tommy Atkins inoculados, se registraron los mismos síntomas con los aislamientos de Lasiodiplodia y Neofusicoccum; 5 ddi se apreciaron manchas radiales, alargadas, delgadas y oscuras originadas en el pedúnculo, que coalescieron 7 ddi tornándose amarillentas, hundidas y húmedas y formando márgenes negros ondulados. La pudrición total de los frutos ocurrió 10 ddi. No se observaron síntomas con RPeMi. Los frutos testigo no desarrollaron síntomas (Figura 1 A-F).

Caracterización morfológica

Las colonias de Lasiodiplodia spp. desarrollaron inicialmente (1 a 3 d) micelio algodonoso color blanco-grisáceo, con crecimiento aéreo, rápido y abundante; posteriormente, cambió a gris oliváceo, denso en el centro de la caja con color gris oscuro. Desde los 15 d se apreciaron conidiomas picnidiales producidos en estroma, semi-inmersos, dispersos, simples o compuestos y en agregados; picnidios negros, piriformes y ostiolados; también, conidióforos hialinos, cilíndricos, simples, septados o aseptados, que nacían de la pared interior de células que recubrían la cavidad picnidial y paráfisis hialinos, cilíndricos y aseptados. Lasiodiplodia theobromae mostró conidios inmaduros sin septos (amerosporas) hialinos, subovoides a elipsoidales, con pared gruesa y citoplasma granulado, de 20 a 31.02 x 11.36 a 16.36 µm (25.53 x 13.16 µm, promedio de 100 conidios). Los conidios maduros presentaron un septo (didimosporas) de color café oscuro, elipsoidales a ovoides, con estriaciones longitudinales irregulares de 19.44 a 28.86 × 11.25 a 15.91 µm (24.32 x 12.27 μm, promedio de 100 conidios).

En contraste con L. theobromae, L. pseudotheobromae produjo conidios más grandes y elipsoidales, con el ápice y base redondeados, más amplios en el centro y maduros midieron 23.82 a 31.57 x 13.89 a 17.44 µm (26.17 x 16.23 µm, promedio de 100 conidios). Las colonias de N. parvum desarrollaron micelio algodonoso, blanco-grisáceo y abundante al inicio (1 a 3 d) y se tornó gris oscuro después, más denso en el centro de la caja. La formación de conidiomas picnidiales se observó desde los 13 d: uni o multiloculares, individuales o constituidos en estroma, picnidios globosos, piriformes con una papila corta y aguda, y ostiolados; además: conidióforos reducidos a células conidiogénicas, hialinas, holoblásticas, que formaron conidios en sus extremos y surgían de la pared interior del lóculo y recubriéndolo; también, conidios fusiformes a elipsoidales con ápice subobtuso y base truncada, lisos o gutulados, de paredes delgadas, hialinos y unicelulares, que midieron 21.77 a 26.99 x 5.18 a 8.55 μm (24.92 x 7.09 μm, promedio de 150 conidios), y microconidios hialinos, lisos, en forma de barra y truncados en los extremos (Figura 2 A-H).

Con las amplificaciones, con los primers ITS5 e ITS4, se obtuvieron fragmentos de 500, 540 y 570 pares de bases (bp) aproximadamente. Los resultados del BLASTN confirmaron que los aislamientos FNeJa, FNeNa y RNeMi correspondieron a N. parvum, el aislamiento FLaGr a L. theobromae (números de acceso GenBank JQ619648, JQ619649, JQ619650, JQ619651) y la región ITS reveló identidades de nucleótidos de las secuencias de 100 %. También, los aislamientos RLaGr y RLaMi se asemejaron 100 % a L. pseudotheobromae, y el aislamiento RPeMi 99 % a Pestalotiopsis theae (números de acceso JQ619644, JQ619645, JQ619652). Las secuencias de los otros dos aislamientos no evaluados en las pruebas de patogenicidad, presentaron 99 % de identidad de sus nucleótidos con Neofusicoccum sp. (JQ619646, JQ619647). Los aislamientos evaluados se separaron en cinco clados con el método de máxima parsimonia y fueron denominados Lp para L. pseudotheobromae, Lt para L. theobromae, Np para N. parvum, Nsp para Neofusicoccum sp. y Pt para P.theae (Figura 3).

DISCUSIÓN

La pudrición del pedúnculo se reporta como una enfermedad de la postcosecha en las regiones productoras de mango alrededor del mundo, y su etiología es imprecisa (Slippers et al., 2005). En esta investigación, las poblaciones de patógenos de los estados de Colima, Guerrero, Jalisco, Michoacán y Nayarit fueron identificadas para decidir los hongos involucrados en los síntomas de pudrición del pedúnculo en frutos de mango y reconocer la posible asociación de la muerte descendente con la pudrición del pedúnculo. El estudio es la primera exploración de especies de la familia Botryosphaeriaceae donde la pudrición del pedúnculo es asociada con la muerte descendente de mango en México.

