Enzimas fibrolíticas producidas por fermentación en estado sólido para mejorar los ensilajes de caña de azúcar

Fibrolytic enzymes produced by solid–state fermentation to improve sugar cane silage

Armando Peláez–Acero¹, Marcos Meneses–Mayo^2,3*, L. Alberto Miranda–Romero⁴, Maricela Ayala–Martínez¹, M. Magdalena Crosby–Galván², Octavio Loera–Corral⁵, M. Dolores Megías–Rivas⁶

¹ Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Instituto de Ciencias Agropecuarias, Area Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Rancho Universitario Avenida Universidad Km 1 Ex–Hacienda de Aquetzalpa, 43600, Tulancingo, Estado de Hidalgo.

³ Facultad de Ciencias de la Salud (Nutrición), Universidad Anáhuac México–Norte, Avenida Universidad Anáhuac Número 46, Colonia Lomas Anáhuac, 52786. Huixquilucan, Estado de México. *Autor responsable: mmayo@colpos.mx.

⁴ Zootecnia, Universidad Autónoma Chapingo. 56235. Chapingo, Estado de México.

⁵ Departamento de Biotecnología, Universidad Autónoma Metropolitana. 09340. Iztapalapa, México, D.F.

⁶ Universidad de Murcia, Departamento de Producción Animal, Facultad de Veterinaria, Campus de Espinardo, Murcia, España, 30071.

Recibido: julio, 2010.
Aprobado: mayo, 2011.

Resumen

Palabras clave: Pleurotus sapidus, celulasas, lacasas, xilanasas, digestibilidad de la fibra.

Abstract

Grasses and forages are the principal food source for bovines in the tropic, but forage production varies in quality and quantity throughout the yeat, ditectly affecting cattle productivity. An alternative in dry seasons is the use of sugar cane (SC), howevet it has both low digestibility (20 %) and ptotein (2.5 to 4.5 %), and also a mineral imbalance. The objective of the ptesent study was to evaluate the use of whole SC in a biotechnological ptocess of solid state fetmentation (SSF) with a white tot fungus (Pleurotus sapidus). An evaluation was made of the chemical composition of the SSF on day 0 (CF–0) and 15 (CF–15) and the values of IVDMD, TP, NDF and ADF wete: 1) fot CF–0, 59.17, 2.53, 50.18 and 31.80 %; 2) fot CF–15, 65.08, 6.23, 74.24 and 60.84 %. The enzymatic activity of cellulases, xylanases and laccases was evaluated only for CF–15: 1.96, 2.08 and 5.25 IU g^–1 DM. The whole SC silage included 0, 10 and 20 % of CF–15 and changes wete evaluated in its chemical composition at 0, 8 and 16 d of silage. At 16 d the silage ptesented pH 4.2 and increase (p≤0.05) of lactic acid, acetic acid and NH₃–N; in the treatment with 20 % CF–15 thete was higher (p≤0.05) IVDMD (69.19 %) and maximum volume of in vitro gas production (207.09 mL mg^–1 DM). The analysis of the results suggests that solid ferments can be included with P. sapidus to improve the IVDMD and the fermentative vatiables of whole SC silage.

Key words: Pleurotus sapidus, cellulases, laccases, xylanases, fiber digestibility.