Las especies L. theobromae, N. mangiferum y N. parvum de la familia Botryosphaeriaceae se asocian comúnmente con enfermedades en las regiones productoras de mango en el mundo, principalmente desórdenes de declinación de árboles y pudriciones del pedúnculo (Sakalidis et al., 2011). De frutos de los tres cultivares con pudrición del pedúnculo, se aisló a L. theobromae y N. parvum, y de ramas de Ataulfo y Tommy Atkins con muerte descendente, se aisló a N. parvum y L. pseudotheobromae. Aunque las especies aisladas en este estudio muestran algunas variaciones en características morfológicas de otros estudios (Pennycook y Samuels, 1985; Burgess et al. , 2006; Alves et al., 2008), la amplificación con iniciadores universales que amplifican secuencias ribosomales, reveló un nivel elevado de concordancia en la identificación taxonómica. En aislamientos de la misma especie no se observó diversidad genética. El árbol consenso (Figura 3) mostró la identidad de nucléotidos de las secuencias del estudio con las de Camerún, China, Namibia, Uruguay y USA (Marincowitz, et al., 2008; Begoude et al., 2010; Perez et al., 2010).

Lasiodiplodia pseudotheobromae fue reclasificada por Alves et al. (2008) como especie críptica de L. theobromae y la consideraron especie nueva. Desde entonces se ha reconocido en hospedantes con importancia comercial, como Citrus spp., Coffea sp., Mangifera spp. y Rosa sp. (Zhao et al., 2010). Hasta ahora no había reportes de su presencia en México.

Los aislamientos identificados como Neofusicoccum sp. (procedentes de Nayarit) revelaron que este género presenta un evento de especiación, ya que al no definirse la especie, posiblemente N. parvum u otra especie del mismo género, está cambiando. La comparación de los aislamientos de Neofusicoccum sp. de este estudio con la base de datos del BLASTN, mostraron la secuencia Neofusicoccum sp. CMW28320 de Camerún como la más cercana a ellos. Neofusicoccum sp. se reporta causando daños en Persea americana (McDonald y Eskalen, 2011), Vaccinium corymbosum (Espinoza et al., 2009) y Vitis vinifera (Urbez-Torres et al., 2010).

Similar a lo señalado por Costa et al. (2010), N. parvum fue aislado de los cultivares Tommy Atkins y Kent y L. theobromae fue aislado sólo de Tommy Atkins y Ataulfo. Las diferencias de las especies de hongos en mango pueden deberse a las condiciones climáticas, la eficacia de medidas cuarentenarias, la proximidad a los endófitos que dominan la vegetación nativa (Sakalidis et al., 2011) y especificidad hacia cultivares particulares de mango.

La patogenicidad de los hongos aislados de frutos se mostró al reproducir los síntomas en frutos inoculados artificialmente y al reaislarlos. Pestalotiopsis sp. y Phomopsis sp. fueron inoculadas para comparar los síntomas reportados por Jhonson et al. (1991) y Ko, (2009) y sí coincidieron. La infección cruzada en frutos, con los aislamientos de L. pseudotheobromae y N. parvum obtenidos de ramas con muerte descendente, permitió establecer una posible asociación con pudrición del pedúnculo, ya que todos los aislamientos fueron patogénicos en los tres cultivares y produjeron síntomas similares a los de los aislamientos de frutos. Estudios de patogenicidad en ramas son necesarios para confirmar la asociación obtenida aquí y si N. parvum causa muerte regresiva de árboles de mango, pues esta enfermedad comúnmente se atribuye L. theobromae. La vía de infección de hongos patógenos debe conocerse para seleccionar prácticas de manejo que reduzcan el inóculo e infección en los hospedantes. Las especies de la familia Botryosphaeriaceae pueden infectar a las plantas a través de colonización endofítica por heridas o semillas (Slippers y Wingfield, 2007; Sakalidis et al. 2011). La información de las fuentes de inóculo, modo y tiempo de infección y respuesta de los patógenos en la postcosecha a las temperaturas de almacenamiento puede contribuir en el control de esas patologías.

CONCLUSIONES

Los hongos asociados con la pudrición del pedúnculo de frutos de mango, en los estados de la Costa del Pacífico de México, corresponden a L. theobromae y N. parvum, y se detectó a Neofusicoccum sp. Los asociados con la muerte descendente de ramas corresponden a L. pseudotheobromae y N. parvum. Se evidenció una posible asociación de pudrición del pedúnculo con muerte descendente, ya que todos los aislamientos de L. pseudotheobromae y N. parvum, obtenidos de ramas con muerte descendente al inocularlos en pedúnculos de frutos de Ataulfo, Kent y Tommy Atkins fueron patogénicos.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al M. C. Juan Manuel Tovar Pedraza, M. C. Luis Alfonso Aguilar Pérez (Fitopatología, Colegio de Postgraduados) y al Ing. Jesús Orozco Santos (CESAVENAY) por su apoyo en la recoleccción de material vegetal. Al Colegio de Postgraduados por el financiamiento otorgado con el Fideicomiso revocable de administración e inversión Núm. 167304 para el establecimiento y operación de los fondos para la investigación científica y desarrollo tecnológico.

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