INTRODUCCIÓN

La caña de azúcar (CA) es un recurso forrajero abundante en el trópico mexicano y su inconveniente principal es el contenido escaso de proteína y la digestibilidad baja de la fibra debido a que sus paredes celulares tienen un alto contenido de hemicelulosa, celulosa y lignina (Cano et al., 2003). Por tanto, se usan tratamientos físicos, químicos y biológicos o sus combinaciones para reducir la fibra, particularmente el complejo lignocelulósico (Fahey et al., 1993). Los tratamientos biológicos con hongos de la pudrición blanca tienen grandes ventajas, por sus enzimas fibrolíticas (extractos fibrolíticos) obtenidas por técnicas biotecnológicas como fermentación líquida y en estado sólido, y han contribuido a la predigestión de la fracción fibrosa de diversos forrajes y subproductos. Para estos tratamientos se considera el tipo de forraje, dosis, dieta, presentación del producto (líquido o sólido) y su incorporación al sustrato de interés (Jale et. al., 1999; McAllister et. al., 1999; Cuervo et. al., 2009). Entre las enzimas que producen estos hongos de pudrición blanca están celulasas (E.C.3.2.1.4), lacasas (E.C.1.1.0.3.2) y xilanasas (E.C.3.2.1.8), que participan en la ruptura de compuestos polifenólicos, enlaces glucosídicos b–1,4 en polisacáridos como la celulosa y hemicelulosa de la pared celular unidos a lignina. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la inclusión de diferentes porcentajes de fermentado en estado sólido, a base de caña de azúcar, y el hongo Pleurotus sapidus en ensilados de CA integral.

Material biológico

Forraje

Se usó CA integral (hojas, tallo y cogollo) variedad MEX 79–431, de un año de edad, recolectada de una parcela en el Municipio de Ciudad de Ayala, Morelos, México, ubicado a 18° 46' 0" N y 98° 59' 0" O y a 1400 m de altitud; con clima cálido subhúmedo, precipitación y temperatura promedio anual de 800 mm y 24 °C. La CA se cortó a un tamaño de partícula de 1.5 a 2.5 cm con una picadora de cuchillas con motor a gasolina de / HP (marca Azteca, México).

Fermentado en estado sólido CF–0 y CF–15

El fermentado en estado sólido (FES) CF–0 y CF–15 se obtuvo usando 9.200 kg de CA integral oreada 48 h, con volteos cada 8 h, y se mezclaron con 800 g de micelio activado con P. sapidus (CF–0) obtenido de la empresa Prodicet (México). El FES se almacenó en bolsas cerradas de plástico, transparentes, calibre 7, con perforaciones (1 cm), que se mantuvieron a la sombra por 0 (para CF–0) y 15 d (para CF–15) a 28 °C.

Análisis químicos de CF–0 y CF–15

En CF–0 y CF–15 se evaluó materia seca (MS) y proteína total (PT) según AOAC (1995), fibra detergente neutro (FDN) y ácido (FDA), hemicelulosa (HMCE) de acuerdo con Van Soest et. al. (1991) y digestibilidad in vitro de la MS (DIVMS) con el método de Menke et al. (1979).

Extracto enzimático del CF–15

Durante 20 min se maceraron 30 g de CF–15 en un mortero con 45 mL de amortiguador de citrato pH 5.3 y 50 mM, se prensó manualmente y filtró a través de gasa (Ayala et al., 2011). El líquido resultante se centrifugó 20 min (10 000 rpm) a 4 °C, para obtener el extracto enzimático (líquido sobrenadante).

La proteína soluble se midió con el método de Bradford (1976). El estándar fue seroalbumina bovina 0.15 M (SIGMA) disuelta en amortiguador de citrato 50 mM y pH 5.3, la mezcla de reacción fue 800 mL de extracto enzimático y 200 mL de reactivo de Bradford (Bio–Rad). Se agitó vigorosamente en vórtex y después de 5 min se leyó a l 595 nm en un espectrofotómetro (Perkin Elmer UV/VIS, USA).

La actividad enzimática de celulasas y xilanasas se midió con el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) para azúcares reductores (Miller, 1959). En el método para celulasas, modificado por Márquez et al. (2007) y Ayala et al. (2011), se usó como sustrato carboximetilcelulosa (CMC, viscosidad media; Sigma–Aldrich C4888) al 0.5 % en amortiguador de citrato 50 mM y pH 4.8. Para xilanasas, según la técnica modificada por Loera y Córdova (2003), se usó como sustrato xilano de avena (Sigma X–0627) a 0.5 % en amortiguador de citrato 50 mM y pH 5.3. La lectura se realizó a l 540 nm con un espectrofotómetro (Perkin Elmer UV/VIS, USA). La actividad enzimática se reportó como unidades internacionales (UI) y una UI es la cantidad de enzima que produce un 1 µ mol de azúcares reductores (xilosa o glucosa) por min en las condiciones de la reacción.

La actividad de lacasas se determinó según Bourbonnais et al. (1997) con 2, 2' azino–bis 3–etilbenzo–tiazolin–6–ácido sulfónico (ABTS) como sustrato (0.1 M) en amortiguador de citrato 50 mM y pH 5.3, con una extinción molar de 36 000 M^–1 cm^–1. Las mediciones se realizaron cada 30 s por 5 min a l 420 nm con un espectrofotómetro (Perkin Elmer UV/VIS, USA), definiendo UI como la cantidad de enzima producida por 1 µ mol de substrato oxidado por minuto de reacción.

Ensilaje

El material para ensilar (CAM) consistió de la mezcla de 44 kg de CA integral (tamaño de partícula 2.5 cm), 5 kg de maíz molido, 0.73 kg de urea, 0.26 kg de sales minerales para bovinos (Minelap, phos, LAPISA) y 0.02 kg de sulfato de amonio (Gómez et al., 2011). Para obtener los tratamientos (cuatro repeticiones) se incluyó al CAM 0, 10 y 20 % de CF–15, conservándolos 0, 8 y 16 d en microsilos (1 kg) de bolsa de plástico polietileno negro (calibre 5). La mezcla se compactó y la bolsa se selló herméticamente, y conservó entre 25 a 28 °C. Así, los tratamientos fueron: CAM–0 % d0 (día 0), CAM–10 % d0, CAM–20 % d0; CAM–0 % d8 (día 8), CAM–10 % d8, CAM–20 % d8; CAM–0 % d16 (día 16), CAM–10 % d16, y CAM–20 % d16.

Análisis químicos de los ensilados

Se evaluó FDN, FDA, HMCE (Van Soest et al, 1991), PT y MS (AOAC, 1995), carbohidratos solubles (Dubois et al, 1956), ácido láctico (Tejada, 1985), ácido acético (Erwin et al., 1961), nitrógeno amoniacal (McCullough, 1967), y pH con potenciómetro (modelo 10 Fisher Scientific, USA) (AOAC, 1995).

Volumen máximo de producción de gas (Vmax; mL g^–1 MS)

Los ensilados y CF–15 se deshidrataron y molieron (2 mm). De cada tratamiento se colocó 0.5 g en un frasco de vidrio ámbar y se agregaron 90 mL de inóculo ruminal con flujo continuo de CO₂. Se usó líquido ruminal de dos novillos canulados, adaptados a una dieta con 60 % de CA integral y 40 % de concentrado comercial para bovinos (18 % PT). Los frascos se cerraron herméticamente y se colocaron en baño maría a 39 °C (Theodorou et al., 1994). Las variables fueron: 1) presión de gas a 0, 1, 2.5, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 24, 28, 34, 40, 46, 54, 62 y 72 h de incubación; 2) DIVMS (Menke et al, 1979) a las 72 h. El líquido ruminal fermentado de cada frasco se filtró con papel Whatman # 54 y se deshidrató (60 °C, 24 h) en una estufa de aire forzado. Para calcular el volumen máximo de producción de gas (Vmax; mL g^–1 MS) se usó el modelo logístico VA=Vmax / (1+exp (2–4*s*(t–L)) descrito por Schofield y Pell (1995), donde: VA = volumen de gas producido al tiempo t, Vmax= volumen máximo de gas producido, s= tasa de producción de gas, t= tiempo, y L= tiempo de retardo. Los valores de presión de gas (kg cm^–2) se transformaron a volumen de gas (mL g^–1 MS) con un modelo de regresión lineal.

Para el FES con CF–0 y CF–15 el diseño experimental fue completamente al azar, con cuatro repeticiones por tratamiento y se analizaron con el procedimiento GLM (SAS, 2000), y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). El modelo estadístico fue:

donde, Y_ij = variable de respuesta en el i–ésimo tratamiento (CF0, CF–15) y j–ésima repetición (1, 2, 3 y 4), µ = media general, τ_i =efecto del i–ésimo tratamiento, ε_ij = error aleatorio.

Para los ensilados el diseño experimental fue de parcelas divididas (Kuehl, 2001), con el siguiente modelo estadístico:

donde, Y_ijk= variable de respuesta; µ= media general; α = efecto del porcentaje de inclusión de CF–15, _i = 0, 10 y 20 %; d_ik = error asociado al porcentaje de inclusión de CF–15; β = efecto del día de ensilaje; g_ij = error asociado al día de ensilaje; αβ_ij = interacción de la inclusión de CF–15 y del día de ensilaje; ε_ijk= error general, siendo _k= 1, 2, 3 y 4. El análisis de varianza se realizó con el procedimiento GLM (SAS, 2000) y la comparación de medias con la prueba de Tukey (p≤0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El contenido de humedad de la CA integral disminuyó de 84.74 a 75.99 % después de 48 h de aireación, obteniendo un nivel óptimo para una buena fermentación en estado sólido. Preston et al. (1976) y Pedroso et al. (2008) indican que es importante reducir la humedad a < 80 % para optimizar las condiciones de FES y el crecimiento microbiano. La PT aumentó (p≤0.05) más de 3 % de CF–0 a CF–15 (Cuadro 1), lo cual se atribuye a la proteína microbiana y enzimas obtenidas del FES (Rajarathnam, 1979; Nair, 1989; Shashirekha et al., 2005). La FDN y FDA aumentaron (p≤0.05) de 50.18, y 31.80 % en CF–0 a 74.24 y 60.84 % en CF–15, debido a la síntesis de ácidos orgánicos y consumo de carbohidratos solubles por el hongo durante la FES. La hemicelulosa disminuyó (p≤ 0.05) 5 % de CF–0 a CF–15, debido a la acción de las xilanasas durante el proceso de fermentación (Schmidt et al., 2007). La DIVMS fue mayor (p≤0.05) en CF–15 que en CF–0 lo cual se puede atribuir a la acción de enzimas fibrolíticas y de lacasas producidas por el hongo (Márquez et al., 2007).

Las actividades enzimáticas en CF–15 fueron 2.08±0.37 para xilanasas, 5.25±0.56 para lacasas y 1.98 ±0.13 UI g^–1 MS para celulasas. Lo anterior difiere de lo observado en bagazo de caña de azúcar y Pleurotus ostreatus IE8 en FES de 14 d, de 27.41 para xilanasas, 15.54 para lacasas y 0.96 UI g^–1 MS para celulasas (Márquez et al., 2007), así como 20 para xilanasas, 0.06 para lacasas y 0.15 UI g^–1 MS para celulasas, en P. ostreatus IE8 y bagazo de CA en FES de 15 d (Membrillo et al, 2011). Las actividades enzimáticas en esta investigación con CA integral y P. sapidus con 15 d de fermentación fueron menores para xilanasas, lacasas y mayores para celulasas por la especie de hongo; el sustrato contenía menor cantidad de materia seca (35.36 %) y no se realizó un pre–tratamiento de pasteurización o esterilización. Esta última es una actividad común para el desarrollo óptimo del micelio del hongo (Gusakov y Sinitsyn, 1992; Sánchez, 2004).

En los ensilados la producción de NH₃–N y ácidos orgánicos (acético y láctico) fue mayor (p≤0.05) al disminuir el porcentaje de inclusión de CF–15, lo que reflejó mayor contenido de carbohidratos solubles. En cambio al incrementar (p≤0.05) los días de ensilaje disminuyeron los carbohidratos solubles y aumentaron el NH₃–N, ácido láctico y acético. La interacción porcentaje de inclusión y días de ensilaje fue significativa (p<0.05), y el ensilaje de mejor calidad se obtuvo con pH 4.4, 3.2 % de carbohidratos solubles, 16.36 % de ácido láctico, 14.53 % de ácido acético y 6.15 % de NH₃–N (Cuadro 2). Estos datos son congruentes con los modelos de ensilaje con consumo de carbohidratos solubles y producción de ácidos orgánicos (Cañeque y Sancha, 1998) y procesos químico–biológicos por acción de las enzimas de la planta y microorganismos lácticos, que disminuyen el pH y estabilizan el producto ensilado (Schmith et al., 2007). Los resultados del presente estudio son similares a los de Alcántara et al. (1989) y Pedroso et al. (2008) con ensilados de CA y diferentes aditivos (NaOH y cultivos bacterianos).

Al incrementar (p≤0.05) el porcentaje de inclusión CF–15, el contenido de FDN y FDA disminuyó y la hemicelulosa aumentó (Cuadro 3). La interacción porcentaje de inclusión y días de ensilaje fue significativa (p≤0.05) obteniendo un ensilaje con 20 % de CF–15 a 16 d con mayor FDN, FDA, hemicelulosa y proteína. Estos resultados son similares a los de Pedroso et al. (2005), en los que la variación de FDN y FDA en el período de ensilaje está relacionada con los cambios en azúcares solubles. Similarmente en el tratamiento con 20 % de inclusión a 16 d de ensilaje mostró (Cuadro 2) una considerable disminución de los carbohidratos solubles, y un incremento de ácidos orgánicos, principalmente ácido láctico, lo cual disminuye el pH y estabilizar el ensilado.

La DIVMS a las 72 h (Figura 1) fue 69.1 % en el tratamiento con 20 % de inclusión de CF–15 y 16 d de ensilaje. Este fue el mayor (p≤0.05) valor debido a que las enzimas fibrolíticas y lacasas de P. sapidus afectaron la pared celular (FDN y FDA) durante la fermentación en estado sólido y coadyuvó en el proceso de ensilaje (Cuadro 2). Estos resultados son similares a los reportados por Dean et al. (2005) al incorporar enzimas fibrolíticas (celulasas y hemicelulasas) en ensilajes de pasto bermuda (Cynodon dactylon) y a los observados por Magaña et al. (2009) quienes señalan que la DIVMS de caña de azúcar aumenta después de 30 d de ensilaje.

Durante la fermentación in vitro el mayor valor (p≤0.05) de Vmax (Figura 2) se obtuvo en el día 16, con 10 y 20 % de CF–15 (203.92 y 207.09 mL 500 g^–1 MS), lo cual se puede atribuir a la acción de las enzimas producidas durante la FES en el producto CF–15, ácidos orgánicos liberados durante el ensilaje (bacterias lácticas) y flora microbiana ruminal que promovieron una mayor disponibilidad de carbohidratos estructurales y solubles de la pared celular (Cuadro 2) del material ensilado. Lo anterior indica que el ensilaje y la adición del fermentado mejoran la disponibilidad de los componentes nutritivos existiendo un efecto benéfico en los microorganismos ruminales cuando son incorporados en la alimentación de rumiantes (Wallace et al., 2001).

En general las características organolépticas (color verde claro y aroma agradable de fruta madura) de todos los ensilados con CF–15 correspondieron a lo descrito por Cañeque y Sancha, (1998) como ensilados de forrajes de buena calidad.

CONCLUSIONES

AGRADECIMIENTOS

Este proyecto fue financiado por la línea 7 de inocuidad, calidad de alimentos y bioseguridad, del Colegio de Postgraduados.

LITERATURA CITADA

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